JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

تشكيل الضوء بوساطة والزخرفة من الهلاميات المائية للتطبيقات خلية ثقافة

Published: September 29, 2016
doi:
10.3791/54462
,
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering,University of Delaware, 2Department of Materials Science and Engineering,University of Delaware

Summary

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Abstract

وقد تم التحقيق انقر كيمياء لاستخدامها في العديد من التطبيقات الحيوية، بما في ذلك تسليم المخدرات، هندسة الأنسجة، وزراعة الخلايا. وعلى وجه الخصوص، وردود الفعل بنقرة بوساطة الخفيفة، مثل ردود الفعل إيني-ثيول وثيول-yne photoinitiated، تحمل السيطرة الزمانية المكانية على الممتلكات المادية والسماح للتصميم نظم بدرجة عالية من الرقابة على الممتلكات الموجهة للمستخدم. تصنيع وتعديل المواد الحيوية القائمة على هيدروجيل باستخدام الدقة التي توفرها الضوء وبراعة التي تقدمها هذه كيمياء ثيول-X photoclick هم من الاهتمام المتزايد، لا سيما بالنسبة للثقافة الخلايا داخل واضحة المعالم، microenvironments الجزيئية الحيوية. هنا، نحن تصف أساليب لphotoencapsulation من الخلايا وphotopatterning اللاحقة من الإشارات البيوكيميائية داخل المصفوفات هيدروجيل باستخدام كتل متعددة وحدات بناء بلمرة من قبل ثيول-إيني رد فعل photoclick. على وجه التحديد، ويقدم نهجا للمشاركةnstructing الهلاميات المائية من allyloxycarbonyl (الوك) crosslinks الببتيد -functionalized وقلادة الأنصاف الببتيد وبولي functionalized ثيول (جلايكول الإثيلين) (PEG) أن بلمرة بسرعة في وجود photoinitiator الليثيوم acylphosphinate وجرعات cytocompatible طويلة الطول الموجي فوق البنفسجية (UV) الضوء. تقنيات السطحية لتصور photopatterning وقياس تركيز الببتيد وأضاف موصوفة. بالإضافة إلى ذلك، يتم وضع أساليب للخلايا التغليف، وتحديدا الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان، وتحديد حيويتها ونشاطها. في حين يتم عرض تشكيل والزخرفة الأولية من الهلاميات المائية ثيول-الوك هنا، على نطاق واسع ويمكن تطبيق هذه التقنيات لعدد من النظم المواد الخفيفة الأخرى وجذرية بدأت (على سبيل المثال، ثيول-في norbornene، ثيول-أكريلات) لتوليد ركائز منقوشة.

Introduction

وتستخدم انقر كيمياء متزايد في تصميم المواد للعديد من التطبيقات الطبية الحيوية، بما في ذلك تسليم المخدرات، هندسة الأنسجة، وزراعة الخلايا التي تسيطر عليها، وذلك بسبب انتقائية وفعالة، وغالبا ما نشاطية لهم cytocompatible 1-3 كيمياء Photoclick التي تستخدم الضوء لتحريك أو الشروع في ردود الفعل (على سبيل المثال، أزيد-آلكاين، 4 ثيول-إيني و 5 و tetrazole-ألكين 6) تعتبر ذات أهمية خاصة لتشكيل أو تعديل المواد الحيوية. بمعدلات سريعة في ظل ظروف معتدلة والسيطرة على متى وأين حدوثها مع ضوء جعل هذه التفاعلات مناسبة تماما للسيطرة الموجهة للمستخدم من خصائص بيولوجية في وجود خلايا. 7،8 على وجه الخصوص، وقد استخدمت كيمياء ثيول-إيني photoclick لتوليد الحيوية القائمة على هيدروجيل مع الخواص الميكانيكية قوية 5،9 والتغليف من مجموعة واسعة من أنواع الخلايا، بما في ذلك، ولكن لار تقتصر على خلايا الإنسان الجذعية الوسيطة (hMSCs)، الخلايا الليفية، غضروفية، وخلايا البنكرياس، مع وعد للثقافة الخلية والتسليم. 10،11 وعلاوة على ذلك، وقد استخدمت هذه كيمياء لتنميط المكانية من الإشارات البيوكيميائية لتقليد الجوانب الرئيسية ل microenvironments الخلية الأم وتسهيل التفاعلات خلية مصفوفة المناسبة، بما في ذلك التصاق، والتمايز، والغزو. 3،12

لبناء الهلاميات المائية-ثيول إيني مع الضوء، والببتيدات التي تحتوي على cysteines (ثيول) عادة ما تفاعلت مع البوليمرات functionalized مع الأكريلات أو norbornenes ( 'إيني') لالسريعة، البلمرة photoinitiated في ظل ظروف cytocompatible 13 التوسع في هذه الأدوات، سعينا إلى إقامة طرق لتشكيل هيدروجيل مع كتل جديدة لبناء تنوعا ويمكن الوصول إليها تتطلب معالجة الاصطناعية الحد الأدنى أو كانت متاحة تجاريا نحو استخدام واسع على أنها مصفوفات خارج الخلية الاصطناعية.14 على وجه التحديد، تم تعديل الببتيدات مع allyloxycarbonyl (الوك) المحمية بواسطة lysines: واحد للقلادة، مجموعات integrin ملزمة لتعزيز التصاق الخلية [ك (الوك) GWGRGDS = Pep1Alloc] أو اثنين لcrosslinks غير القابلة للتحلل أو خلية للتحلل [ك ( الوك) RGKGRKGK (الوك) G أو KK (الوك) GGPQGIWGQGK (الوك) K = Pep2Alloc، على التوالي]. مع هذه متواليات، وتهيئة الظروف اللازمة للرد السريع (1-5 دقيقة) مع أربعة ذراع بولي تعديل ثيول (جلايكول الإثيلين) (PEG4SH) باستخدام جرعات cytocompatible من الطول الموجي الطويل ضوء الأشعة فوق البنفسجية (10 ميغاواط / سم 2 في 365 نانومتر) و وphotoinitiator الليثيوم فينيل 2،4،6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). كانت الهلاميات المائية الناتجة مستقرة في ظل ظروف زراعة الخلايا لعدة أسابيع. لتمكين تدهور يحركها الخلية وإعادة عرض، تأسست الببتيد إنزيمي-شطورة داخل crosslinks هلام (أي GPQGIWGQ)، و 15 والخلية الأولية النموذجية، والخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (hMSCs)، ظلت قابلة للحياة للغاية بعد التغليف والزيتوثقافة ز داخل هذه المصفوفات. وعلاوة على ذلك، الببتيدات تم منقوشة مكانيا داخل هذه المواد، وتبقى hMSCs قابلة للحياة ونشاطا في عملية الأيض في ظل ظروف photopatterning. بديلة سلاسل قلادة الببتيد، وليس كما هو موضح هنا (على سبيل المثال، IKVAV، YIGSR، GFOGER، وما إلى ذلك)، كما يمكن إدراج ضمن مصفوفات للتحقيق في التفاعلات خلية إضافية مع المكروية المحيطة بها. هذه النتائج واعدة لتطبيق هذه المواد على أساس هيدروجيل لثلاثية الأبعاد (3D) زراعة الخلايا والتسليم لدراسة والتفاعلات خلية مصفوفة المباشرة لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا.

هنا، وأساليب photoencapsulate الخلايا ويتم تقديم العظة البيوكيميائية photopattern في وقت لاحق في إطار منظومة هيدروجيل المقترحة (الشكل 1). وأثبتت تقنيات لمراقبة وقياس هذه photopatterns أيضا: أبرزها، ط) استخدام الكمي والنوعي للفحص المان لتحديد modificaنشوئها التجولات الحرة داخل ركائز نمط وب) استخدام نوعية مكملة من الببتيدات فلوري (AF488Pep1Alloc) لمراقبة هذه الأنماط في ثلاثة أبعاد. وعلاوة على ذلك، فحوصات لتحديد الجدوى (الحي / الميت الجدوى / سمية الخلايا تلطيخ) والنشاط الأيضي (MTS، 3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) وتعرض -2H-نتروبلو) بحيث يمكن للمستخدمين تحديد cytocompatibility من photoencapsulation وphotopatterning الظروف لخطوط مختلفة من الخلايا ضمن مصفوفات هيدروجيل. بينما أظهرت بروتوكول لنظام photoclick هيدروجيل سطحي قائم على ضوء ذلك، قد يتم تطبيق التقنيات إلى العديد من أنظمة هيدروجيل أخرى بدأت جذريا لphotoencapsulation وphotopatterning في وجود خلايا.

Protocol

1. إعداد مواد هيدروجيل تشكيل تجميع قلادة (Pep1Alloc، AF488Pep1Alloc) والببتيدات يشابك (Pep2Alloc) من خلال معيار المرحلة الصلبة الببتيد التوليف (SPPS) تقنيات وfunctionalized ثيول البوليمر إجراء ثلاث خطوات لتعديل مجموعة النهاية (PEG4SH). 14،16 بدلا من ذلك، شراء PEG4SH (M ن ~ 20 كيلو دالتون)، Pep1Alloc، وPep2Alloc تجاريا. تجميع photoinitiator (LAP) عن طريق تفاعل من خطوتين هو موضح أدناه. 14،17 تنفيذ الخطوات التوليف (1.2.1-1.2.11) في غطاء الدخان وتوخي الحذر عند التعامل مع المواد الكيميائية (ارتداء القفازات الواقية، والملابس، والنظارات) . LAP أيضا يمكن شراؤها تجاريا. الجاف عن الأواني الزجاجية في فرن (> 2 ساعة و 80 درجة مئوية). إضافة بقضيب إلى الرقبة واحدة ذهابا وأسفل القارورة الفارغة (100 مل)، وغطاء مع الحاجز. تأمين قارورة على رأس لوحة الساخنة التحريك المغناطيسي مع موقف حلقة والمشبك. أناnsert إبرة (18 G) من خلال الحاجز وترك الطرف الخارجي مفتوحة إلى الغلاف الجوي. ادخال ابرة الثانية تعلق على خط غاز خامل. فتح خط غاز خامل (مثل الأرجون أو النيتروجين) وتطهير قارورة لمدة 10-15 دقيقة. ملاحظة: سيتم تطهير النظام بشكل مستمر مع غاز خامل، والأرجون أو النيتروجين، في جميع أنحاء رد فعل. نقل 1.5 غرام (~ 1.4 مل) ثنائي ميثيل phenylphosphonite (تنبيه) إلى القارورة، وذلك باستخدام المحاقن مع إبرة ليخترق عبر الحاجز. بدوره على طبق من اثارة (سرعة متوسطة) ويجب الحرص على أن محتويات لا لطخة على الجانبين من القارورة. إضافة 1.6 غرام (~ 1.46 مل) 2،4،6-trimethylbenzoyl كلوريد (تنبيه) قطرة قطرة إلى القارورة التي تحتوي على ثنائي ميثيل phenylphosphonite، وذلك باستخدام حقنة بإبرة لاختراق الحاجز. تغطية وعاء التفاعل مع احباط للحماية من الضوء ويحرك المزيج لمدة 18 ساعة تحت الأرجون أو النيتروجين. في اليوم التالي، ورفع ذروة القارورة، ووضع حمام الزيت على النمام، لND خفض بعناية القارورة في حمام الزيت. تسخين حمام والقارورة إلى 50 درجة مئوية مع الحفاظ على التحريك المغناطيسي. حل 3.05 غرام بروميد الليثيوم في 50 مل من 2 بونانون. رفع قارورة من حمام الزيت وإضافة محلول بروميد الليثيوم إلى القارورة ذهابا والقاع، وإزالة لفترة وجيزة الحاجز لتصب في قارورة. اغلاق القارورة مرة أخرى مع الحاجز (تنبيه: الحاجز سوف لا تزال لديها إبرة تؤدي إلى خطوط الأرجون وإبرة لتنفيس)، وانخفاض قارورة مرة أخرى إلى حمام الزيت الساخن، والسماح للرد فعل على المضي قدما لمدة 10 دقيقة. وسوف يعجل الصلبة شكل. بعد 10 دقيقة، وإيقاف الأرجون، وإزالة قارورة من الحرارة، والسماح للخليط لراحة لمدة 4 ساعات (مغطاة بورق للحماية من الضوء كما تم إنتاج البادئ حساسة للضوء. حافظ على مكان تنفيس إبرة. صب المنتج في كوب فريت قمع أو مسارات تحويل اصطف مع ورق الترشيح المناسبة. الترشيح شطف 3 مرات مع 50 مل من 2 بونانون إلى remove أي بروميد الليثيوم غير المتفاعل. الجاف (أولا على الفوق ثم في مجفف فراغ) وتحليل المنتج من قبل 1 H NMR في D 2 O. قمم مميزة في 1،8-1،9 (6H، ق)، 2.1-2.2 (3H، ق)، 6،7-6،8 (2H، ق)، 7،3-7،4 (2H، م)، 7،4-7،5 (1H، م)، و 7.5 -7.7 (2H، م). 14،17 استخدام جداول البيانات لحساب حجم وتركيز كل حل سهم (PEG4SH، Pep1Alloc، Pep2Alloc، LAP) التي يجب أن تكون على استعداد لجعل الهلاميات المائية (الجدول 1). لجعل المواد الهلامية غير منقوشة، تأكد من أن [SH] = [الوك] بحيث يتم استهلاك جميع الفئات رد الفعل خلال البلمرة. إذا تم التخطيط photopatterning من المواد الهلامية، وتشمل كمية كبيرة من المجموعات الوظيفية ثيول خلال تشكيل هلام على أساس رياضيات الكيمياء (على سبيل المثال، 0،2-5 ملم، [SH]> [الوك]) عن رد فعل لاحق مع Pep1Alloc. ملاحظة: يجب أن تحتوي على هلام أكبر من 5 الوزن في المئة (٪ بالوزن) PEG4SH لضمان البلمرة السريع (خلال 5 دقائق). ومع ذلك، انخفاض وزن النطاق٪الصورة يمكن استكشاف إذا يستدعي التطبيق لالهلاميات المائية مع الرجوعية الدنيا (على سبيل المثال، <0.5 كيلو باسكال). يجب فحص البلمرة وتبعا لذلك لهذه المنخفضة التراكيب٪ بالوزن. وبالمثل، يمكن تعديل تركيز Pep1Alloc لتطبيقات مختلفة (على سبيل المثال، 0،2-5 ملم) كما ورد في الأدب لالببتيدات functionalized ثيول. ويوصى 18-21 تركيز LAP حول 0.067٪ بالوزن (2.2 ملم) أو أقل، كما وصفها، كما يمكن أن تركيزات أعلى يقلل بقاء الخلية. إعداد الحلول الأسهم من Pep1Alloc، Pep2Alloc، PEG4SH، وLAP تحت ظروف معقمة للثقافة الخلية بناء على حسابات في الجدول 1. لPep1Alloc وPep2Alloc، تزن كل على حدة الكتلة الاجمالية للPep1Alloc وPep2Alloc من الببتيد التوليف وتذوب في العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (PS) و 0.5 ميكروغرام / مل fungizone (FZ). تركيزات نموذجية من استعداد مجموعة الحلول الأسهم20-100 ملغ / مل من الببتيد. خلط هذه الأسهم لتحقيق الهلام مع الرجوعية النهائية ذات الصلة لتقديم الطلبات الأنسجة الرخوة (معامل يونغ ~ 0،5-5 كيلو باسكال). 22،23 قسامة ومخزن في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. لPEG4SH، تزن PEG4SH إلى أنبوب microcentrifuge معقمة وتذوب في برنامج تلفزيوني + PS + FZ. تركيزات نموذجية من هذا النطاق الأسهم حل 250-430 ملغ / مل (20-30٪ PEG4SH من حيث الوزن). لLAP، تزن LAP إلى أنبوب microcentrifuge معقمة وتذوب في برنامج تلفزيوني + PS + FZ إلى تركيز النهائي من 7.5 ملغ / مل. ملاحظة: إعداد حلول جديدة من PEG4SH وLAP يوصى به لكل التغليف أو تجربة هلام لضمان مرات البلمرة متسقة. إعداد العقيمة الحقنة نصيحة لقوالب تشكيل الهلاميات المائية. قطع بعناية النصائح الخروج من 1 مل الحقن باستخدام شفرة حلاقة، وبعد ذلك إزالة الغطاسون من مهاوي حقنة. غمر مهاوي حقنة والغطاسون في الايثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة لمكان د في غطاء خلية ثقافة عقيمة حتى يجف (30 دقيقة). إذا بقيت قطرات الزائدة من الايثانول داخل رمح حقنة، استخدام المكبس لدفعهم للخروج. إعداد العقيمة الزجاج الشرائح قوالب لتشكيل الهلاميات المائية. نقع الشرائح الزجاجية (مضاعفات 2) ومقاطع المطاط (0.254 مم، 2 قطعة صغيرة تستخدم الحشوات، مستطيل مع أقراص لكمات خارج، أو مربع الشكل الإطار) في 70٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة، ووضعه في العقيمة الخلية هود الثقافة لتجف. معطف نصف الشرائح تعقيمها مع طلاء مضادة لاصقة في توجيهات المصنع لمنع التصاق الجزء العلوي من الجل على سطح الشريحة (على سبيل المثال، إذا كان هناك 4 شرائح، سوف تكون مغلفة 2 الشرائح مع anti-لاصق). وستكون هذه بمثابة الجزء العلوي من العفن شريحة زجاجية. معايرة مصباح لقوالب حقنة أو شريحة زجاجية. ملاحظة: للحصول على هذه التجارب، تم استخدام مصباح قوس الزئبق مع الجمعية محول تصفية الخارجية و 365 فلتر خارجي نانومتر. مصباح الآخرينويمكن استخدام الصورة التي تنتج شدة المناسبة من الطول الموجي الطويل ضوء الأشعة فوق البنفسجية كما ذكرت من قبل الآخرين. 24-27 إرفاق عدسة الموازاة إلى نهاية دليل ضوء مليئة السائل لضمان كثافة حتى نسبيا الخفيفة في جميع العينات. حسب الحاجة، وضبط المسافة من نور الهداية من عينة (ق) لتحقيق حجم البقعة من شأنها أن تغطي عينات من الفائدة. وضع قالب قطع حقنة في حامل أنبوب microcentrifuge (لعقد العفن حقنة في وضع عمودي). عقد الاشعاع في ذروة طرف الحقنة حيث ستعقد العينات وضبط مصراع (٪ المفتوحة) لتحقيق شدة الضوء من 10 ميغاواط / سم 2 في 365 نانومتر. تسجيل الإعدادات تعديل لاستخدامها لاحقا. وضع قالب شريحة زجاجية على الجزء العلوي من سطح معقم (على سبيل المثال، والجزء العلوي من مربع ماصة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية). عقد للكشف عن الاشعاع في ذروة القالب شريحة زجاجية وضبط مصراع (٪ المفتوحة) لتحقيق شدة الضوء من 10 مW / سم 2 في 365 نانومتر. تسجيل الإعدادات تعديل لاستخدامها لاحقا. 2. هيدروجيل تشكيل وPhotopatterning إعداد الهلاميات المائية غير المزخرف. ملاحظة: عند هذه النقطة في البروتوكول، إذا الهلاميات المائية هي لاستخدامها في تطبيقات زراعة الخلايا، يجب أن يتم تنفيذ كل الخطوات اللاحقة تحت ظروف معقمة في خزانة معقمة أو غطاء محرك السيارة. مزيج الحلول الأسهم من PEG4SH، Pep2Alloc، Pep1Alloc، LAP، وبرنامج تلفزيوني + PS + FZ وفقا لحساب جدول (انظر الجدول 1 المثال). ماصة ينتج عن ذلك من حل جل السلائف بقوة لضمان حتى الاختلاط من الحل. إعداد الهلاميات المائية سميكة مصبوب في نصائح حقنة من قبل pipetting 10-20 ميكرولتر من محلول هلام السلائف (PEG / بيب / LAP / PBS) إلى غيض من معقمة، وقطع حقنة. جعل جل واحد لكل حقنة، حوالي 0.5-1.5 ملم على سميكة على حجم وقطر حقنة. ملاحظة: كميات أكبر يمكن استكشافها على أساسالمطلوب حجم هلام حيث قد توجد حدود قصوى على أساس حدود الأنتشارى لPep1Alloc خلال photopatterning و / أو المواد الغذائية / النفايات إلى / من خلايا مغلفة خلال زراعة الخلايا. إعداد الهلاميات المائية رقيقة في قوالب شريحة زجاجية عن طريق وضع طوقا المطاط (0،254 ملم سميكة) حول حواف الشريحة الزجاجية غير المغلفة. ماصة 5-10 ميكرولتر حل هلام السلائف (يجوز 5-10 المواد الهلامية ميكرولتر واحد أو عدة قبل pipetting واحد أو أكثر من النقاط من حل على شريحة واحدة) على شريحة زجاجية غير المغلفة ووضع شريحة زجاجية مغلفة مع المضادة لللاصقة على رأس من الحل هلام (المواد الهلامية أكبر حجما قد يصل إلى حجم شريحة زجاجية، يجوز اعتمادا على التطبيق النهائي). تأمين الشرائح الزجاجية مع مقاطع الموثق صغيرة لتحقيق الاستقرار. قوالب مكان تحت مصباح وتعيين كثافة مصباح (على سبيل المثال،٪ مصراع مفتوح) لتحقيق 10 ميغاواط / سم 2 على سطح هلام لقوالب حقنة طرف أو قوالب شريحة زجاجية على أساس القياسات في الخطوة 1.7.2 و1.7.3، على التوالي. تطبيق ضوء ل1-5 دقيقة للسماح البلمرة كاملة من المواد الهلامية. استخدام الوقت البلمرة أقصر عن المواد الهلامية مع محتوى أعلى PEG4SH (8٪ بالوزن أو أكثر، 1 دقيقة)، وتعد لالهلام مع انخفاض محتوى PEG4SH (5-8٪ بالوزن، 3-5 دقيقة) لإنتاج الهلاميات المائية بلمرة بالكامل مع الرجوعية ضمن مجموعة من الأنسجة الرخوة (0،5-5 كيلو باسكال). مكان المواد الهلامية من قوالب حقنة معلومات سرية إلى لوحة العقيمة غير المعالجة 48-جيدا، والشرائح مكان الزجاج في طبق العقيمة. شطف 3 × 15 دقيقة مع مستنبت الخلية أو العازلة المناسبة (على سبيل المثال، في برنامج تلفزيوني + PS + FZ العازلة رد فعل المان و) على أساس التجارب المخطط لها، كما هو موضح أدناه. إعداد منقوشة الهلاميات المائية. مزيج الحلول الأسهم من PEG4SH، Pep2Alloc، LAP، وبرنامج تلفزيوني + PS + FZ وفقا لحساب جداول البيانات، وترك التجولات مجانية (0،2-5 ملم) لرد فعل لاحق مع Pep1Alloc. ماصة الحل السلائف بقوة لضمان حتى الاختلاط من الحل. إعداد الهلاميات المائية السراء والضراء على النحو المنصوص عليه في الخطوات 2.1.2 إلى 2.1.6. ملاحظة: لا تضع المواد الهلامية في متوسط ​​النمو قبل photopatterning. قد يتم امتصاصها التجولات خالية من الأنواع في وسط النمو (على سبيل المثال، ثاني كبريتيد تشكيل مع البروتينات التي تحتوي على ثيول) ولن تسمح الزخرفة من هلام دون خطوات معالجة إضافية (على سبيل المثال، والحد من السندات كبريتيد). إعداد حلول Pep1Alloc (تركيز نهائي ~ 3-20 ملغ / مل) و 2.2 ملي LAP. تغطية المواد الهلامية شكلت قبل مع Pep1Alloc حل / LAP واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. إزالة الزائدة حل Pep1Alloc / LAP. إذا كان مصبوب المواد الهلامية في طرف الحقنة، واستخدام ملعقة لنقل بعناية المواد الهلامية من لوحة 48-جيدا حيث أنها تحتضن لشريحة زجاجية معقمة للالزخرفة. وضع الضوئية الرئيسية مع النمط المطلوب مباشرة على رأس المواد الهلامية مصبوب شريحة syringe- والزجاج. تأكد من أن الجزء المطبوع من القناع يلمس هلام لبات الأمثلالإخلاص ERN (أي قناع يجب قراءة الصحيح ويكون الجانب مستحلب لأسفل). مكان العينات تحت مصباح وأشرق لمدة 1 دقيقة مع إعدادات المصباح يستخدم لالشرائح الزجاجية (الخطوة 1.7.3). بعد الزخرفة، ومكان المواد الهلامية حقنة مصبوب في لوحة المعالجة العقيمة، 48-جيدا ثقافة غير الأنسجة، ومكان الشريحة الزجاجية مصبوب المواد الهلامية التي انضمت إلى الشرائح الزجاجية في طبق العقيمة. شطف 3 × 15 دقيقة مع مستنبت الخلية أو العازلة المناسبة (على سبيل المثال، في برنامج تلفزيوني + PS + FZ العازلة رد فعل المان و) على أساس التجارب المخطط لها. 3. تصور والكمي لPhotopatterning الفحص المان لكشف وتحديد التجولات الحرة في Photopatterned الهلاميات المائية. إعداد عازلة المان في رد الفعل، والعمل الحل السيستين، والمعايير، وكاشف المان وكما هو مذكور أدناه. لالعازلة رد فعل المان وحل 2.4 غرام فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (نا 2 هبو4) و 74.4 ملغ ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) في 200 مل DIH 2 O (0.1 م نا 2 هبو 4، 1 ملم EDTA). ضبط درجة الحموضة إلى 7.5-8 مع حلول هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) أو حامض الفوسفوريك (H 3 PO 4). لسيستين الحل العمل، ويحل السيستين 5.27 ملغ في 15 مل العازلة رد فعل (2 مم السيستين). لمعايير سيستين، وتمييع الحل العمل السيستين في المخزن رد فعل لتركيز النهائي من 2، 1.5، 1.25، 1، 0.75، 0.5، 0.25، و 0 مم السيستين. لالكاشف المان، وتذوب 4 ملغ كاشف المان في رد فعل العازلة 1 مل. يصوتن لإذابة تماما كاشف للالمان و. قياس تركيز التجولات الحرة في المواد الهلامية مع فحص المان في (الشكل 2). ملاحظة: "رقيقة" 5 الهلاميات المائية ميكرولتر، مصبوب بين الشرائح الزجاجية، وصفت في الإجراء التالي، وأوصى للسماح الانتشار السريع للر كاشف المان لhrough هلام (أي، فإنه يأخذ الكاشف وقتا أطول لنزع فتيل خلال المواد الهلامية سميكة). تحديد حجم هلام منتفخة من المواد الهلامية "رقيقة" 5 ميكرولتر (V S) بناء على الحجمي تورم النسبة، س. جعل ثلاثة 20 ميكرولتر المواد الهلامية "سميكة" باستخدام قوالب حقنة. مكان المواد الهلامية في المخزن رد فعل المان لمدة 24 ساعة وبعد ذلك تزن (التوازن تورم كتلة، M S). يجفد المواد الهلامية وبالتالي وزن (وزن جاف، M D). باستخدام الجماهير قياسها عن المواد الهلامية سميكة، وحساب الحجمي تورم نسبة 28 من س = 1 + ρ البوليمر / ρ المذيبات (M S / M D -1) حيث ρ البوليمر = 1.07 جم / سم 3 لPEG، 29 ρ المذيب = 1.0 جم / سم 3 لبرنامج تلفزيوني / H 2 O. حساب كتلة جافة النظرية من هلام لاستخدامها في الفحص المان في (هنا والمواد الهلامية 5 ميكرولتر "رقيقة" وعادة ما تكون ش(سيد))، عن طريق جمع الجماهير من المكونات الفردية PEG4SH، Pep1Alloc، وPep2Alloc (M D = M PEG4SH + M + M Pep1Alloc Pep2Alloc). على سبيل المثال، هلام 5 ميكرولتر تحتوي على 10٪ بالوزن PEG4SH يحتوي على حوالي 0.000535 غرام PEG وفقا لحسابات M PEG4SH = 0.005 سم 3 × 1.07 جم / سم 3 × 0.10. ويمكن حساب Pep1Alloc وPep2Alloc الجماهير بطريقة مماثلة استنادا٪ بالوزن في حل (انظر جدول للقيم)، على افتراض ρ ≈ 1.0 جم / سم 3 لهذه المحاليل المائية. ملاحظة: هلام أيضا قد يكون المجفف وزنه بدلا من حساب الكتلة الجافة النظرية. ومع ذلك، قد يكون تحديا لقياس باستمرار الكتلة الجافة من رقيقة، 5 المواد الهلامية ميكرولتر. وبناء على وزن جاف توقع وقيمة س تحديدها من المواد الهلامية "سميكة"، وحساب كتلة متورمة توقع M S لهلام "رقيقة" (المعادلة في الخطوة 3.1.2.1.1). نفترض أن ρ ≈ 1.0 جم / سم <sup> 3، ثم M S ≈ V S. استخدام هذا يحسب V S لأداء الاختبار الكمي المان و. ملاحظة: ينصح الأسلوب أعلاه لتحديد V الصورة لالهلام منتفخة مثل الهلام 5 ميكرولتر "رقيقة" من الصعب نقل عن وزنها. تشكيل الهلاميات المائية رقيقة لالزخرفة كما هو موضح في القسم 2.2 (5 حجم ميكرولتر). على وجه التحديد، وجعل المواد الهلامية مع التجولات الحرة الزائدة و "نمط" نصف هذه العينات مع Pep1Alloc باستخدام ساترة واضحة لإغراق فضح هلام كامل مع الضوء (على سبيل المثال، 6 مجموع المواد الهلامية مع ثيول الزائد: 3 معدلة غير'patterned 'و 3' نمط '). ملاحظة: للحصول على هذا الاختبار، "منقوشة" المواد الهلامية هي الفيضانات تعرضها للضوء دون الضوئية الرئيسية. وتستخدم هذه الطريقة لتحديد العدد الإجمالي للالتجولات حرة المستهلكة في عينة هلام كامل وإظهار مدى كفاءة التجولات مجانا يمكن تعديلها مع الببتيد. من هذه المعلومات،ويمكن توقع عدد من التجولات حرة المستهلكة خلال الزخرفة مع الضوئية الرئيسية على أساس سمك جل ومنطقة نمط (المناطق التي تعرضت للضوء). المكان "نمط" وغير'patterned 'المواد الهلامية في الآبار لوحة 48-جيدا وشطف 3 × 15 دقيقة مع العازلة رد فعل المان والسماح لانتشار الأنواع غير المتفاعل من هلام والتوازن تورم تحدث. إضافة العازلة رد فعل إضافية المان الى المواد الهلامية تشطف بحيث V الصورة مع رد فعل عازلة من مضاعفات 20 ميكرولتر. على سبيل المثال، إذا كان توقع V S هو 15 ميكرولتر، إضافة عازلة رد فعل 5 ميكرولتر (20 ميكرولتر)، وإذا كان توقع V S 30 ميكرولتر، إضافة 10 العازلة رد فعل ميكرولتر (40 ميكرولتر). ماصة للمعايير السيستين في الآبار الفردية (لا تحتوي على المواد الهلامية) من لوحة 96-جيدا في مضاعفات 20 ميكرولتر اعتمادا على الحجم المستخدم في الخطوة السابقة (أي، إذا كانت الخطوة السابقة V S + اضافية رد فعل بuffer = 40 ميكرولتر، إضافة 40 ميكرولتر من كل مستوى لآبار فارغة الفردية). تمييع كاشف المان في رد فعل العازلة (مضاعفات 180 رد فعل ميكرولتر عازلة + 3.6 ميكرولتر كاشف المان؛ وعلى سبيل المثال، 183.6 لمدة 20 ميكرولتر أو 367.2 ميكرولتر 40 ميكرولتر في خطوة 3.1.2.5). إضافة كاشف المخفف المان في الآبار التي تحتوي على المواصفات والعينات. لمدة 20 عينات ميكرولتر، إضافة 183.6 ميكرولتر حل كل بئر. ضعف هذا المبلغ من كاشف المخفف المان ل40 عينة ميكرولتر (أو مقياس أساس وفقا لذلك على حجم العينة). احتضان أو وضع على شاكر لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة (في درجة حرارة الغرفة) أو حتى لون من الحل يطابق لون من المواد الهلامية عن طريق التفتيش البصري لضمان نشر ما يكفي من الأصفر dianion 2-نيترو-5-thiobenzoate (TNB 2-)، والذي تم إنشاؤه بناء على رد فعل من كاشف المان مع التجولات الحرة، من هلام. أخذ 100 ميكرولتر من محلول من العينات والصورةtandards وتضع في الآبار لوحة 96-جيدا. قراءة الامتصاصية في 405 نانومتر على قارئ لوحة. لمعالجة البيانات، رسم المنحنى القياسي (عينات من الخطوة 3.1.1.3) (الامتصاصية مقابل التركيز) وتناسب وظيفة خطية. باستخدام وظيفة الخطية، وتركيز التجولات الحرة في حل "هلام المخفف" (هلام + رد فعل العازلة) يمكن أن يحسب على أساس قراءات الامتصاصية. وأخيرا، مع الأخذ بعين الاعتبار "التخفيف" مع العازلة رد فعل، تحديد تركيز ثيول الحرة في المواد الهلامية من دون رد فعل العازلة. (على سبيل المثال، إذا كان المخفف 15 ميكرولتر هلام مع العازلة رد فعل 5 ميكرولتر، ضرب من قبل 20/15). تصور photopatterns مع كاشف المان في (الشكل 3A). نقع الهلاميات المائية رقيقة منقوشة مع Pep1Alloc العازلة في رد فعل المان لمدة 1 ساعة. إزالة عازلة رد فعل الزائد عن طريق المسح بلطف حول حواف هيدروجيل بمنديل ورقي. كاشف ماصة المان مباشرة على سطح هلام. على الفور صورة على ضوء المجهر في 10X أو مجهر تشريحي مع كاميرا اللون. يجب تصوير المواد الهلامية على الفور بسبب أنماط التصور سوف تتبدد في غضون 5 دقائق كما TNB الأصفر 2- أيون التي تنتجها انشقاق من كاشف المان وعلى رد فعل مع التجولات في المنطقة غير منقوشة ينشر في جميع أنحاء هلام: مذكرة. غير نمط-المناطق تظهر الصفراء بصوت ضعيف للعين المجردة. لأفضل قرار وأنماط أصغر، التكبير (على سبيل المثال، استخدام المجهر) هو مطلوب. تصور Photopatterns مع الببتيدات نيون (الشكل 3B). لتصور أنماط مع دقة أعلى أو في ثلاثة أبعاد، photopattern على Pep1Alloc AF488 المعدلة (أو ما شابه ذلك الببتيد الفلورسنت) إلى المواد الهلامية في الخطوة 2.2. الصورة على المجهر الفلورسنت. ويمكن استخدام المجهر متحد البؤر هنا لاتخاذ ض الواحدصور ACK من هلام بحيث يمكن ملاحظة النمط في X-، Y-، وطائرات ض. ملاحظة: مع مضان، لا بد من المواد الهلامية محمية من الضوء لضمان استقرار fluorophore AF488 والحد الأقصى مضان. المواد الهلامية لا تحتاج للتصوير على الفور منذ الببتيد الفلورسنت مستقرة إلى حد ما إذا محمية من الضوء (مخزن في حاويات مغلفة احباط في 4 درجات مئوية). 4. تغليف الخلايا في الهلاميات المائية وPhotopatterning جمع وإعداد الخلايا لتغليف. وفقا للإجراءات زراعة الخلايا الثديية معقمة القياسية، ويعرض للتريبسين وجمع خلايا الفائدة من لوحات. إخماد التربسين مع متوسط النمو بعد حدوث انفصال (على سبيل المثال، لقارورة T-75، 5 مل التربسين، يطفئ مع 5 مل المتوسطة، وشطف لوحة مع 5 مل المتوسطة لمجموع 15 مل). ملاحظة: يمكن أن تختلف الأوقات Trypsinization بين أنواع الخلايا ولكن يحدث عادة بين 5 و 15 دقيقة. detachmen خلية البديلوكلاء ر (على سبيل المثال، Versene) التي يمكن استخدامها لجمع الخلايا إذا رغبت في ذلك. عدد الخلايا (ما لا يقل عن 100 أو في بروتوكول الشركة المصنعة) من aliquots من تعليق خلية trypsinized باستخدام عدادة الكريات أو غيرها من جهاز عد الخلايا في حين الطرد المركزي تعليق خلية السائبة (90-110 x ج، 5 دقائق). اعادة تعليق بيليه الخلية بعد الطرد المركزي في حجم الحد الأدنى من برنامج تلفزيوني أو متوسطة النمو وإعادة العد إذا كان تعليق خلية trypsinized الأولي هو تمييع للغاية. اعادة تعليق الخلايا في حجم الحد الأدنى من برنامج تلفزيوني وأجزاء قسامة لكل حالة هلام في أنابيب microcentrifuge حتى لا تكون هناك 5000 خلية / ميكروليتر عند مزجه مع الحل هلام (قبل البلمرة). ملاحظة: قسامات خلية نموذجية تحتوي على 300،000-500،000 الخلايا وما يكفي لجعل 60-100 ميكرولتر من تعليق هلام / خلية والتي يمكن استخدامها لمدة 3-5 × 20 الهلام ميكرولتر مع 5000 خلية / ميكروليتر. يمكن استخدام أعلى أو أقل كثافة خلية لتغليف، اعتمادا على كمية من خلية خليةمقابل خلية مصفوفة الاتصال المطلوب، على التوالي، وينبغي أن تحدد لكل طلب. الطرد المركزي خلية / قسامات برنامج تلفزيوني (90-110 x ج، 5 دقائق). نضح بعناية في برنامج تلفزيوني من بيليه الخلية في أنبوب microcentrifuge الحق قبل التغليف. ملاحظة: إذا خلايا حساسة للالقص القوات، ويمكن التخلص من الخطوة الطرد الثانية عن طريق عد (على سبيل المثال، عدادة الكريات)، وبعد ذلك aliquotting تعليق خلية trypsinized (التربسين + الإعلام + الخلايا) إلى أجزاء اللازمة لكل حالة هلام. وطرد هذه قسامات مرة واحدة (90-110 x ج، 5 دقائق) ويستنشق التربسين + وسائل الإعلام خارج، وترك بيليه خلية لتغليف. تغليف الخلايا في الهلاميات المائية غير المزخرف. مباشرة بعد الشفط برنامج تلفزيوني أو تعليق الخلايا مكعبات في PEG4SH، Pep2Alloc، Pep1Alloc، LAP، وبرنامج تلفزيوني + PS + FZ كما تحسب في جدول البيانات إلى تركيز النهائي من 5000 خلية / ميكروليتر. العفن وبلمرة الهلاميات المائية كما أن described في الخطوات 2.1.2 إلى 2.1.6. ملاحظة: عندما التغليف الخلايا في قوالب شريحة زجاجية، يجب توخي الحذر عند إزالة أكبر شريحة بعد البلمرة لمنع قص هلام، والذي يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية. للمساعدة في إزالة هلام من العفن، قد يتم وضع قوالب الشرائح في برنامج تلفزيوني العقيمة أو متوسطة النمو بعد البلمرة الرطب طوقا وهيدروجيل، مما يجعل من الأسهل لإزالة الشريحة العليا. وهناك طريقة لمنع هذا القص تماما من خلال استخدام قوالب حقنة. المواد الهلامية شطف 3 × 10 دقيقة في المتوسط ​​نمو لإزالة الأنواع غير المتفاعل وLAP الزائد. احتضان المواد الهلامية في وسط النمو عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى نقطة الوقت المطلوب لمزيد من التحليل. تجديد المتوسط كل 48 ساعة أو تصميما للتطبيق (على سبيل المثال، فترة الرضاعة نموذجي لنوع خلية معينة والمتوسطة). تغليف الخلايا وPhotopatterning في وجود خلايا. مباشرة بعد الشفط برنامج تلفزيوني،تعليق الخلايا مكعبات في PEG4SH، Pep2Alloc، LAP، وبرنامج تلفزيوني + PS + FZ كما تحسب في جدول البيانات إلى تركيز النهائي من 5000 خلية / ميكروليتر. ترك التركيز المناسب من التجولات مجانية (على سبيل المثال، 2 مم) لرد فعل لاحق مع Pep1Alloc. العفن، تتبلمر، والهلاميات المائية نمط كما هو موضح في الخطوات 2.2.2 إلى 2.2.8. المواد الهلامية شطف 3 × 10 دقيقة في المتوسط ​​النمو بعد الزخرفة لإزالة الأنواع غير المتفاعل وLAP الزائد. احتضان المواد الهلامية في وسط النمو عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حتى نقطة الوقت المطلوب لمزيد من التحليل. تجديد المتوسط ​​كل 48 ساعة أو تصميما للتطبيق. 5. تحديد آخر الجدوى والتمثيل الغذائي للخلايا مغلف أداء لايف / الميت السمسة الفحص لتحديد بقاء الخلية مغلفة (الشكل 4A). إزالة المتوسطة النمو من المواد الهلامية وشطف 3 × 15 دقيقة مع برنامج تلفزيوني للسماح للنشر المتوسطة من زإلس. ذوبان الجليد الحية / الميت حلول السمسة مقايسة (إيثيديوم homodimer-1 وcalcein AM). إضافة 2 ميكرولتر من 2 مم إيثيديوم homodimer-1 و 0.5 ميكرولتر من 4 مم calcein AM حلول ل1 مل العقيمة برنامج تلفزيوني. دوامة لضمان خلط كاملة. إضافة 300 ميكرولتر حل تلطيخ لكل حقنة قالب هلام في لوحات 48-جيدا، أو ما يكفي لتغطية سطح الجل على شريحة زجاجية في طبق العقيمة، واحتضان لمدة 45 دقيقة. إزالة حل تلطيخ الزائد وشطف لإزالة الصبغة الزائدة من المواد الهلامية (3 × 15 دقيقة مع PBS). صورة على المجهر متحد البؤر (الصور ض المكدس) أو على مجهر برنامج التحصين الموسع ومضان مع القدرة ض المكدس في 10X و488/525 نانومتر السابق / م. تحديد عدد خلايا قابلة للحياة من خلال إبراز ض مداخن وإحصاء عدد الحية (الخضراء في جميع أنحاء الجسم خلية) والميتة (نواة الحمراء) الخلايا مع برامج التصوير. أداء فحص النشاط الأيضي لتحديد نشاط الخلايا بعد التغليف (فيقوإعادة 4B). 24 ساعة قبل لفحص والأعلاف مغلفة الخلايا مع متوسط ​​نمو جديدة. ملاحظة: إضافة المتوسطة على عدد قليل من آبار اضافية (لا تحتوي على المواد الهلامية أو المواد الهلامية مع أي خلايا)، والتحكم (قراءات الخلفية). في نقطة زمنية من الفائدة، وذوبان الجليد MTS حل كاشف. ملاحظة: من أجل تحديد النشاط الأيضي مع مرور الوقت، لذا ينصح باستخدام أي نقطة زمنية الأولية (12-24 ساعة بعد التغليف) كمرجع للمقارنة إلى نقطة زمنية لاحقة. إضافة MTS الكاشف إلى كل بئر (20 ميكرولتر لكل 100 متوسطة النمو ميكرولتر). احتضان عينات من 1-4 ساعة على 37 درجة مئوية، وCO 2 5٪، في تعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: يجب أن تكون أوقات الحضانة كاف لخلايا للحد من MTS، والسماح نشر المنتج formazan من هلام. ونتيجة لذلك، والمواد الهلامية سمكا مثل الهلام حقنة طرف قد تتطلب أوقات أطول حضانة (~ 4 ساعات) للحد من MTS كافية ونشرها. ماصة 100 ميكرولتر خفض MTS / متوسطةإلى تنظيف الآبار من 96 لوحة جيدا وسجل الامتصاصية في 490 نانومتر على قارئ لوحة. طرح الامتصاصية الخلفية للآبار دون الخلايا من القيم الامتصاصية عينة لتوليد القيم الامتصاصية يحدد الخط.

Representative Results

إعداد وإجراء لphotoencapsulate الخلايا والمواد الهلامية photopattern في وقت لاحق تحتوي على خلايا مغلفة هو مبين في الشكل رقم 1، ومثال لإعداد الحلول الأسهم لتشكيل يتم توفير٪ هلام 10 بالوزن في الجدول 1. عن طريق الجدول 1، وكمية من أحادية (PEG4SH ، ويتم احتساب Pep2Alloc، ± Pep1Alloc) وphotoinitiator (LAP) المطلوبة لبلمرة الهلاميات المائية. وبناء على هذه الحسابات، يتم إعداد الحلول الأسهم من PEG4SH، Pep1Alloc، Pep2Alloc، وLAP ومختلطة مع وبدون Pep1Alloc لتشكيل وphotopatterning المواد الهلامية، على التوالي (الشكل 1A). وفي وقت لاحق، يتم جمع الخلايا من لوحات، وعدها، وطرد بكميات مناسبة لتغليف (الشكل 1B). وإعادة تعليق بيليه خلية في حل تشكيل هلام (الببتيد / بوليمر / LAP في برنامج تلفزيوني)، ويتم نقل المزيج من الخلايا / مونومر على الزجاج أو حقنة مولس. يتم تغليف الخلايا داخل هيدروجيل بناء على طلب من الضوء (1-5 دقائق من 10 ميغاواط / سم 2 في 365 نانومتر) (الشكل 1C). لphotopatterning (1D الشكل)، تنقع المواد الهلامية مع Pep1Alloc وLAP لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة و 30 دقيقة، مما يسمح للنشر الببتيد والبادئ في مصفوفة بلمرة. وتغطي هذه المواد الهلامية الببتيد محملة photomasks مع أنماط المطلوب ويتعرض لجرعة ثانية من الضوء (1 دقيقة) لتصريف الببتيدات لالتجولات الحرة داخل المصفوفة. وفقط مرتبطة الحبال قلادة تساهميا إلى هلام في المناطق التي تعرضت للضوء، وتسهيل التفاعلات خلية مصفوفة المناسبة ومحاكاة الخواص الميكانيكية والكيميائية الحيوية الرئيسية المكروية الخلية الأم تجاه التحقيق وظائف الخلايا ومصير في المختبر. يوفر فحص المان في طريقة سطحي وغير مكلفة لتحديد تعديل جل والتأسيس الببتيد داخل photopatteركائز rned. منقوشة والمواد الهلامية غير منقوشة (أي المواد الهلامية مع أو بدون تعديل الببتيد) تنقع في المخزن رد فعل بعد البلمرة المان و. بعد ذلك، يتم وضع معايير السيستين والمواد الهلامية غارقة في المخزن في لوحات 48-جيدا وحضنت مع كاشف المان في (الشكل 2A، يسار). بعد 1 ساعة و 30 دقيقة، وتوضع aliquots من العينات في الآبار الفردية من لوحة 96-جيدا، ويتم تسجيل الامتصاصية في 405 نانومتر. يتم رسم منحنى المعايرة (الشكل 2A، يمين) من المعايير السيستين (الامتصاصية مقابل التركيز، وصالح الخطي)، ويمكن تحديد كمية التجولات الحرة في المواد الهلامية على أساس عامل التخفيف بهم. وتظهر هذه التركيزات ثيول المجانية لمختلف البلمرة وphotopatterning شروط هلام 10٪ بالوزن في الشكل 2B. المواد الهلامية بلمرة ل 1 أو 5 دقائق دون Pep1Alloc (أشرطة زرقاء، I = 1 دقيقة والثاني = 5 دقيقة) لديهم تركيزات ثيول حرة مماثلة إحصائيا، مما يدل رقبعة يحدث رد الفعل السريع ودبق كاملة داخل 1 دقيقة (الذيل يومين اختبار (ت)، ص> 0.05). وهكذا، والتعرض الإضافي للضوء (2-5 دقائق) لا يؤدي إلى مزيد من تحويل المجموعات الوظيفية. كانت غارقة المواد الهلامية بلمرة لمدة 1 دقيقة دون Pep1Alloc مع Pep1Alloc (3 ملغ / مل)، وLAP (2.2 ملم) لمدة 30 و 90 دقيقة (أشرطة خضراء، والثاني = 30 دقيقة والرابع = 90 دقيقة)، ويتعرض لجرعة ثانية من الضوء لمدة 1 دقيقة. انخفاض التجولات مجانية (60-80٪ فيما يتعلق بحالة 1 دقيقة) يشير التعديل كفاءة من المواد الهلامية مع العظة قلادة في ظل هذه الظروف. إذا كان المطلوب أعلى التعديل، وزيادة تركيزات حل Pep1Alloc يمكن استخدام الوصول إلى Pep1Alloc إلى التجولات الحرة في أكثر تمييع حلول الببتيد قد يحد من التحويل؛ على سبيل المثال، وجدنا أن تركيزات تصل إلى 20 ملغ / مل Pep1Alloc تنتج> 90٪ تحويل التجولات الحرة. فريد، وأنماط من الببتيدات تضاف إلى هيدروجيل قديمكن تصوير بسرعة مع كاشف المان في (الشكل 3A، أقل من 5 دقائق). ومع ذلك، يتم فقدان التصور للنمط على مر الزمن (أكثر من 5 دقائق) بسبب نشر الأصفر TNB 2- dianion من خلال الهلام. لتحسين دقة التصوير ومراقبة أنماط في ثلاثة أبعاد (X-، Y-، وض الطائرات) وبحضور من الخلايا، يمكن أن تستخدم الببتيد الفلورسنت إضافة (AF488Pep1Alloc). في الشكل 3B X-، وترد Y- وض التوقعات من مداخن صورة التي اتخذت مع المجهر متحد البؤر، مما يدل على قرار نمط (مقياس ميكرون). ما يقرب من (94 ± 2) تظل٪ و (94 ± 1)٪ من hMSCs مغلفة ضمن المواد الهلامية القابلة للتحلل (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) (أجسام الخلايا الخضراء) قابلة للحياة بعد 1 و 6 أيام التغليف، على التوالي، مع عدد قليل من الخلايا الميتة (نواة الحمراء ) لاحظ الشكل (4A). وعلاوة على ذلك، hMSC لوحظ نشر في 6 أيام بعد التغليف ( <st رونغ> الشكل 4A، أقحم)، مما يشير إلى أن الخلايا يمكن إعادة تشكيلها والتفاعل مع هذه المصفوفات MMP للتحلل مع تعديل RGDS ملزم إنتغرين. المقايسات النشاط الأيضي أجريت على خلايا مغلفة في المواد الهلامية غير القابلة للتحلل (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 و 3 أيام بعد التغليف (الشكل 4B) توفير قدر الثاني من بقاء الخلية وتثبت أن الخلايا لا تزال نشطة لمختلف الظروف photoencapsulation وphotopatterning اختبار مع فحص المان في (الشكل 2B). على وجه الخصوص، لا يوجد فرق كبير في النشاط الأيضي بين 30 دقيقة و 90 دقيقة حضانات مع Pep1Alloc + LAP (شروط الثالث والرابع) والتغليف الأولي (شروط الأول والثاني)، مشيرا إلى أن هذا الإجراء هو مناسب لتطبيقات photopatterning في وجود خلايا مغلفة (ثنائي الطرف اختبار (ت)، ص> 0.05). 2fig1.jpg "/> الشكل 1: الإعداد لتغليف الخلايا داخل الهلاميات المائية وphotopatterning في وقت لاحق مع جديلة البيوكيميائية (A) تعد الحلول المالية من macromers وphotoinitiator والمختلط (PEG4SH = العمود الفقري، Pep2Alloc = تشعبي، Pep1Alloc = قلادة شاردة لاصقة (RGDS)، LAP = photoinitiator ). يتم جمع (ب) خلايا لتغليف. يتم خلط (C) الخلايا مع حلول macromer بدون أو مع الببتيدات integrin ملزمة (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP أو PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP، على التوالي)، ويتم تغليف عند التعرض للضوء. (D) المواد الهلامية التي تحتوي على مجموعات ثيول الزائدة خلال تشكيل هلام (هنا، PEG4SH / Pep2Alloc / LAP، شكلت مع 2 مم الزائد ثيول) قد يكون نمط مع الاشارات الحيوية عن طريق إضافة لاحقة من الببتيدات functionalized مع مجموعة الوك واحدة (Pep1Alloc، على سبيل المثال، RGDS، IKVAV، الخ) لتعزيز التصاق الخليةضمن مناطق محددة من هلام. هنا، يتم إظهار الزخرفة من المواد الهلامية مع RGDS-fluorescently المسمى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. يتم تحضين إعداد مقايسة الكمي المان والنتائج لتقييم تعديل الهلاميات المائية منقوشة (A) هلام والمعايير السيستين في لوحات 48-جيدا مع كاشف المان و: الرقم 2. يتم رسم منحنى القياسية الخطية لتحديد تركيز السيستين في عينات هلام. تدرج (ب) التجولات الحرة الزائدة في الهلاميات المائية خلال تشكيل هلام والمستهلكة على الزخرفة مع قلادة الوك الببتيد (I = 1 دقيقة البلمرة، الثاني = 5 دقائق البلمرة، الثالث = 30 دقيقة الحضانة مع Pep1Alloc؛ الرابع = 90 دقيقة حضانة واي Pep1Alloc عشر. كل من الثالث والرابع بلمرة ونمط مع ضوء لمدة 1 دقيقة). أظهرت البيانات توضح المتوسط (ن = 3) مع أشرطة الخطأ إظهار الخطأ المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 3: الفحص المان والصور الفلورسنت لتصور الهلاميات المائية photopatterned كاشف (A) المان قد يتم استخدامها للكشف بسرعة أنماط (خطوط) في X- والطائرات ص (أصفر = المنطقة unpatterned، شريط مقياس = 1 مم). ويمكن استخدام (B) الببتيدات الفلورسنت لمراقبة أنماط في X-، Y-، وض طائرات (أخضر = المنطقة نقوش و 200 شريط ميكرون الحجم؛ 10X الهدف المياه غمس، تحويلة / إم 488/525 نانومتر).large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. . الشكل 4: الجدوى والنشاط الأيضي للخلايا داخل الهلاميات المائية photopatterned غير القابلة للتحلل (أ) مثال متحد البؤر ض المكدس (ض الإسقاط، 10X الهدف المياه غمس) من قابل للحياة (أخضر، تحويلة / إم 488/525 نانومتر) والأموات hMSCs (أحمر، تحويلة / إم 543/580 نانومتر) مغلفة داخل الهلاميات المائية 24 ساعة بعد التغليف (مقياس بار = 200 ميكرون). خلايا تنتشر داخل هذه الهلاميات المائية بعد 6 أيام التغليف (صورة أقحم، مقياس بار = 50 ميكرون). (ب) خلايا تنشط عملية الأيض 1 و 3 أيام (القضبان الداكنة والفاتحة، على التوالي) بعد التغليف لبلمرة المختلفة (I = 1 دقيقة البلمرة، الثاني = 5 دقائق البلمرة) والشروط الزخرفة (الثالث = 30 دقيقة الحضانة مع Pep1Alloc ؛ الرابع = 90 دقيقة incubatioن مع Pep1Alloc. كلا بلمرة ونمط مع ضوء لمدة 1 دقيقة). أظهرت البيانات توضح المتوسط (ن = 3) مع أشرطة الخطأ إظهار الخطأ المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الجدول 1: الإعداد مثال لحساب كميات من الحلول الأسهم لجعل الهلاميات المائية الخلايا في جدول البيانات التي يتم تسليط الضوء الأزرق يشير المعلمات المعرفة من قبل المستخدم؛. وتحسب الكميات الأخرى على أساس هذه الإعدادات. ويسلط الضوء على حجم النهائية لكل حل الأسهم لجعل هلام البرتقال. الخلايا البيضاء تحتوي على الصيغ المستخدمة لحساب الكميات النهائية على أساس المعايير التي يحددها المستخدم. لاحظ أن تركيز 2.2 ملي LAP ما يعادل 0.067٪ بالوزن.

Discussion

الإجراء المقدمة هنا يوضح التقنيات لphotoencapsulate الخلايا داخل الهلاميات المائية التي شكلتها ثيول-إيني انقر الكيمياء وبعد ذلك photopattern المواد الهلامية مع الاشارات الكيميائية الحيوية. استخدام الضوء لتشكيل البداية الهلاميات المائية يسمح خلط متجانس وتعليق الخلايا ضمن حل البوليمر قبل البلمرة. السريع البلمرة "أقفال" هلام في شكل قالب محدد وبتغليف علقت الخلايا داخل شبكة هيدروجيل. أيضا قد يكون مصبوب المواد الهلامية في العديد من الأشكال المختلفة (على سبيل المثال، الشرائح الزجاجية أو نصائح حقنة) اعتمادا على التطبيق النهائي المطلوب. على سبيل المثال، خلايا مغلفة للثقافة 3D في الهلاميات المائية تعلق على الشرائح الزجاجية مفيدة بشكل خاص لتطبيقات التصوير كما يقتصر ضوء توهين ضمن عينة رقيقة. قوالب حقنة يمكن أن تستخدم لتغليف السريع للخلايا، والسماح لعدد أكبر من العينات ليكون مستعدا في وقت قصير (مقارنة مع شريحة زجاجيةق) التي يمكن استخدامها لاجراء تجارب تتطلب أعداد كبيرة من الخلايا مثل التدفق الخلوي أو QPCR. وفي وقت لاحق، وهذه المواد الهلامية ثم قد يكون نمط مع الاشارات الكيميائية الحيوية للحصول الاستجابات الخلوية المرغوبة مثل التمايز أو الغزو. 30،31

فحوصات للسلامة والنشاط الأيضي تشير إلى بقاء خلايا لنظام الظروف المادية والزخرفة المقدمة. لاحظ أن النشاط الأيضي تم رصد حتى يوم 3 في المواد الهلامية غير القابلة للتحلل (RGKGRK الببتيد تشعبي) لتقييم الآثار الأولية لالبلمرة والزخرفة الظروف على وظيفة الخلية. بالإضافة إلى ذلك، فحص سلامة غشاء (الحي / الميت الجدوى / سمية الخلايا تلطيخ) من hMSCs في 1 و 6 أيام بعد التغليف في المواد الهلامية وضعت مع الببتيد تشعبي للتحلل (GPQGIWGQ) يدعم أن الخلايا لا تزال قابلة للحياة وانتشرت في 1 أسبوع في الثقافة. تم الإبلاغ عن الجدوى من خطوط الخلايا إضافية للظروف photopatterning 32 مماثلة لتلكالمستخدمة هنا ويمكن تقييمها لنظام هيدروجيل صفها باستخدام العيش / تلطيخ القتلى والمقايسات النشاط الأيضي. في حين أننا لم احظ القضايا مع بقاء الخلية باستخدام هذا النظام المواد والإجراءات ذات الصلة (4.2 و 4.3)، قد تكون بعض أنواع الخلايا حساسة للافراج عن الجذور و / أو التعرض للضوء. في هذه الحالة، يمكن للمستخدمين النظر في استخدام أنظمة المواد غير photoinitiated، مثل أزيد-آلكاين، 12 FXIII، 31 أو بناء ألدر-ديلز كيمياء تشكيل هيدروجيل 33

تقنيات السطحية لكشف وتحديد الزخرفة من الإشارات البيوكيميائية داخل وتعرض أيضا (3.1 و 3.2) المواد الهلامية. فحص المان هو موضع اهتمام خاص لأن الكواشف هي المتاحة تجاريا وليس هناك حاجة لخطوات المعالجة الاصطناعية إضافية أو الكواشف أكثر تكلفة (على سبيل المثال، الببتيد fluorescently المسمى). فحص المان ويمكن استخدامها لتحديد بالضبط تعديل التجولات الحرة مع الاشارات البيوكيميائية تحت احphotopatterning الإقليم الشمالي الظروف، فضلا عن تصور بسرعة الأنماط. لقياس التأسيس الببتيد، وتركيز مجموعة وظيفية ثيول قبل وبعد الزخرفة، ومقياس كمي التأسيس الببتيد، ويتم تقييم مباشرة مع فحص المان و. في حين أن هذا النوع من القياس الكمي يمكن القيام به مع الببتيدات fluorescently المسمى، 34 الكمي القائم على التصوير يتطلب المزيد تستغرق وقتا طويلا معالجة وتحليل الخطوات (على سبيل المثال، تخليق الببتيد fluorescently المسمى وتوليد منحنى المعايرة لتتصل مضان إلى تركيز الببتيد استخدام تحليل الصور). للتصوير الببتيد التأسيس، كاشف المان ويمكن تطبيقه مباشرة على عينات وتصور على الفور. في حين تقتصر على X- والطائرات ذ لنمط التصور، وهذه التقنية يمكن استخدامها كوسيلة من وسائل بسيطة وروتينية لتحديد ما إذا كان قد تم على المصفوفات التي تحتوي على مجموعات ثيول الحرة. من المهم أن نلاحظ أن فحص المان ليست جcytocompatible onsidered، وذلك في حين أنها يمكن أن تستخدم لمراقبة وقياس photopatterns، فإنه لا يمكن أن يتم في وجود خلايا. لتصوير الزخرفة في ثلاثة أبعاد وفي وجود خلايا، والاقتران من الببتيدات الفلورسنت ضمن مصفوفات هيدروجيل يبقى نهج قوي وتستخدم على نطاق واسع. قرار من أنماط يمكن تقييمها في X-، Y-، وض الطائرات من استخدام متحد البؤر المجهر، وهذا الأسلوب هو cytocompatible بحيث يمكن التعرف على الخلايا داخل المناطق نقوش أو المناطق غير منقوشة. معا، وتقنيات الفحص والقائم على التصوير المان هي أدوات تكميلية للباحثين لتقييم كمي ونوعي في photopatterning من الإشارات البيوكيميائية داخل منظومة المواد.

Photoclick، أو أكثر photoinitiated على نطاق واسع، كيمياء لتشكيل وتعديل الهلاميات المائية في وجود خلايا عديدة. صب، التغليف، والزخرفة التقنيات المعروضة هنا ليست ليمited لنظام المواد وصفها ويمكن تطبيقها على كيمياء على ضوء ومقرها بديلة، مثل ثيول-آلكاين، 35 أزيد-آلكاين، 4 وغيرها من كيمياء-ثيول إيني (على سبيل المثال، ثيول-في norbornene)، 10،13 وكذلك مع photoinitiators مختلفة، مثل Irgacure 2959، يوزين Y، وcamphorquinone. ملاحظة، قد يحتاج المستخدمون إلى ضبط معلمات الإجراء (على سبيل المثال، حضانة مرات، مرة البلمرة، كثافة الخلية) لضمان أن تظل الشروط cytocompatible لهذه النظم الأخرى. منذ عملية الزخرفة يتطلب نشر الببتيد المعدلة الوك (ق) في هيدروجيل (2.2.3-2.2.5)، قد تكون هذه العملية مفيدة للغاية لإضافة الأنصاف ملزم إنتغرين (على سبيل المثال، الببتيدات أو خارج الخلية البروتين مصفوفة شظايا) لهيدروجيل، التي تتطلب الحجز على يجند إلى شبكة للجيل قوات الجر من خلال تفعيل الخلايا وإنتغرين الكامل 36 ملاحظة، على الجزيئات الحيوية التي قدتكون نشطة على نحو مماثل في حل أو على تجميد (على سبيل المثال، عوامل النمو أو السيتوكينات)، فإن الخطوة الحضانة لنشر شاردة (~ 1 ساعة) في هيدروجيل يمكن أن يؤدي إلى إشارات الأحداث التي ملفوف النتائج الزخرفة. وقد وضعت وسائل أخرى لعامل النمو تجميد أو مصادرة المحلي لتنميط بهم. 37-39 بالإضافة إلى ذلك، أملت قرار نمط من السيطرة على التعرض للضوء. هنا، photomasks تسمح خلق أنماط من خلال عمق جل وفي X- والطائرات ذ. ومع ذلك، قدر أكبر من السيطرة المكانية على الزخرفة من الإشارات البيوكيميائية داخل الجل يمكن أن يتحقق مع وسائل بديلة للإشعاع مثل استخدام اثنين من الفوتون المجهر متحد البؤر لتوليد أنماط في X-، Y-، والطائرات Z-. 34،40 وأخيرا، من المهم أن نلاحظ أنه في حين أن فقط تعديل النظام المادي المستخدمة داخل هذا الإجراء في البداية مع الاشارات الكيميائية الحيوية، كيمياء photoclick المتعامدة يمكن أن تستخدم للسماح العبوة البديلةحصص في خصائص المصفوفة مع مرور الوقت. 12 والإجراءات والتقنيات المعروضة هنا تضيف التنوع إلى النهج الحالية لإنشاء مصفوفات الاصطناعية مع خصائص محددة جيدا وتسيطر spatiotemporally. على وجه الخصوص، فإن التوافر التجاري من الكواشف والمواد المستخدمة في هذا الإجراء مفيدا مجموعة واسعة من الباحثين المهتمين في استخدام المواد الحيوية القائمة على هيدروجيل للتطبيقات في ثقافة الخلية التي تسيطر عليها.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل برامج ديلاوير كوبر في اكتشاف الأدوية والمواد الحيوية المتقدم بتمويل من جوائز التطوير المؤسسي من المعهد الوطني للعلوم الطبية الجنرالات في المعاهد الوطنية للصحة (P20GM104316 وGM110758-01 P30، على التوالي)، ويلكوف (00026178)، وجائزة شهادة مؤسسة العلوم الوطنية (DMR-1253906)، وصندوق بوروز ويلكوم (1006787)، والبرنامج الوطني للعلوم مؤسسة IGERT SBE2 في جامعة ولاية ديلاوير (زمالة لL. Sawicki). المؤلفان بالشكر إلى مركز معهد التكنولوجيا الحيوية ولاية ديلاوير BioImaging في جامعة ديلاوير للتدريب والحصول على الفحص المجهري متحد البؤر، السيدة كاثرين وايلي للمساعدة أثناء تصوير الفيديو، والسيد ماثيو ريهمان لتوفير بسخاء hMSCs معزولة عن نخاع العظام، البروفيسور كريستوفر J . Kloxin والسيد ستيفن ما لتوفير بسخاء photomasks، والبروفيسور ويلفريد تشن لاستخدام قارئ لوحة الآلي. </p>

Materials

Custom Peptides Various Vendors —- Peptides may also be synthesized via standard SPPS techniques with materials from vendors including ChemImpex and ChemPep.
4arm PEG Thiol, MW 20k JenKem USA 4ARM-SH Listed under Multi-arm Homofunctional PEGs. PEG4SH may also be synthesized as previously referenced.
Lithium Phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate Colorado Photopolymer Solutions Li-TPO
Dimethyl Phenylphosphonite Sigma Aldrich 149470 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
2.4.6-Trimethylbenzoyl Chloride Sigma Aldrich 682519 Caution, causes severe skin burns and eye damage. Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Lithium Bromide Sigma Aldrich 213225
2-Butanone Sigma Aldrich 360473
Flask, Round Bottom, 100 mL Chemglass CG-1506-05
80 mL Filter Funnel, Buchner, Medium Frit Chemglass CG-1402-L-02 Filter paper inside a regular glass funnel may be used if desired.
Magnetic Stir Bars Various Vendors —-
Magnetic Stirring and Hot Plate Various Vendors —-
Vacuum Dessicator Various Vendors —-
Deuterium Oxide Acros Organics 16630
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline ThermoFisher Scientific 14190-250
Penicillin Streptomycin ThermoFisher Scientific 15070-063
Fungizone ThermoFisher Scientific 15290-018
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red ThermoFisher Scientific 15400-054 Select appropriate medium and trypsin depending on cell type.
Microcentrifuge tubes Various Vendors —- 1.5 or 2 mL sizes, sterile.
BD Syringe with Slip (Luer) Tips (Without Needle) Fisher Scientific 14-823-16H Product number listed here is for a 1 mL syringe (16H), Various sizes are available (14-823-XX).
Fisherfinest Premium Plain Glass Microscope Slides Fisher Scientific 12-544-1
High-Purity Silicone Rubber, 0.010" Thick, 6" x 8" Sheet, 55A Durometer (Gasket) McMaster Carr 87315K62
Ethanol, 200 Proof Decon Labs 2701
RainX, Original Amazon 800002243 May be purchased from other vendors.
Sigmacote Sigma Aldrich SL2
Photomasks Advance Reproductions Corporation —- Photomask Division, different designs may be printed as desired.
DTNB; Ellman's Reagent; 5,5-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) ThermoFisher Scientific PI-22582
Sodium Phosphate Dibasic Sigma Aldrich S5136
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma Aldrich E6758
Sodium Hydroxide, Pellets/Certified ACS Fisher Scientific S318
Orthophosphoric Acid Alfa Aesar 33266
Cysteine Hydrochloride Monohydrate Sigma Aldrich C7880
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells ThermoFisher Scientific L-3224
CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay Promega G3582
Centrifuge Various Vendors —- Capable of speeds at 90-110 x g.
Multiwell Plate Reader Various Vendors —- Capable of reading absorbance at 405 nm in a 96-well plate.
Epifluorescent or Confocal Microscope Various Vendors —- To visualize peptide patterns and cells within hydrogels.
Omnicure Exfo Series 2000 Excelitas Technologies —- Alternate light systems may be used to polymerize hydrogels.
Zeiss Zen Lite Software Zeiss —- Available at zeiss.com; compatible with images taken on Zeiss microscopes
ImageJ NIH —- Available at imagej.nih.gov; applicable for general image analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew Chemie – Int Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).
  2. Xi, W., Scott, T. F., Kloxin, C. J., Bowman, C. N. Click Chemistry in Materials Science. Adv Funct Mater. 24 (18), 2572-2590 (2014).
  3. Azagarsamy, M. A., Anseth, K. S. Bioorthogonal click chemistry: An indispensable tool to create multifaceted cell culture scaffolds. ACS Macro Lett. 2 (1), 5-9 (2013).
  4. Adzima, B. J., Tao, Y., Kloxin, C. J., DeForest, C. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Spatial and temporal control of the alkyne-azide cycloaddition by photoinitiated Cu(II) reduction. Nat Chem. 3 (3), 256-259 (2011).
  5. Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew Chemie – Int Ed. 49 (9), 1540-1573 (2010).
  6. Fan, Y., Deng, C., Cheng, R., Meng, F., Zhong, Z. In situ forming hydrogels via catalyst-free and bioorthogonal "tetrazole-Alkene" photo-click chemistry. Biomacromolecules. 14 (8), 2814-2821 (2013).
  7. Burdick, J. A., Murphy, W. L. Moving from static to dynamic complexity in hydrogel design. Nat Commun. 3, 1269 (2012).
  8. Rehmann, M. S., Kloxin, A. M. Tunable and dynamic soft materials for three-dimensional cell culture. Soft Matter. 9 (29), 6737-6746 (2013).
  9. Yang, T., Long, H., Malkoch, M., Gamstedt, K. E., Berglund, L., Hult, A. Characterization of well-defined poly(ethylene glycol) hydrogels prepared by thiol-ene chemistry. J Polym Sci Part A Polym Chem. 49 (18), 4044-4054 (2011).
  10. Fairbanks, B. D., et al. A versatile synthetic extracellular matrix mimic via thiol-norbornene photopolymerization. Adv Mater. 21 (48), 5005-5010 (2009).
  11. Roberts, J. J., Bryant, S. J. Comparison of photopolymerizable thiol-ene PEG and acrylate-based PEG hydrogels for cartilage development. Biomaterials. 34 (38), 9969-9979 (2013).
  12. DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments. Nat Mater. 8 (8), 659-664 (2009).
  13. Lin, C. C., Ki, C. S., Shih, H. Thiol-norbornene photoclick hydrogels for tissue engineering applications. J Appl Polym Sci. 132 (8), (2015).
  14. Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Design of thiol-ene photoclick hydrogels using facile techniques for cell culture applications. Biomater Sci. 2 (11), 1612-1626 (2014).
  15. Patterson, J., Hubbell, J. A. Enhanced proteolytic degradation of molecularly engineered PEG hydrogels in response to MMP-1 and MMP-2. Biomaterials. 31 (30), 7836-7845 (2010).
  16. Fairbanks, B. D., Singh, S. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable, photoadaptable hydrogels via radical-mediated disulfide fragmentation reaction. Macromolecules. 44 (8), 2444-2450 (2011).
  17. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
  18. Yang, F., et al. The effect of incorporating RGD adhesive peptide in polyethylene glycol diacrylate hydrogel on osteogenesis of bone marrow stromal cells. Biomaterials. 26 (30), 5991-5998 (2005).
  19. Wacker, B. K., et al. Endothelial cell migration on RGD-peptide-containing PEG hydrogels in the presence of sphingosine 1-phosphate. Biophys J. 94 (1), 273-285 (2008).
  20. Wilson, M. J., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Murphy, W. L., Nealey, P. F. Hydrogels with well-defined peptide-hydrogel spacing and concentration: impact on epithelial cell behavior. Soft Matter. 8 (2), 390-398 (2012).
  21. Qiong Liu, S., et al. Injectable biodegradable polyethylene glycol/ RGD peptide hybrid hydrogels for in vitro chondrogenesis of human mesenchymal stern cellsa. Macromol Rapid Commun. 31 (13), 1148-1154 (2010).
  22. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  23. Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3 (3), 299-306 (2007).
  24. Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32 (36), 9685-9695 (2011).
  25. Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J Vis Exp. (32), e1590 (2009).
  26. Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro. J Biomater Sci Polym Ed. 11 (5), 439-457 (2000).
  27. Burdick, J. A., Chung, C., Jia, X., Randolph, M. A., Langer, R. Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks Controlled Degradation and Mechanical Behavior of Photopolymerized Hyaluronic Acid Networks. Society. 6 (1), 386-391 (2005).
  28. Marsano, E., Gagliardi, S., Ghioni, F., Bianchi, E. Behaviour of gels based on (hydroxypropyl) cellulose methacrylate. Polymer (Guildf). 41 (21), 7691-7698 (2000).
  29. Bryant, S. J., Anseth, K. S. Photopolymerization of Hydrogel Scaffolds. Scaffolding Tissue Eng. , 71-90 (2005).
  30. Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7 (3), 830-838 (2011).
  31. Mosiewicz, K. A., et al. In situ cell manipulation through enzymatic hydrogel photopatterning. Nat Mater. 12 (11), 1072-1078 (2013).
  32. Williams, C. G., Malik, A. N., Kim, T. K., Manson, P. N., Elisseeff, J. H. Variable cytocompatibility of six cell lines with photoinitiators used for polymerizing hydrogels and cell encapsulation. Biomaterials. 26 (11), 1211-1218 (2005).
  33. Nimmo, C. M., Owen, S. C., Shoichet, M. S. . Diels – Alder Click Cross-Linked Hyaluronic Acid Hydrogels for Tissue Engineering. , 824-830 (2011).
  34. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  35. Fairbanks, B. D., Sims, E. A., Anseth, K. S., Bowman, C. N. Reaction rates and mechanisms for radical, photoinitated addition of thiols to alkynes, and implications for thiol-yne photopolymerizations and click reactions. Macromolecules. 43 (9), 4113-4119 (2010).
  36. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  37. Wylie, R. G., et al. Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels. Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).
  38. Pompe, T., Salchert, K., Alberti, K., Zandstra, P., Werner, C. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protoc. 5 (6), 1042-1050 (2010).
  39. Hudalla, G. A., Murphy, W. L. Biomaterials that regulate growth factor activity via bioinspired interactions. Adv Funct Mater. 21 (10), 1754-1768 (2011).
  40. Lee, S. H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).

Tags

HydrogelCell CultureLight-mediatedPatterningSynthetic Extracellular MatrixIn VitroCell EncapsulationDrug DeliveryPolymerizationModulusSyringe Tip MoldGlass Slide Mold

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications. J. Vis. Exp. (115), e54462, doi:10.3791/54462 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image