Hücre Kültürü Uygulamaları için Hidrojeller Işık aracılı Oluşumu ve Desenlendirme

Hidrojel Formasyonu için Materyallerin hazırlanması 1. Standart katı faz peptid sentezi (SPPS) son grup modifikasyonu (PEG4SH) için üç aşamalı bir prosedürle teknikleri ve tiol-işlevselleştirilmiş bir polimer ile askının (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) ve çapraz bağlama peptidleri (Pep2Alloc) sentezler. 14,16 Alternatif olarak, PEG4SH satın (M ticari olarak n ~ 20 kDa), Pep1Alloc ve Pep2Alloc. Davlumbaz (1.2.1-1.2.11) sentez adımları uygulayın. 14,17 aşağıda açıklanan iki aşamalı reaksiyon ile foto başlatıcı (LAP) sentez ve kimyasal maddeleri kullanırken dikkatli kullanın (koruyucu eldiven, giysi ve gözlük takın) . LAP ticari olarak satın alınabilir. fırınında bütün cam malzeme (> 2 saat, 80 ° C). bir septum ile boş bir tek boyunlu yuvarlak dipli bir şişeye (100 mi) ve kapak, bir karıştırma çubuğu ilave edin. bir halka standı ve kelepçe ile bir manyetik karıştırma sıcak plaka üstünde balon sabitleyin. benseptum bir iğne (18 g) nsert hava alan dış ucunu bırakın. bir atıl gaz hattına bağlı olan ikinci iğne yerleştirin. Atıl gaz hattı (örneğin, argon veya azot) açıp 10-15 dakika boyunca balon temizleyin. NOT: Sistem sürekli reaksiyon boyunca inert gaz, argon ya da nitrojen ile temizlendi. iğnesi olan bir şırınga kullanılarak bir şişeye aktarın 1,5 g (~ 1.4 mi) dimetil phenylphosphonite (DİKKAT), septum ile delmek. heyecan plaka (orta hız) açın ve içeriği şişenin tarafı üzerine sıçrama yok dikkatli olun. septumu delmek için bir iğne ile bir şırınga kullanılarak, şişeye ihtiva dimetil phenylphosphonite 1.6 g (~ 1.46 mi) 2,4,6-trimetilbenzoil klorid (DİKKAT) damla damla ekleyin. ışıktan korumak ve argon ya da azot altında 18 saat süre ile karıştırılmaya folyo ile reaksiyon bölmesi kapatılır. Sonraki gün, bir şişenin yüksekliğini artırmak karıştırıcı üzerinde, bir yağ banyosu yerdikkatli bir şekilde yağ banyosu içine balon alt nd. Manyetik bir karıştırma muhafaza ederken 50 ° C'ye kadar bir banyo ve şişeyi ısıtın. 2-butanon, 50 ml 3.05 g lityum bromür çözülür. Yağ banyosunun üzerinden balon kaldırın ve kısa bir süre bir şişeye dökün septum kaldırarak, yuvarlak dipli bir şişeye, lityum bromür çözeltisi ilave edilir. : (Septum de argon hatları ve delik bir iğne giden bir iğne olacaktır DİKKAT) tekrar ısıtılmış yağ banyosu içine balon alt ve reaksiyon, 10 dakika boyunca ilerlemesine izin septum ile tekrar şişeyi sıkıca kapatın. Katı bir çökelti oluşturacak. 10 dakika sonra, argon kapatmak ısı şişeyi kaldırmak ve karışım ışığa duyarlı başlatıcı üretilmiştir olarak ışıktan korumak için folyo ile kaplı 4 saat (dinlenmeye bırakın. Havalandırma iğne yeri tutun. Bir cam frit hunisi içine ürünün dökülmesi veya uygun bir filtre kağıdı ile kaplı huni. R 2-bütanon 50 ml Durulama süzülen madde 3 defareaksiyona girmemiş lityum bromür silinmesi. Kuru (birinci sıra üzerine ve daha sonra vakum desikatörde) ve D 2 O 1 NMR ile ürünün analizinin yapılması 1.8-1.9 civarındadır (6H, s), 2.1-2.2 (3H, s), 6.7-6.8 (2H, s), 7.3-7.4 (2H, m), 7.4-7.5 (1 H, m), ve 7.5 karakteristik tepelere -7.7 (2H, m). 14,17 Hidrojeller (Tablo 1) yapmak için hazır olmalıdır, her stok solüsyonu (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP) hacim ve konsantrasyonunu hesaplamak için bir tablo kullanın. Tüm reaktif gruplar polimerizasyon sırasında tüketilen böylece olmayan desenli jelinin imal edilmesi için, bu [SH] = [alloc] sağlar. Jellerin photopatterning planlanıyorsa, Pep1Alloc daha sonra reaksiyon için stokiyometri göre jel oluşumu sırasında tiol fonksiyonel grupların aşırı miktarda (örneğin, 0.2-5 mM [SH]> [Alloc]) içerir. Not: jeller (5 dakika içinde) hızlı bir polimerizasyonun sağlanması için PEG4SH (% ağırlık) daha fazla ağırlıkça yüzde 5 içermelidir. Bununla birlikte, düşük ağırlık olarak% aralığıUygulama alt modüllerine (örn <0,5 kPa) ile hidrojellerin için ararsa s keşfedilmeyi olabilir; Polimerizasyon kontrol edildi ve bu düşük ağırlık olarak% bileşimler buna göre ayarlanmalıdır. Benzer şekilde, Pep1Alloc konsantrasyonu tiol işlevselleştirilmiş peptitler için literatürde rapor edildiği gibi farklı uygulamalar (örneğin, 0.2-5 mm) ayarlanabilir. 18-21 LAP konsantrasyonu 0.067 ağırlıkça% (2.2 mm) veya daha az, tarif edildiği gibi, etrafında önerilmektedir yüksek konsantrasyonlarda hücre canlılığı azaltabilir. Tablo 1'de hesaplamalara dayalı hücre kültürü için steril koşullar altında Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH ve LAP stok çözümleri hazırlayın. Pep1Alloc ve Pep2Alloc için, tek tek peptid sentezi ile ilgili Pep1Alloc ve Pep2Alloc toplam kütlesi ağırlığı ve% 1 penisilin / streptomisin (PS) ve 0.5 ug / ml fungizon (FZ) ihtiva eden steril fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde eritin. Hazırlanan stok solüsyonları aralık tipik konsantrasyonlarıpeptid 20-100 mg / ml arasında. Kullanılıncaya kadar -20 ° C'de yumuşak doku uygulamaları için ilgili nihai modüllerden (Young modülü ~ 0.5-5 kPa) ile jeller. 22,23 kısım ve mağaza elde etmek için bu stokları karıştırın. PEG4SH, steril mikrosantrifüj tüpüne PEG4SH tartın ve PBS + PS + FZ içinde çözülür. 250-430 mg / ml arasında, bu stok çözeltisi aralığı tipik konsantrasyonları (ağırlık olarak% 20-30 PEG4SH). LAP, steril mikrosantrifüj tüpüne LAP ağırlığında ve 7.5 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar PBS + PS + FZ içinde çözülür. NOT: PEG4SH ve LAP taze çözümler hazırlanması tutarlı polimerizasyon süreleri sağlamak için her türlü kapsülleme veya jel deney için tavsiye edilir. Hidrojeller Şekillendirme Steril Şırınga İpucu Kalıpları hazırlayın. Dikkatlice jilet kullanarak 1 ml şırınga kapalı ipuçları kesti ve daha sonra şırınga milleri pistonları çıkarın. 15 dakika An% 70 etanol içinde şırınga milleri ve pistonları BatmakSteril hücre kültürü kaputu d yer (30 dk) kuru. etanol aşırı damla şırınga şaft içinde kalırsa, onları dışarı itmek için dalgıç kullanmak. Steril Cam hidrojel oluşturmaya Kalıpları Slide hazırlayın. Cam slaytlar (2 katları) ve kauçuk conta emmek (0.254 mm kalınlığında, şimler olarak kullanılan 2 küçük parçalara disklerle birlikte bir dikdörtgen dışarı yumrukladı veya kare kare şekli)% 70 etanol 15 dakika ve steril hücre kültürü kaputu yer kurutmak. Üreticinin talimatına göre, anti-yapışkan bir kaplama ile sterilize slaytlar Coat yarısı slayt yüzeyi (4 slaytlar varsa, örneğin, 2 kaydırak, anti-yapışkan ile kaplı olacak) için jel üstünde yapışmasını önlemek için. Bu cam slayt kalıbın üst olarak görev yapacak. şırınga veya cam slayt kalıpları için lambayı kalibre edin. NOT: Bu deneyler için, harici bir filtre adaptörü montaj ve 365 nm dış filtre ile cıva ark lambası kullanıldı. diğer lambadiğerleri tarafından rapor edilen uzun dalga boyu UV ışığının uygun yoğunluklarda üreten s kullanılabilmektedir. 24-27 tüm örnekleri arasında nispeten eşit ışık yoğunluğunu sağlamak için sıvı dolu ışık kılavuzun sonuna kadar bir kolimatör lensi takın. Gerektiğinde, ilgi konusu örnekleri kapsayacak bir leke boyutuna ulaşmak için örnek (ler) den, ışık kılavuzunun mesafeyi ayarlamak. Bir mikrosantrifüj tüp tutucu bir kesim şırınga kalıp yerleştirin (dikey konumda şırınga kalıp tutmak için). Numuneler yapılacak şırınga ucu hizasında radiometer tutun ve 365 nm'de 10 mW / cm2 ışık yoğunluğunu elde etmek için çekim (% açık) ayarlayın. daha sonra kullanmak için ayarlanmış ayarları kaydedin. Steril bir yüzeyin üst kısmına cam slayt kalıp yerleştirin (örneğin, bir biyogüvenlik kabini içinde bir pipet kutusunun üst). Cam slayt kalıp yükseklikte radiometer dedektörü tutun ve 10 m ışık yoğunluğu elde etmek için çekim (% açık) ayarlamak365 nm 'de W / cm2. daha sonra kullanmak için ayarlanmış ayarları kaydedin. 2. Hidrojel Oluşumu ve photopatterning Sigara desenli hidrojellerinin hazırlanışı. Not: hidrojeller hücre kültürü uygulamalarında kullanılacak ise protokol Bu noktada, takip eden tüm adımlar steril kabin veya kaputu steril koşullar altında gerçekleştirilmelidir. Tablo hesaplama (Tablo 1 örneğe bakın) göre PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP ve PBS + PS + FZ stok çözümleri karıştırın. çözeltinin karıştırılması garanti edilmesi için kuvvetli bir şekilde elde edilen jel ön-madde çözeltisi Pipet. steril, kesme şırınga ucuna jel habercisi çözeltisi (PEG / Pep / LAP / PBS) 10-20 ul pipetleme şırınga uçları kalıp kalın hidrojeller hazırlayın. şırınga başına tek bir jel yapmak, yaklaşık 0.5-1.5 mm kalınlığında hacmi ve şırınga çapına göre. NOT: Büyük hacimler keşfedilmeyi dayalı olabilirüst sınır boyunca Pep1Alloc için difüzyon sınırlamaları dayanarak var olabilir istenen jel boyutu photopatterning ve / veya besin / kapsüllü hücrelerden / 'e atıklar hücre kültürü sırasında. olmayan kaplanmış cam slayt kenarlarında lastik conta (0.254 mm kalınlığında) koyarak cam slayt kalıplarda ince hidrojeller hazırlayın. Pipet 5-10 ul jel öncü çözeltisi olmayan kaplanmış cam slayt üzerine (tek ya da birden çok, 5-10 ul jeller, tek bir slayt üzerine çözeltinin bir ya da daha fazla nokta pipetleme ile yapılabilir) ve anti-yapışkan ile kaplanmış cam slayt yer jel çözeltisi üzerine (daha büyük jeller, cam slayt boyutuna kadar, nihai uygulamaya bağlı olarak yapılabilir). stabilize etmek için küçük bağlayıcı klipleri ile cam slaytlar sabitleyin. Lamba altında yer kalıpları ve lamba yoğunluğu ayarlayın (örneğin,% obtüratör açık) adım 1.7.2 yılında ölçümlere dayalı şırınga ucu kalıp veya cam slayt kalıplar için jel yüzeyinde 10 mW / cm 2 ulaşmak vesırasıyla, 1.7.3. Jellerin Tam polimerizasyonu sağlamak için 1 ila 5 dakika boyunca ışık uygulanır. içerisinde modülleri ile tamamen polimerize hidrojeller oluşturmak için daha düşük PEG4SH içeriğine (5-8 ağırlıkça% 3-5 dakika) jeller yüksek PEG4SH içeriğine (8 ağırlık% ya da daha fazla, 1 dakika) ve daha uzun olan jeller için daha kısa bir polimerizasyon süresi kullanın yumuşak dokuların aralığı (0.5-5 kPa). steril kap içine steril bir işlenmemiş 48 oyuklu plaka içine şırınga ucu kalıplardan yer jeller ve yer cam slaytlar. Hücre kültürü ortamı veya uygun tampon ile 3 x 15 dakika durulayın (örneğin, PBS + PS + FZ, Ellman reaksiyon tamponu), aşağıda ayrıntılı olarak planlanan deneyler dayalı. Desenli Hidrojeller hazırlanması. Pep1Alloc daha sonra reaksiyon için serbest tioller (0,2-5 mM) bırakarak, tablo hesaplamaya göre PEG4SH, Pep2Alloc, LAP ve PBS + PS + FZ stok çözümleri karıştırın. çözeltinin karıştırılması garanti edilmesi için kuvvetli bir şekilde ön-madde çözeltisi Pipet. 2.1.6 adımları 2.1.2 ortaya koydu gibi kalın ve ince hidrojeller hazırlayın. NOT: Önceki photopatterning büyüme ortamında jeller koymayın. Free tiyoller büyüme ortamında türleri tarafından tüketilebilir (örneğin, disülfid tiol içeren proteinler ile formasyonu) ve ek işlem adımları olmadan jel model oluşturmanın izin vermez (örneğin, disülfid bağlarının indirgenmesi). Pep1Alloc çözeltilerini hazırlamak (nihai konsantrasyon ~ 3-20 mg / ml) ve 2.2 mM LAP. Pep1Alloc / tur çözeltisi ile önceden oluşturulmuş jeller Kapak ve 37 ° C de 1 saat süreyle inkübe edin. Aşırı Pep1Alloc / LAP çözüm çıkarın. jeller şırınga ucu kalıplanmıştır için, dikkatli bir desen için steril cam slayt enkübe edildiği 48 oyuklu plaka jeller aktarmak için bir ıspatula ile yapılır. syringe- ve cam slayt kalıplanmış jellerin üzerine doğrudan istenen deseni ile bir fotomaske yerleştirin. Maskenin baskılı bölümü optimum Patt için jel dokunur emin olunern sadakat (yani maske doğru okudunuz ve aşağı emülsiyon tarafı olmalıdır). lamba altında yer örnekleri ve cam slaytlar (adım 1.7.3) için kullanılan lamba ayarları ile 1 dakika boyunca ışın tedavisi. desenlendirme sonra yer steril, 48-kuyu olmayan doku kültürü tedavi plaka içine jeller şırınga kalıplı ve yer cam steril tabak içine cam slaytlar yapışık jelleri slayt-kalıplı. Hücre kültürü ortamı veya uygun tampon ile 3 x 15 dakika durulayın (örneğin, PBS + PS + FZ, Ellman reaksiyon tamponu) planlı deneylere dayalı. 3. görselleştirme ve photopatterning Niceleme Ellman Testi Photopatterned Hidrojeller olarak miktarlarının Ücretsiz tiyoller Algılama ve. Ellman reaksiyon tamponu, sistein çalışma çözeltisi, standartlara ve aşağıda tarif edildiği gibi Ellman reaktifi hazırlayın. Ellman Reaksiyon Tamponu için 2.4 gr sodyum fosfat dibazik (Na 2 HPO çözülür4) ve 74.4 ila 200 mg mi dihidroksi H2O (0.1 M Na 2 HPO 4, 1 mM EDTA) içinde etilendiamintetraasetik asit (EDTA). Sodyum hidroksit (NaOH) ya da fosforik asit (3 konumundaki H atomu PO 4) solüsyonları ile 7.5-8 pH ayarlayın. Sistein Çalışma Çözüm için 15 ml reaksiyon tamponu (2 mM sistein) içinde 5.27 mg sistein çözülür. Sistein standartları, 2, 1.5, 1.25, 1, 0.75, 0.5, 0.25, 0 mM sistein bir son konsantrasyona kadar, reaksiyon tampon maddesi içinde sistein çalışma çözeltisi seyreltilir. Ellman maddesi için, 1 ml reaksiyon tamponu içinde 4 mg, Ellman maddesi çözülür. Sonikasyon tamamen Ellman reaktifi çözmek için. Ellman tahlili (Şekil 2) ile jeller serbest tiol konsantrasyonunu ölçmek. NOT: 'Zayıf' 5 ul hidrojeller, cam slaytlar arasında kalıp, aşağıdaki prosedüre açıklanan ve Ellman ayıracı t hızlı yayılmasına imkan tavsiye edilmektedirjel hrough (yani, ayıraç kalın jelleri boyunca yayılabilmesi uzun bir zaman alır). Şişme oranının hacimsel dayalı 'ince' 5 ul jeller (V S) şişmiş jel hacmi belirlemek, Q. şırınga kalıpları kullanarak üç 20 ul 'kalın' jeller olun. Ellman reaksiyon tamponu Place jeller 24 saat ve daha sonra (denge şişmiş kitle, M S) tartın. Jeller liyofilize ve daha sonra (kuru kitle, M D) tartın. Q oranı 28 şişme hacimsel hesaplamak kalın jeller için ölçülen kütlelerle = 1 + ρ polimer / ρ bir çözücü (M S / M D-1) ρ polimeri = 1.07 g / cm3 PEG için, 29 ρ çözücü = 1.0 g / cm3 PBS / H2O için jel teorik kuru kütle Ellman Testi (burada kullanılmak üzere hesaplamak, 5 ul 'ince' jeller u tipik olarakSED), ayrı ayrı bileşenlerin kitleleri PEG4SH, Pep1Alloc ve Pep2Alloc (M D = M PEG4SH + M Pep1Alloc + M Pep2Alloc) toplanmasıyla. M PEG4SH hesaplanmıştır Örneğin, ağırlık olarak% 10 PEG4SH ihtiva eden bir 5 ul jel, yaklaşık 0.000535 g PEG içeren = 0.005 cm3 x 1.07 g / cm 3 x 0.10. Pep1Alloc ve Pep2Alloc kütleleri, bu sulu çözeltiler için ρ ≈ 1.0 g / cm3 olduğu kabul edilerek çözelti içinde ağırlıkça% göre benzer bir şekilde (değerler çizelgede bakınız) hesaplanabilir. NOT: Jeller da kurutulmuş ve yerine teorik kuru kütleye hesaplama tartılır olabilir. Ancak, sürekli ince, 5 ul jellerin kuru kütlesini ölçmek için zor olabilir. Tahmin edilen kuru kütle ve 'kalın' jeller, (adım 3.1.2.1.1 denklem) 'ince' jel için öngörülen şişmiş kitle M S hesaplamak belirlenen Q değeri temelinde. Bu ρ ≈ 1.0 g / cm 'varsayalım <sup> 3, M S ≈ V S. Kantitatif Ellman deneyi gerçekleştirmek için bu hesaplanmış V S kullanın. Not: Yukarıdaki yöntem, özellikler ince 5 ul jeller gibi şişmiş jel V s belirlemek için tavsiye edilir tartmak için transferi güçtür. Bölüm 2.2 (5 ul hacim) de tarif edildiği gibi desen için ince hidrojeller oluştururlar. Spesifik olarak, fazla serbest tiyollerle jeller ve ışık tüm jel ortaya sel açık bir lamel ile Pep1Alloc bu örneklerin "desen" yarısı olmak (örneğin, fazla tiol ile toplam 6 jeller: 3 modifiye edilmemiş olmayan'patterned 've 3' ) 'desenli. NOT: Bu tahlil için, jeller bir photomask olmadan ışığa maruz sel olan 'desenli'. Bu yöntem, tüm jel örnek tüketilen serbest tiol sayısı tespit etmek ve peptit ile modifiye edilebilir ne kadar etkin serbest tioller göstermek için kullanılır. Bu bilgilerden,bir fotomaske ile desenlendirme sırasında tüketilen serbest tiol sayısı jel kalınlığı ve kalıp alanına (ışığa maruz bölgeler) göre tahmin edilebilir. Talep 'desenli' ve 48-çukurlu bir levhanın kuyularında 'jeller olmayan'patterned ve ortaya şişen jel ve denge üzerinden, reaksiyona girmemiş türlerin difüzyonunu izin vermek için Ellman reaksiyon tamponu ile 3 x 15 dakika durulayın. V s reaksiyonu ile tampon 20 ul çoklu böylece durulanır jeller için ekstra Ellman reaksiyon tamponu ekleyin. Örneğin tahmin V S 15 ul ise, 5 ul reaksiyon tamponu (20 ul) ekleyin ve tahmin edilen V S 30 ul ise, 10 ul reaksiyon tamponu (40 ul) ilave edilir. Bir önceki adımda (yani, önceki basamakta Vs olsaydı + ekstra Reaksiyon B'de kullanılan hacmine bağlı olarak 20 ul adedi, 96 oyuklu plakanın bireysel çukurlar halinde sistein standartları (içermeyen jeller) PipetUffer = 40 ul), ayrı ayrı boş kuyulara her standardın 40 ul ekleyin. Reaksiyon tampon maddesi (: örneğin, 20 ul ya da kademesi 3.1.2.5 40 uL, 367.2 uL, 183.6, 180 ul reaksiyon tamponu + 3.6 ul Ellman reaktifi birçok) 'de, Ellman maddesi ile seyreltilir. standartları ve numuneleri içeren çukurlara seyreltilmiş Ellman maddesi ekleyin. 20 ul numuneler için, her bir göze 183.6 ul çözelti ilave edin. (Buna göre örnek boyutuna göre veya ölçek) 40 ul numuneler için seyreltilmiş Ellman reaktifi çift Bu miktar. (TNB inkübe ya 1 saat ve (oda sıcaklığında) 30 dakika boyunca bir karıştırıcıda yer veya çözelti renk, görsel muayene ile jellerin rengi aynı oluncaya kadar san 2-nitro-5-tiobenzoat dianyonun yeterli yayılmasını sağlamak için jelden serbest tiyollerle Ellman maddesi reaksiyonu yoluyla elde edilen 2-). örneklerde ve S'den çözeltisi 100 ul alırtandards ve 96 gözlü bir levhanın gözleri içine koyun. Bir plaka okuyucusu üzerinde 405 nm'de absorbansı okumak. verileri işlemek için, standart bir eğri (adım 3.1.1.3 örnekler) (konsantrasyonuna karşı absorbans) arsa ve doğrusal fonksiyonu uygun. doğrusal fonksiyon, 'sulandırılmış jel' solüsyonu (jel + reaksiyon tamponu) serbest tiyol konsantrasyonu kullanılarak absorbans okumaları dayanarak hesaplanabilir. Son olarak, dikkate reaksiyon tampon maddesi ile 'seyreltme edilerek reaksiyon tampon maddesi olmayan jellerde serbest tiyol konsantrasyonunu belirler. (15 ul jel 5 ul reaksiyon tampon maddesi ile seyreltildi, eğer, örneğin, 20/15 ile çarpmak). Ellman reaktifi (Şekil 3A) ile photopatterns görüntülenmesi. 1 saat Ellman reaksiyon tamponu Pep1Alloc desenli ince hidrojeller bekletin. hafifçe bir doku ile hidrojel kenarlarında silerek aşırı reaksiyon tamponu çıkarın. şirketinden jel yüzeyi üzerindeki Pipet Ellman reaktifi. Hemen bir renkli kamera ile hafif 10X mikroskop ya da stereomikroskop görüntü. Not: görselleştirme kalıpları jel boyunca yayılır olmayan desenli bölgede tioller ile reaksiyona sokulması üzerine, Ellman maddesi yarılmasıyla üretilir san TNB 2- iyon olarak 5 dakika içinde yok olur, çünkü jeller hemen yansıması olması gerekir. Olmayan desenli bölgeler çıplak gözle hafifçe sarı görünür; daha iyi çözünürlük ve daha küçük desenler, büyütme (örneğin, mikroskop kullanımı) için gereklidir. Floresan peptidleri ile Photopatterns (Şekil 3B) görüntülenmesi. Daha yüksek çözünürlüğe sahip ya da üç-boyutlu desenleri görselleştirmek için, adım 2.2 jeller bir AF488-modifiye Pep1Alloc (veya benzeri floresan peptid) photopattern. Bir floresan mikroskop görüntüsü. Bir konfokal mikroskop z-st almak için buraya kullanılabilirack desen y, x- görülebilir, böylece jel görüntüleri ve z-düzlemler. Not: floresan ile, jeller AF488 florofor ve maksimum flüoresans dengesini sağlamak için ışıktan korunmalıdır. (4 ° C'de folyo ile sarılmış bir kapta mağazadan) ışıktan koruyarak eğer floresan peptid oldukça stabil olduğu jeller hemen görüntülü gerekmez. Hidrojeller ve photopatterning 4. Hücre Kapsülleme Toplama ve Encapsulation için Hücreleri hazırlanması. Standart steril memeli hücre kültürü prosedürleri takiben, trypsinize ve plakaları ilgi hücreleri toplamak. Dekolmanı oluştuktan sonra büyüme ortamı ile tripsin söndürün (T-75 balonuna, 5 mi tripsin, örneğin, toplam 15 ml 5 ml ortam ile plaka durulama 5 ml ortam ile söndürün). Not: tripsinizasyon kez hücre tipleri arasında değişebilir, fakat tipik olarak 5 ve 15 dakika arasında oluşabilir. Alternatif hücre dekolmanıt ajanlar (örneğin, Versene) arzu edildiği takdirde hücreleri toplamak için kullanılabilir. Toplu hücresi süspansiyonu (90-110 xg 5 dakika) santrifüj sırasında hemasitometre ya da diğer hücre sayım cihazı kullanılarak tripsinize Hücre süspansiyonunun alikotlan (a en az 100 ya da üreticinin protokolü) hücreler sayılır. İlk tripsinize hücre süspansiyonu çok sulandırmak ise minimal PBS hacmi veya büyüme ortamı ve yeniden sayısında santrifüj sonra hücre pelet yeniden askıya. (Polimerizasyondan önce) jeli çözeltisi ile karıştırıldığında 5,000 hücre / ul olacak şekilde mikrosantrifüj tüpleri içine her jel durumu için PBS minimal hacimde hücreleri ve kısım kısımları yeniden askıya. Not: Tipik Hücre numuneleri, 300.000-500.000 hücre içeren ve 5000 hücre / ul 3-5 x 20 ul jeller için kullanılabilir jeli / hücre süspansiyonu 60-100 ul yapmak için yeterlidir. Daha yüksek ya da daha düşük hücre yoğunlukları hücre-hücre miktarına bağlı olarak, kapsülleme için kullanılabilirgenel hücre-matris iletişim sırasıyla istenen ve her bir uygulama için belirlenmelidir. Santrifüj Hücre / PBS tam bölünen miktarları (90-110 xg 5 dakika). Dikkatle doğru kapsülleme önce mikrosantrifüj tüp hücre pelet PBS aspire. Not: hücre kesme kuvvetlerine karşı duyarlı ise, ikinci merkezkaçlama aşamasının (ör hemositometre) sayımı ve daha sonra her bir jel bir durum için gerekli olan kısımlara tripsinize hücre süspansiyonu (tripsin + medya + hücreleri) aliquotting elimine edilebilir. Bu süspansiyonun tam bölenleri (90-110 xg, 5 dakika) bir kez santrifüje tabi tutulur ve tripsin + ortam kapsüllenmesi için bir hücre pelletini bırakarak aspire edilir. Olmayan desenli Hidrojeller kapsül oluşturan hücreler. Hemen PBS aspire sonra / ul 5.000 hücre nihai bir konsantrasyona kadar-tablonun hesaplanan PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, tur ve PBS + PS + FZ pelet hücreleri askıya. Kalıp ve descr hidrojeller polimerizeadımda IBED 2.1.6 2.1.2. NOT: cam slayt kalıpları hücreleri kapsülleme zaman hücre ölümüne neden olabilir jeli, kesme önlemek için üst slayt sonrası polimerizasyonu çıkartırken, bakım alınmalıdır. kalıptan jel kaldırılması ile yardımcı olmak için, kayar kalıp daha kolay üst kızağın kaldırma hale conta ve hidrojel ıslak polimerizasyondan sonra, steril PBS veya yetiştirme ortamına yerleştirilmiş olabilir. hep birlikte bu kesme önlemek için bir yöntem olup, şırınga kalıpların kullanılmasıdır. büyüme ortamında durulayın jeller 3 x 10 dk girmemiş türler ve aşırı LAP kaldırmak için. Daha fazla analiz için istenen bir zaman noktasına kadar CO2 37 ° C'de büyüme ortamı içinde jeller inkübe ve% 5. Orta her 48 saat veya uygulama (özel hücre tipine ve orta örneğin, tipik besleme aralık) için belirlenen doldurun. Hücrelerin in mevcudiyetinde ve photopatterning Kapsüllenen. Hemen PBS aspire sonra,/ Ul 5.000 hücre nihai bir konsantrasyona kadar-tablonun hesaplanan PEG4SH, Pep2Alloc, tur ve PBS + PS + FZ pelet hücreleri askıya. Pep1Alloc daha sonra reaksiyon için serbest tiyoller (örneğin, 2 mM), uygun bir konsantrasyon bırakın. adımlara 2.2.8 2.2.2 açıklandığı gibi kalıp, polimerize ve desen hidroj. reaksiyona girmemiş türler ve aşırı LAP kaldırmak için desenlendirme sonra büyüme ortamında durulayın jeller 3 x 10 dk. Daha fazla analiz için istenen bir zaman noktasına kadar CO2 37 ° C'de büyüme ortamı içinde jeller inkübe ve% 5. Ortam maddesi her 48 saat veya uygulama için belirlendiği doldurun. 5. Kapsüllü Hücreleri canlılık ve Metabolik Etkinliğinin Belirlenmesi Encapsulated Hücre Canlılık (Şekil 4A) belirlemek için / Canlı Ölü Sitotoksisite Testi gerçekleştirin. g orta difüzyonunu izin vermek için PBS ile 3 x 15 dak jellerden büyüme ortamı çıkarın ve durulamaels. Çözülme canlı / ölü sitotoksisite deneyi çözümleri (etidyum homodimer-1 ve kalsein AM). 1 ml steril PBS 4 mM Calcein AM çözeltilerinin 2 mM etidyum homodimer-1 ve 0.5 ul 2 ul ekle. Vortex sıyırınız. 48 oyuklu plakalar, her şırınga kalıp jel 300 ul lekeleme solüsyonu ilave ya da steril bir tabak içinde, bir cam slayt üzerinde jel yüzeyini kaplamak için yeterli ve 45 dakika boyunca inkübe edin. Fazla boyama çözüm çıkarın ve jeller (PBS ile 3 x 15 dk) aşırı boya kaldırmak için durulayın. 10X ve 488/525 nm Ex / Em bir konfokal mikroskop (z-yığın görüntüleri) veya z-yığın özelliği olan bir epi-floresan mikroskop Görüntü. Z-yığınları çıkıntı ve canlı (hücre vücuda yeşil) ve ölü (kırmızı çekirdekler) görüntüleme yazılımı ile hücrelerin sayısının sayılmasıyla yaşayan hücrelerin sayısını belirlemek. (Hücre aktivitesi sonrası kapsülleme belirlemek için figu metabolik aktivite deneyi gerçekleştirmek) 4B yeniden. 24 saat taze büyüme ortamı ile besleme kapsüllenmiş hücrelerin tahlil önce. NOT: birkaç ekstra kuyular kontrol (arka plan okumaları) olarak (hayır hücreleri yok jeller veya jel içeren) orta ekleyin. ilgi zaman noktasında, MTS reaktifi çözeltisi çözülme. Not: Zaman içinde, metabolik aktivitesini belirlemek için, bir ilk zaman noktası (12-24 saat sonra-enkapsülasyon) sonraki zaman noktalarında karşılaştırma için bir referans olarak önerilir. Her iyi (100 ul büyüme ortamı başına 20 ul) MTS reaktif ekleyin. Üreticinin talimatlarına göre, 37 ° C de 1-4 saat ve% 5 CO2 için inkübe edin. Not: hücre MTS azaltabilir ve jelin üzerinden formazan ürününün yayılmasına imkan için inkübasyon süreleri yeterlidir. Sonuç olarak, bu tür şırınga ucu jelleri gibi daha kalın jeller yeterli MTS azaltılması ve difüzyon için uzun inkübasyon süreleri (~ 4 saat) gerekebilir. indirgenmiş MTS / Orta 100 ul pipetBir plaka okuyucusu üzerinde 490 nm'de bir 96-kuyu plaka absorbansı temiz kuyu içine. başlangıç ​​çizgisi absorbans değerlerini oluşturmak için Örnek absorbans değerlerinden hücreleri olmadan yuvalar için arka plan absorbans çıkarın.