We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.
Cliquez sur chimies ont été étudiés pour une utilisation dans de nombreuses applications de biomatériaux, y compris la délivrance de médicaments, l'ingénierie tissulaire, et de la culture cellulaire. En particulier, la lumière médiée par clic des réactions telles que des réactions de thiol-ène et thiol-yne photoamorcées, les moyens de contrôle spatiotemporel sur les propriétés des matériaux et de permettre la conception de systèmes avec un degré élevé de contrôle de la propriété dirigée par l'utilisateur. Fabrication et modification des biomatériaux à base hydrogel en utilisant la précision offerte par la lumière et la polyvalence offerte par ces chimies thiol-X photoclick sont d'un intérêt croissant, en particulier pour la culture de cellules à l'intérieur bien définies, microenvironnements biomimétiques. Ici, nous décrivons des procédés pour la photoencapsulation des cellules et photopatterning ultérieur des signaux biochimiques à l'intérieur des matrices d'hydrogel à l'aide de blocs de construction modulaires polyvalents et polymérisées par une réaction photoclick thiol-ène. Plus précisément, une approche est présentée pour constructing hydrogels à partir allyloxycarbonyle (Alloc) reticulations peptide -functionalized et pendants fragments peptidiques et les poly thiol à fonctionnalité (éthylène glycol) (PEG), qui polymérisent rapidement en présence de lithium acylphosphinate photoinitiateur et des doses cytocompatible de longue ultraviolets de longueurs d'onde (UV). techniques Facile à visualiser photopatterning et quantifier la concentration de peptides ajoutés sont décrits. En outre, les procédés sont mis en place pour les cellules d'encapsulation, en particulier les cellules souches mésenchymateuses humaines, et la détermination de la viabilité et l'activité. Tandis que la formation et la structuration initiale d'hydrogels thiol alloc sont présentés ici, ces techniques largement peuvent être appliquées à un certain nombre de systèmes de matériaux d' autre lumière et initiée par voie radicalaire (par exemple, un thiol-norbornène, thiol-acrylate) pour produire des substrats à motifs.
Cliquez sur chimies sont de plus en plus utilisés dans la conception de matériaux pour de nombreuses applications biomédicales, y compris la délivrance de médicaments, l' ingénierie tissulaire, et de la culture cellulaire contrôlée, en raison de leurs, réactivités cytocompatible efficaces, et souvent sélectives. 1-3 chimies Photoclick qui utilisent la lumière pour déclencher ou initier des réactions (par exemple, un azide-alcyne, 4 thiol-ène, et 5 tétrazole-alcène 6) présentent un intérêt particulier pour la formation ou la modification de biomatériaux. Taux rapide dans les conditions et le contrôle de quand et doux où ils ont lieu avec de la lumière rendent ces réactions bien adaptées pour le contrôle réalisé par l' utilisateur propriétés biomatériaux en présence de cellules 7,8 En particulier., Chimies thiol-ène photoclick ont été utilisés pour générer des biomatériaux à base d' hydrogel, ayant des propriétés mécaniques robustes et 5,9 pour l'encapsulation d'une grande variété de types de cellules, y compris, mais nont limitée à, des cellules humaines souches mésenchymateuses (CSMh), les fibroblastes, les chondrocytes et les cellules pancréatiques, avec la promesse de la culture et de la livraison cellulaire. 10,11 De plus, ces chimies ont été utilisés pour la structuration spatiale des signaux biochimiques pour imiter les aspects clés de microenvironnements cellulaires natifs et faciliter les interactions cellule-matrice appropriées, y compris l' adhérence, la différenciation et l' invasion. 3,12
Pour la construction d'hydrogels thiol-ène avec de la lumière, des peptides contenant des cystéines (thiol) sont couramment mis à réagir avec des polymères fonctionnalisés avec des acrylates ou norbornènes ( «ène») pour la polymérisation photoinitiée rapide dans des conditions cytocompatible. 13 Élargir cette boîte à outils, nous avons cherché à établir méthodes pour la formation d'hydrogel avec de nouveaux blocs de construction polyvalent et accessible qui nécessitaient un traitement synthétique minimal ou disponibles dans le commerce en vue de leur large utilisation comme matrices extracellulaires synthétiques.Un pour pendentif, des groupes de liaison à l' intégrine pour promouvoir l' adhésion cellulaire [K (alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] ou deux pour réticulations non-dégradables ou de cellules-dégradable [K (: 14 Plus précisément, les peptides ont été modifiés avec allyloxycarbonyle (Alloc) lysines -protected alloc) RGKGRKGK (alloc) G ou KK (alloc) GGPQGIWGQGK (alloc) K = Pep2Alloc, respectivement]. Avec ces séquences, les conditions ont été établies pour une réaction rapide (1-5 min) avec quatre bras thiol modifié par un poly (éthylène glycol) (PEG4SH) en utilisant des doses cytocompatible de la lumière UV à grande longueur d'onde (10 mW / cm2 à 365 nm) , et le photoinitiateur lithium phényl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). Les hydrogels résultants étaient stables dans des conditions de culture cellulaire pendant des semaines. Pour permettre la dégradation et le remodelage entraîné cellules, un peptide clivable enzymatiquement a été incorporé dans les reticulations de gel ( par exemple, GPQGIWGQ), 15 et une cellule primaire modèle, les cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC), est restée très viable après encapsulation et during culture dans ces matrices. En outre, les peptides ont été spatialement à motifs au sein de ces matériaux, et CSMh demeurer viables et métaboliquement actives dans des conditions de photopatterning. Des séquences alternées pendant peptidiques, non représentés ici (par exemple, IKVAV, YIGSR, GFOGER, etc.) peut également être incorporé dans des matrices pour sonder les interactions des cellules supplémentaires avec le micro – environnement environnant. Ces résultats sont prometteurs pour l'application de ces matériaux à base d'hydrogel pour (3D) la culture de cellules en trois dimensions et de la livraison à l'étude des interactions directes et cellule-matrice pour une variété de types de cellules.
Ici, des méthodes pour photoencapsulate les cellules et les indices biochimiques photopattern ensuite au sein du système d'hydrogel proposé sont présentés (figure 1). Techniques d'observer et de quantifier ces photopatterns aussi sont démontrés: notamment, i) l'utilisation qualitative et quantitative de l'essai d'Ellman pour déterminer les adaptation des thiols libres dans des substrats à motifs et ii) l'utilisation qualitative complémentaire de peptides fluorescents (AF488Pep1Alloc) pour observer ces modèles en trois dimensions. En outre, des essais pour déterminer la viabilité (vivant mort de viabilité / cytotoxicité coloration /) et l'activité métabolique (MTS; 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxyméthoxyphényl) -2- (4-sulfophényl) -2H-tétrazolium) sont présentés de telle sorte que les utilisateurs peuvent déterminer la cytocompatibilité de photoencapsulation et photopatterning conditions pour différentes lignées cellulaires au sein de matrices d'hydrogel. Bien que le protocole est démontré pour un système photoclick d'hydrogel à base de lumière facile, les techniques peuvent être appliquées à de nombreux autres systèmes d'hydrogel radicalaire initiée pour photoencapsulation et photopatterning en présence de cellules.
La procédure présentée ici montre des techniques pour photoencapsulate cellules dans des hydrogels formés par thiol-ène chimie clic, puis photopattern les gels avec des indices biochimiques. L'utilisation de la lumière pour former un premier temps hydrogels permet un mélange homogène et à la suspension des cellules dans la solution de polymère avant la polymérisation. Rapid polymérisation "serrures" le gel dans la forme du moule défini et encapsule les cellules au sein du réseau d'hydrogel suspendu. Gels peuvent également être moulés dans de nombreuses formes différentes (par exemple, des lames de verre ou Conseils de seringues) en fonction de l'application finale souhaitée. Par exemple, les cellules encapsulées pour la culture 3D hydrogels attachés à des lames de verre sont particulièrement utiles pour les applications d'imagerie comme atténuation de la lumière est limitée dans un échantillon mince. moules de seringues peuvent être utilisés pour l'encapsulation rapide des cellules, ce qui permet un plus grand nombre d'échantillons à préparer dans un court laps de temps (par rapport à lame de verres) qui peuvent être utilisés pour des expériences nécessitant un grand nombre de cellules telles que la cytométrie de flux ou qPCR. Par la suite, ces gels peuvent ensuite être modelés avec des indices biochimiques pour obtenir des réponses cellulaires désirées telles que la différenciation ou de l' invasion. 30,31
Des dosages pour la viabilité et l'activité métabolique indiquent la survie des cellules du système des matériaux et des conditions de formation de motifs présentés. Notez que l'activité métabolique a été suivie jusqu'à ce jour 3 dans des gels non-dégradables (RGKGRK peptide réticuler) pour évaluer les premiers effets des conditions de polymérisation et de structuration sur la fonction cellulaire. En outre, un test d'intégrité de la membrane (live morte viabilité / cytotoxicité coloration /) de CSMh à 1 et 6 jours après l'encapsulation dans des gels formulés avec un peptide réticuler dégradable (GPQGIWGQ) soutient que les cellules restent viables et la propagation de 1 semaine dans la culture. La viabilité des lignées cellulaires supplémentaires ont été rapportés dans des conditions de photopatterning 32 similaires à cellesutilisé ici et peut être évalué pour le système d'hydrogel décrit en utilisant une coloration vivants / morts et des dosages de l'activité métabolique. Bien que nous n'avons pas observé des problèmes avec la viabilité des cellules en utilisant ce système de matériaux et les procédures connexes (4.2 et 4.3), certains types de cellules peuvent être sensibles à des radicaux libres et / ou exposition à la lumière. Dans ce cas, les utilisateurs peuvent envisager d' utiliser des systèmes de matériaux non-photoamorcées, comme l' azoture-alcyne, 12 FXIII, 31 ou chimies de formation d'hydrogel à base de Alder Diels. 33
techniques Facile pour détecter et quantifier la structuration de signaux biochimiques dans les gels sont également présentés (3.1 et 3.2). L'analyse d'Ellman est particulièrement intéressante parce que les réactifs sont disponibles dans le commerce et aucune des étapes de traitement supplémentaires ou des réactifs de synthèse plus coûteux (par exemple, un peptide marqué par fluorescence) sont nécessaires. Le dosage d'Ellman peut être utilisé pour déterminer avec précision la modification des thiols libres avec des indices biochimiques sous différephotopatterning nt conditions, ainsi que de visualiser rapidement les modèles. Pour quantifier le peptide incorporation, la concentration en fonction thiol avant et après la structuration, comme une mesure quantitative du peptide incorporation, est évalué directement avec le test d'Ellman. Bien que ce type de dosage peut être effectué avec des peptides marquées par fluorescence, 34 quantification basée sur l' imagerie nécessite plus de traitement et d' analyse des mesures qui prennent du temps (par exemple, la synthèse d'un peptide et la génération marquée par fluorescence d'une courbe d'étalonnage rapportent la fluorescence à la concentration du peptide en utilisant l'analyse de l'image). Pour l'imagerie incorporation du peptide, le réactif d'Ellman peut être appliqué directement à des échantillons et immédiatement visualisé. Bien que limité au x et y avions pour motif la visualisation, la technique peut être utilisée comme une méthode simple, la routine pour déterminer si des matrices contenant des groupes thiol libres ont été modelé. Il est important de noter que l'analyse d'Ellman est pas ccytocompatible onsidered, si bien qu'il peut être utilisé pour observer et quantifier photopatterns, il ne peut pas être fait en présence de cellules. Formation de motifs pour former une image en trois dimensions et en présence de cellules, la conjugaison de peptides fluorescents dans des matrices d'hydrogel reste une approche puissante et la plus utilisée. La résolution des motifs peut être évaluée dans les directions x, y et z plans en utilisant la microscopie confocale, et cette méthode est cytocompatible de telle sorte que les cellules dans les régions à motifs ou régions sans motifs peuvent être identifiés. Pris ensemble, les techniques d'analyse et fondées sur l'imagerie de Ellman sont des outils complémentaires pour les chercheurs d'évaluer quantitativement et qualitativement l'photopatterning des signaux biochimiques au sein du système des matériaux.
Photoclick, ou plus largement photoinitiée, chimies pour la formation et la modification des hydrogels en présence de cellules sont nombreuses. Les moulage, encapsulation et structuration des techniques présentées ici ne sont pas limitée au système matériel décrit et peut être appliquée à des chimies basées sur la lumière de remplacement, comme thiol alcyne, 35 azide alcyne, 4 et autres chimies thiol-ène (par exemple un thiol norbornène), 10,13, ainsi qu'avec différents photoinitiateurs, tels que Irgacure 2959, l'éosine Y, et de la camphoquinone. Remarque, les utilisateurs peuvent avoir besoin d'ajuster les paramètres de procédure (par exemple, des temps d'incubation, le temps de polymérisation, la densité cellulaire) pour veiller à ce que les conditions restent cytocompatible pour ces autres systèmes. Etant donné que le processus de mise en forme nécessite la diffusion du peptide (s) modifié par alloc dans l'hydrogel (2.2.3-2.2.5), ce procédé peut se révéler plus utiles pour l'addition de groupements de liaison à l' intégrine (par exemple, des peptides ou des protéines de la matrice extracellulaire fragments) à l'hydrogel, où la fixation du ligand au réseau est nécessaire pour la génération de forces de traction par l'activation complète des cellules et des intégrines. 36 noter que pour les biomolécules qui peuventêtre tout aussi actif en solution ou à l' immobilisation (par exemple, des facteurs de croissance ou des cytokines), l'étape d'incubation de la diffusion de la fraction (~ 1 h) dans l'hydrogel pourrait conduire à des événements qui convolute les résultats de formation de motifs de signalisation. D' autres méthodes ont été établies pour l' immobilisation du facteur de croissance ou de séquestration locale pour leur structuration. 37-39 En outre, la résolution de motif est dictée par le contrôle de l' exposition lumineuse. Ici, les photomasques permettent la création de motifs sur toute la profondeur du gel et dans les axes x et y plans; cependant, un plus grand contrôle sur l' espace de motif de signaux biochimiques à l'intérieur des gels peut être réalisée avec d' autres méthodes d'irradiation telles que l'utilisation d'un microscope confocal à deux photons pour générer des motifs dans les directions x, y et z- avions. 34,40 Enfin, il est important de noter que si le système matériau utilisé dans ce procédé est seulement d'abord modifié avec des indices biochimiques chimies photoclick orthogonales pourraient être utilisés pour permettre alterations dans les propriétés de la matrice au fil du temps. 12 La procédure et les techniques présentées ici ajoutent la diversité des approches actuelles pour créer des matrices synthétiques avec des propriétés bien définies et spatiotemporellement contrôlées. En particulier, la disponibilité commerciale des réactifs et des matériaux utilisés dans cette procédure sera utile à un large éventail de chercheurs intéressés par l'utilisation de biomatériaux à base d'hydrogel pour des applications en culture cellulaire contrôlée.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par les programmes du Delaware Cobre dans la découverte de médicaments et en biomatériaux de pointe financés par les prix de développement institutionnel de l'Institut national des sciences médicales Généraux des Instituts nationaux de la santé (P20GM104316 et P30 GM110758-01, respectivement), les Pew Charitable Trusts (00026178), un Prix national de carrière science Foundation (DMR-1253906), le Fonds Burroughs Wellcome (1006787), et le programme national science Foundation IGERT SBE2 à l'Université du Delaware (de bourses à L. Sawicki). Les auteurs remercient le Centre BioImaging Delaware Institut de biotechnologie à l'Université du Delaware pour la formation et l'accès à la microscopie confocale, Mme Katherine Wiley pour l'assistance pendant le tournage de la vidéo, M. Matthew Rehmann pour fournir généreusement CSMh isolées à partir de la moelle osseuse, le professeur Christopher J . Kloxin et M. Stephen Ma pour fournir généreusement photomasques, et le professeur Wilfred Chen pour l'utilisation du lecteur de plaque automatique. </p>
Custom Peptides | Various Vendors | —- | Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep. |
4arm PEG Thiol, MW 20k | JenKem USA | 4ARM-SH | Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced. |
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Colorado Photopolymer Solutions | Li-TPO | |
Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
2.4.6-Trimethylbenzoyl Chloride | Sigma Aldrich | 682519 | Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Lithium Bromide | Sigma Aldrich | 213225 | |
2-Butanone | Sigma Aldrich | 360473 | |
Flask, Round Bottom, 100 mL | Chemglass | CG-1506-05 | |
80 mL Filter Funnel, Buchner, Medium Frit | Chemglass | CG-1402-L-02 | Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired. |
Magnetic Stir Bars | Various Vendors | —- | |
Magnetic Stirring and Hot Plate | Various Vendors | —- | |
Vacuum Dessicator | Various Vendors | —- | |
Deuterium Oxide | Acros Organics | 16630 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 14190-250 | |
Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
Fungizone | ThermoFisher Scientific | 15290-018 | |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Select appropriate medium and trypsin depending on cell type. |
Microcentrifuge tubes | Various Vendors | —- | 1.5 or 2 mL sizes, sterile. |
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) | Fisher Scientific | 14-823-16H | Product number listed here is for a 1 mL syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX). |
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) | McMaster Carr | 87315K62 | |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs | 2701 | |
RainX, Original | Amazon | 800002243 | May be purchased from other vendors. |
Sigmacote | Sigma Aldrich | SL2 | |
Photomasks | Advance Reproductions Corporation | —- | Photomask Division, different designs may be printed as desired. |
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | ThermoFisher Scientific | PI-22582 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S5136 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | E6758 | |
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS | Fisher Scientific | S318 | |
Orthophosphoric Acid | Alfa Aesar | 33266 | |
Cysteine Hydrochloride Monohydrate | Sigma Aldrich | C7880 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | ThermoFisher Scientific | L-3224 | |
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay | Promega | G3582 | |
Centrifuge | Various Vendors | —- | Capable of speeds at 90-110 x g. |
Multiwell Plate Reader | Various Vendors | —- | Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate. |
Epifluorescent or Confocal Microscope | Various Vendors | —- | To visualize peptide patterns and cells within hydrogels. |
Omnicure Exfo Series 2000 | Excelitas Technologies | —- | Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels. |
Zeiss Zen Lite Software | Zeiss | —- | Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes |
ImageJ | NIH | —- | Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis |