Light-gemedieerde Vorming en patroonvorming van hydrogels voor Cultuur van de Cel Applications

1. Voorbereiding van materialen voor Hydrogel Formation Synthetiseren hanger (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) en verknopen van peptiden (Pep2Alloc) door middel van standaard vaste fase peptidesynthese (SPPS) technieken en thiol-gefunctionaliseerde polymeer door drie-stappen-procedure voor het einde groep modificatie (PEG4SH). 14,16 alternatief kopen PEG4SH (M n ~ 20 kDa), Pep1Alloc en Pep2Alloc commercieel. Synthetiseren de foto-initiator (LAP) door de twee-staps reactie hieronder beschreven. 14,17 Voer synthese stappen (1.2.1-1.2.11) in een zuurkast en voorzichtig te zijn bij de omgang met chemicaliën (beschermende handschoenen, kleding en een veiligheidsbril) . LAP ook kunnen in de handel worden aangeschaft. Droog het glaswerk in de oven (> 2 uur, 80 ° C). Voeg een roerstaaf een lege één-hals rondbodem kolf (100 ml) en deksel met een septum. Bevestig de kolf op een magnetische roerder verwarmingsplaat met een ring statief en klem. iknsert een naald (18 G) door het septum en laat het uiteinde open naar de atmosfeer. Plaats een tweede naald bevestigd aan een inert gas lijn. Open de inert gas lijn (bijvoorbeeld argon of stikstof) en zuiveren de kolf gedurende 10-15 min. NB: Het systeem zal continu worden gespoeld met inert gas, argon of stikstof, gedurende de reactie. Overdracht 1,5 g (~ 1,4 ml) dimethyl phenylphosphonite (PAS) aan de kolf met een injectiespuit met naald doorboren het septum. Zet het roer plaat (gemiddelde snelheid) en wees voorzichtig dat de inhoud niet spatten op de zijkanten van de kolf. Voeg 1,6 g (~ 1,46 ml) 2,4,6-trimethylbenzoylchloride (LET) druppelsgewijs aan de kolf die dimethyl phenylphosphonite, met een injectiespuit met een naald om het septum te doorboren. Bedek het reactievat met folie ter bescherming tegen licht en roer gedurende 18 uur onder argon of stikstof. De volgende dag, verhogen de hoogte van de kolf en plaats een oliebad op de roerder, eennd kantel de kolf in het oliebad. Verwarm het water en de kolf tot 50 ° C onder handhaving magnetisch roeren. Ontbinden 3,05 g lithiumbromide in 50 ml 2-butanon. Breng de kolf uit het oliebad en voeg de lithiumbromide oplossing voor de rondbodemkolf kort verwijdering het septum te gieten in de kolf. De erlenmeyer opnieuw met het septum (NB: Septum zal nog een naald die tot de argon lijnen en een naald te ventileren), laat de kolf weer in verwarmde oliebad, en laat de reactie verlopen gedurende 10 min. Een vast neerslag wordt gevormd. Na 10 minuten, uit te schakelen argon, verwijder de kolf van het vuur en laat het mengsel rusten gedurende 4 uur (bedekt met een folie ter bescherming tegen licht als een lichtgevoelige initiator is geproduceerd. Houd de naald opening plaats. Giet het product in een glas frit trechter of trechter gevoerd met de juiste papieren filter. Spoel filtraat 3 keer met 50 ml 2-butanon aan rchrap eventueel niet-omgezet lithiumbromide. Droog (eerst op benchtop en vervolgens in vacuümexsiccator) en product analyseren met 1H NMR in D 2 O. Karakteristieke pieken bij 1,8-1,9 (6H, s), 2,1-2,2 (3H, s), 6,7-6,8 (2H, s), 7,3-7,4 (2H, m), 7,4-7,5 (1H, m) en 7,5 -7,7 (2H, m). 14,17 Gebruik een spreadsheet om het volume en de concentratie van elk bestand oplossing (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP), die moeten worden opgesteld om hydrogels (tabel 1) te berekenen. Om non-patroon gels te maken, ervoor te zorgen dat [SH] = [Alloc] zodat alle reactieve groepen tijdens de polymerisatie worden geconsumeerd. Als photopatterning gels gepland bevatten een overmaat thiol functionele groepen tijdens gelvorming gebaseerd op stoichiometrie (bijvoorbeeld 0,2-5 mM, [SH]> [Alloc]) voor latere reactie met Pep1Alloc. LET OP: Gels moet groter zijn dan 5 gewichtsprocent (gew%) bevatten PEG4SH tot snelle polymerisatie (binnen 5 min) te garanderen. Echter, lagere gew% bereiks kunnen worden onderzocht als de aanvraag vraagt om hydrogels met lagere moduli (bijvoorbeeld <0,5 kPa); polymerisatie moet worden gecontroleerd en aangepast voor deze lage gew% composities. Omgekeerd verleent Pep1Alloc concentratie worden ingesteld voor verschillende toepassingen (bv, 0,2-5 mM) zoals gerapporteerd in de literatuur voor thiol gefunctionaliseerde peptiden. 18-21 LAP concentratie aanbevolen ongeveer 0,067 gew% (2,2 mM) of minder, zoals beschreven, als hogere concentraties kan cellevensvatbaarheid verminderen. Bereid voorraad oplossingen van Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH en LAP onder steriele omstandigheden voor celkweek op basis van berekeningen in tabel 1. Voor Pep1Alloc en Pep2Alloc individueel wegen de totale massa van Pep1Alloc en Pep2Alloc van peptidesynthese en oplossen in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevattende 1% penicilline / streptomycine (PS) en 0,5 ug / ml fungizon (FZ). Typische concentraties van bereide stamoplossingen range20-100 mg / ml peptide. Mixen deze voorraden gels met uiteindelijke moduli relevant zachte weefsels toepassingen (Young's modulus ~ 0,5-5 kPa). 22,23 Aliquot en bewaar bereiken bij -20 ° C tot gebruik. Voor PEG4SH, wegen PEG4SH in een steriele microcentrifugebuis en los op in PBS + PS + FZ. Typische concentraties van deze voorraad oplossing range 250-430 mg / ml (20-30% PEG4SH van het gewicht). LAP, weeg LAP in een steriele microcentrifugebuis en oplossen in PBS + PS + FZ tot een eindconcentratie van 7,5 mg / ml. LET OP: Het voorbereiden van verse oplossingen van PEG4SH en LAP wordt aanbevolen voor elke inkapseling of gel experiment om te zorgen voor een consistente polymerisatie tijden. Bereid steriele spuit Tip Mallen voor het Vormen van hydrogels. snijd voorzichtig de tips off van 1 ml spuiten met behulp van een scheermesje en vervolgens verwijderen van de zuigers van de spuit assen. Dompel de spuit schachten en zuigers in 70% ethanol gedurende 15 minuten eend plaats in een steriele celkweek kap drogen (30 min). Als er teveel druppels ethanol binnenkant spuit as te blijven, gebruik maken van de plunjer om ze te duwen. Bereid steriele glazen Slide Mallen voor het Vormen van hydrogels. Soak Glasplaten (veelvouden van 2) en rubber pakkingen (0,254 mm dik, 2 kleine stukjes gebruikt als schijven, een rechthoek met schijven uitgestanst, of vierkante frame vorm) in 70% ethanol gedurende 15 min, en plaats in steriele celkweek kap drogen. Bedekkinghelft van de gesteriliseerde dia's met anti-hechtende coating volgens de aanwijzingen van de fabrikant om de hechting van de top van de gel op het glijoppervlak (bijvoorbeeld wanneer er 4 glijbanen, 2 slides wordt bekleed met anti-kleefmiddel) te voorkomen. Deze zullen als de bovenkant van het glasplaatje mal. Kalibreer de lamp voor spuit of glasplaatje mallen. LET OP: Voor deze experimenten, kwik booglamp met een externe filter adapter assemblage en 365 nm extern filter werd gebruikt. andere lampom passende intensiteiten van lange golflengte UV licht te produceren kunnen worden gebruikt zoals door anderen. 24-27 Bevestig een collimatorlens aan het einde van de met vloeistof gevulde lichtgeleider relatief gelijkmatige lichtintensiteit in alle monsters te verzekeren. Als dat nodig is, stel dan de afstand van de lichtgeleider uit de steekproef (s) naar een plek grootte die zal betrekking hebben op monsters van belang te bereiken. Plaats een cut spuit schimmel in een microcentrifugebuis houder (om spuit schimmel in verticale stand te houden). Houd de radiometer ter hoogte van de spuit waar de monsters worden gehouden en pas sluiter (% open) om een lichtintensiteit van 10 mW / cm2 bereikt bij 365 nm. Noteer de aangepaste instellingen voor later gebruik. Plaats een glasplaatje mal op de bovenkant van een steriel oppervlak (bijvoorbeeld de top van een pipetpunt box binnen een bio kast). Houd de radiometer detector ter hoogte van het glaasje mal en stel sluiter (% open) om een ​​lichtintensiteit van 10 m te bereikenW / cm2 bij 365 nm. Noteer de aangepaste instellingen voor later gebruik. 2. Hydrogel Vorming en Photopatterning Voorbereiding van de Non-patroon Hydrogels. OPMERKING: Op dit punt in het protocol als hydrogelen gebruik in celkweek toepassingen, alle volgende stappen worden onder steriele omstandigheden uitgevoerd in een steriele kast of kap. Meng voorraad oplossingen van PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP en PBS + PS + FZ volgens de spreadsheet-berekening (zie tabel 1 voorbeeld). Pipetteer de resulterende gel precursor oplossing hevig om gelijkmatige menging van de oplossing. Bereid dikke hydrogels gevormd in spuittips pipetteren 10-20 pl van de gel precursor oplossing (PEG / Pep / LAP / PBS) in de punt van een steriele spuit cut. Maak een enkele gel per spuit, ongeveer 0,5-1,5 mm dik op basis van volume en spuit diameter. LET OP: Grotere volumes kan onderzocht worden op basis vande gewenste gel grootte, waar bovengrenzen kunnen bestaan ​​op basis van diffusie beperkingen voor Pep1Alloc tijdens photopatterning en / of nutriënten / afval naar / van ingekapselde cellen in celkweek. Bereid dunne hydrogels in glasplaatje vormen door het plaatsen van de rubberen pakking (0,254 mm dik) aan de randen van de onbeklede glasplaatje. Pipetteer 5-10 ul gel precursor oplossing (enkelvoudige of meervoudige 5-10 gl gels kunnen worden door pipetteren één of meer punten van de oplossing op één dia) op de onbeklede glasplaatje en plaats het glaasje gecoat met anti-hechtmiddel bovenop de geloplossing (grotere gels, tot de grootte van het glaasje kan worden afhankelijk van de uiteindelijke toepassing). Zet de glaasjes met een klein bindmiddel clips te stabiliseren. Plaats mallen onder de lamp en zet de lamp intensiteit (bijvoorbeeld% sluiter geopend) tot 10 mW / cm2 te bereiken op het gel oppervlak voor spuit tip mallen of glasplaatje mallen op basis van metingen in stap 1.7.2 en1.7.3, respectievelijk. Onder lichte gedurende 1 tot 5 minuten om volledige polymerisatie van gels mogelijk. Gebruik een kortere polymerisatietijd voor gels met een hoger gehalte PEG4SH (8 gewichts% of meer, 1 min) en langer gels met lagere PEG4SH gehalte (5-8 gew%, 3-5 min) volledig gepolymeriseerde hydrogels produceren met moduli binnen het bereik van de zachte weefsels (0,5-5 kPa). Plaats gels van spuit mallen in een steriele niet-behandelde 48-well plaat en plaats objectglaasjes in een steriele schaal. Spoel 3 x 15 minuten met celkweekmedium of geschikte buffer (bijvoorbeeld PBS + PS + FZ, Ellman's reactiebuffer) is gebaseerd op geplande experimenten, zoals hieronder beschreven. Voorbereiding van de Patterned Hydrogels. Meng voorraad oplossingen van PEG4SH, Pep2Alloc, LAP en PBS + PS + FZ volgens de spreadsheet berekening, waardoor vrije thiolen (0,2-5 mm) voor latere reactie met Pep1Alloc. Pipetteer de precursor oplossing krachtig om gelijkmatige menging van de oplossing. Bereid dik en dun hydrogels zoals vastgelegd in de stappen 2.1.2 tot 2.1.6. LET OP: Niet gels in groeimedium plaatsen voorafgaand aan photopatterning. Vrije thiolen kunnen worden door species in het groeimedium (bijvoorbeeld disulfiden met thiol bevattende eiwitten) verschijnt niet patroonvorming van de gel zonder additionele bewerkingsstappen toe (bijvoorbeeld reductie van disulfidebindingen). Bereid oplossingen Pep1Alloc (eindconcentratie ~ 3-20 mg / ml) en 2,2 mM LAP. Bedek voorgevormde gels met Pep1Alloc / LAP oplossing en incubeer 1 uur bij 37 ° C. Verwijder overtollig Pep1Alloc / LAP oplossing. Als gels een spuittip werden gevormd, gebruik een spatel om de gels voorzichtig brengen van de 48-well plaat waarin ze incuberen in een steriele glasplaatje voor patroonvorming. Plaats een fotomasker met het gewenste patroon rechtstreeks op Naalden- en glazen schuif gevormde gels. Zorg ervoor dat de afgedrukte gedeelte van het masker raakt de gel voor een optimale Pattern trouw (dat wil zeggen, masker moet leest het goed en zijn emulsie naar beneden). Leg monsters onder de lamp en bestralen gedurende 1 minuut met de lamp instellingen die worden gebruikt voor de glasplaatjes (stap 1.7.3). Na het vormen, place spuit-gegoten gels in een steriele, 48 putjes niet-weefselkweek behandelde plaat en plaats glasplaatje gegoten gels die de glasplaatjes worden gehecht in een steriele schaal. Spoel 3 x 15 min met een mobiele kweekmedium of geschikte buffer (bijvoorbeeld PBS + PS + FZ, Ellman's reactie buffer) op basis van de geplande experimenten. 3. Het visualiseren en kwantificeren van Photopatterning Ellman's Assay te kwantificeren Gratis Thiolen detecteren en in Photopatterned Hydrogels. Bereid Ellman reactiebuffer, cysteine ​​werkoplossing, standaarden en Ellman's reagens zoals hieronder beschreven. Voor Ellman's Reaction Buffer, los 2,4 g natrium dibasisch (Na 2 HPO4) en 74,4 mg ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in 200 ml Dih 2 O (0,1 M Na 2 HPO 4, 1 mM EDTA). Op pH 7,5-8 met oplossingen van natriumhydroxide (NaOH) of fosforzuur (H PO 3 4). Voor Cysteine ​​Working Solution, ontbinden 5,27 mg cysteïne in 15 ml reactiebuffer (2 mM cysteïne). Voor Cysteine ​​Standards, verdunde cysteine ​​werkoplossing in reactiebuffer bij een eindconcentratie van 2, 1,5, 1,25, 1, 0,75, 0,5, 0,25 en 0 mM cysteïne. Voor Ellman's reagens, te ontbinden 4 mg Ellman's reagens in 1 ml reactiebuffer. Ultrasone trillingen de Ellman's reagens volledig oplossen. Kwantificeren van de concentratie van vrije thiolen in gels met Ellman's test (Figuur 2). OPMERKING: "Thin" 5 pl hydrogels, gevormd tussen glasplaatjes, worden beschreven in de onderstaande procedure aanbevolen en snelle diffusie van Ellman's reagens t toestaanhrough de gel (dat wil zeggen, het duurt het reagens een langere tijd te diffunderen door dikke gels). Bepaal de gezwollen gel volume van de 'dunne' 5 pl gels (V S) op basis van de volumetrische zwelling ratio, Q. Maak drie 20 'dikke' gels ul gebruik van de spuit mallen. Plaats gels in Ellman reactie buffer gedurende 24 uur en vervolgens af te wegen (evenwicht gezwollen massa, M S). Lyofiliseren de gels en vervolgens af te wegen (droge massa, M D). Uitgaande van de gemeten massa's dikke gels Bereken het volumetrische zwelverhouding 28 door Q = 1 + ρ polymeer / ρ oplosmiddel (M S / M D -1) waarin ρ polymeer = 1,07 g / cm 3 voor PEG, 29 ρ = 1,0 solvent g / cm 3 voor PBS / H2O Bereken de theoretische drooggewicht van de gel te gebruiken voor Ellman's test (hier "dun" gels 5 pi typisch uSED), door het optellen van de massa's van individuele componenten PEG4SH, Pep1Alloc en Pep2Alloc (M D = M PEG4SH + M Pep1Alloc + M Pep2Alloc). Bijvoorbeeld een 5 pl gel met 10 gew% PEG4SH bevat ongeveer 0,000535 g PEG, berekend M PEG4SH = 0,005 cm 3 x 1,07 g / cm 3 x 0,10. Pep1Alloc en Pep2Alloc massa worden berekend op dezelfde wijze op basis van gew% in oplossing (zie spreadsheet voor waarden), uitgaande van ρ ≈ 1,0 g / cm 3 van deze waterige oplossingen. LET OP: Gels kunnen ook worden gedroogd en gewogen in plaats van de berekening van het theoretische drooggewicht. Het kan echter een uitdaging om consistent meten het drooggewicht van de dunne, 5 gl gelen. Op basis van de voorspelde droge massa en de Q-waarde bepaald op basis van 'dikke' gels, het berekenen van de voorspelde gezwollen massa M S voor de 'dunne' gel (vergelijking in stap 3.1.2.1.1). Neem aan dat ρ ≈ 1,0 g / cm <sup> 3, dan M S ≈ V S. Gebruik deze berekende V S kwantitatieve Ellman's analyse uit te voeren. LET OP: De bovenstaande methode wordt aanbevolen om V s voor gezwollen gels als de 'dunne' 5 ul gels bepalen, zijn moeilijk te dragen voor het wegen. Vorm dunne hydrogels voor patronen zoals beschreven in paragraaf 2.2 (5 pi volume). Specifiek maakt gels met overmaat vrije thiolen en 'patroon' helft van deze monsters met behulp Pep1Alloc duidelijk dekglaasje overstromen blootstellen gehele gel met licht (bijvoorbeeld 6 totaal gels met overmaat thiol: 3 niet-gemodificeerd niet-'patterned 'en 3' patroon). LET OP: Voor deze test 'patroon' gels zijn overstroming blootgesteld aan licht, zonder een fotomasker. Deze methode wordt gebruikt om het totale aantal vrije thiolen verbruikt in de gehele gel monster te bepalen en om aan te tonen hoe efficiënt vrije thiolen kunnen worden gemodificeerd met peptide. Uit deze informatie,het aantal vrije thiolen verbruikt tijdens de patroonvorming met een fotomasker kan worden voorspeld op basis van de gel dikte en de afwijkingshoek (gebieden blootgesteld aan licht). Plaats 'gevormde en niet-'patterned' gelen in putjes van een 48-well plaat en spoel 3 x 15 min met Ellman's reactiebuffer diffusie ongereageerde soorten mogelijk uit de gel en evenwichtzwelling plaatsvinden. Voeg extra Ellman reactiebuffer de gels gespoeld zodat Vs bij reactiebuffer is een veelvoud van 20 pl. Wanneer bijvoorbeeld de voorspelde V S 15 ui, voeg 5 ul reactiebuffer (20 ui), en indien de voorspelde Vs is 30 pl, voeg 10 ul reactiebuffer (40 ui). Pipetteer de cysteine normen in afzonderlijke putjes (zonder gels) van een 96-wells plaat in veelvouden van 20 ul afhankelijk van het volume die in de vorige stap (bijvoor- beeld als de vorige stap moest Vs + extra reactie bUffer = 40 ui, voeg 40 ul van elke norm aan individuele lege putten). Verdun Ellman's reagens in reactiebuffer (veelvouden van 180 gl reactiebuffer + 3,6 pl Ellman's reagens, bijvoorbeeld, 183,6 20 367,2 ul of pi 40 pi in stap 3.1.2.5). Voeg verdunde Ellman's reagens aan putjes die standaarden en monsters. Voor 20 pl monsters voeg 183,6 ul oplossing in elk putje. Het dubbele hoeveelheid reagens verdunde Ellman voor 40 pl monsters (of schalen dienovereenkomstig gebaseerd op de grootte van het monster). Incubeer of plaatsen op een schudder gedurende 1 uur en 30 minuten (bij kamertemperatuur) of totdat de kleur van de oplossing overeenkomt met de kleur van de gels visuele inspectie om voldoende diffusie van het geel 2-nitro-5-thiobenzoaat dianion waarborgen (TNB 2), dat wordt gegenereerd na reactie van Ellman's reagens met vrije thiolen, uit de gel. Neem 100 gl oplossing van monsters en sNORMEN en plaats in putjes van een 96-wells plaat. Lees absorptie bij 405 nm op een plaatlezer. Om de gegevens te verwerken, plot de standaard curve (monsters uit stap 3.1.1.3) (absorptie versus concentratie) en breng een lineaire functie. Met de lineaire functie, de concentratie van vrije thiolen in de 'verdunde gel-oplossing (gel + reactiebuffer) worden berekend op basis van absorptiemetingen. Tenslotte, gezien de "verdunning" met reactiebuffer, bepalen de vrije thiol concentratie in de gels zonder reactiebuffer. (Bijvoorbeeld als 15 ul gel met 5 ui reactiebuffer werd verdund, vermenigvuldigen met 20/15). Visualisatie van photopatterns met Ellman's reagens (Figuur 3A). Geniet dunne hydrogels patroon met Pep1Alloc in Ellman reactie buffer gedurende 1 uur. Overtollig reactiebuffer voorzichtig schoon rond de randen van de hydrogel met een tissue. Pipetteer Ellman's reagens direct op het oppervlak van de gel. Onmiddellijk beeld op een lichtmicroscoop bij 10X of stereomicroscoop met een kleurencamera. Opmerking: Gels moet onmiddellijk worden afgebeeld, omdat visualisatie patronen zullen verdwijnen binnen 5 min als de gele TNB 2- ion geproduceerd door splitsing van Ellman's reagens bij reactie met thiolen in niet-gevormde regio verspreidt over de hele gel. Non-patroon regio's lijken flauw geel met het blote oog; voor betere resolutie en kleinere onderdelen, vergroting (bijvoorbeeld, gebruik van een microscoop) vereist. Visualisatie van Photopatterns met fluorescente peptiden (Figuur 3B). Visualiseren patronen met een hogere resolutie of driedimensionaal, photopattern een AF488-gemodificeerde Pep1Alloc (of soortgelijke fluorescent peptide) aan de gels in stap 2,2. Afbeelding op een fluorescentiemicroscoop. Een confocale microscoop kan hier worden gebruikt om z-st nemenack beelden van de gel zodat het patroon kan worden waargenomen in de x-, y- en z-vlakken. OPMERKING: Bij fluorescentie moet gelen worden beschermd tegen licht tot de stabiliteit van de AF488 fluorofoor en maximale fluorescentie waarborgen. Gels niet direct moeten worden afgebeeld omdat de fluorescerende peptide redelijk stabiel indien beschermd tegen licht (opslag in een container verpakt in folie bij 4 ° C). 4. Cell Encapsulation in hydrogels en Photopatterning Verzamelen en voorbereiden van Cellen voor inkapseling. Na standaard steriele zoogdiercelcultuur procedures, trypsinize en het verzamelen van cellen van belang uit platen. Quench trypsine met groeimedium na onthechting optreedt (bijvoorbeeld een T-75 kolf 5 ml trypsine, blussen met 5 ml medium, spoel plaat met 5 ml medium voor totaal 15 ml). OPMERKING: trypsine kunnen variëren tussen celtypen maar meestal liggen tussen 5 en 15 minuten. Alternate cel detachment middelen (bijvoorbeeld Versene) worden gebruikt om cellen te verzamelen, indien gewenst. Aantal cellen (minimaal 100 of per protocol van de fabrikant) van fracties van de getrypsiniseerde celsuspensie met een hemocytometer of andere mobiele telinrichting tijdens centrifugeren van de celsuspensie volume (90-110 x g, 5 min). Resuspendeer celpellet na centrifugeren in een minimaal volume PBS of kweekmedium en opnieuw tellen als de eerste getrypsiniseerde celsuspensie te verdunnen is. Resuspendeer cellen in een minimaal volume PBS en verdund tot respectievelijk voor elke gel staat in microcentrifugebuizen zodat er zullen 5000 cellen / ul bij menging met de geloplossing (voorafgaand aan polymerisatie). OPMERKING: Typische cel monsters bevatten 300,000-500,000 cellen en zijn voldoende om 60-100 pl gel / celsuspensie die kunnen worden gebruikt voor 3-5 x 20 gl gels met 5000 cellen / pl te maken. Hogere of lagere celdichtheden worden gebruikt voor inkapseling, afhankelijk van de hoeveelheid van cel-celvs. celmatrix contact gewenst, respectievelijk, en moet worden bepaald voor elke toepassing. Centrifuge cel / PBS fracties (90-110 x g, 5 min). Zorgvuldig aspireren PBS van cel pellet in microcentrifugebuis vlak voor inkapseling. OPMERKING: Indien cellen gevoelig voor afschuifkrachten, kan de tweede centrifugatiestap worden geëlimineerd door het tellen (bijvoorbeeld hemocytometer) en vervolgens aliquotting de trypsine celsuspensie (trypsine + media + cellen) in porties nodig voor elke gel staat. Deze monsters worden eenmaal gecentrifugeerd (90-110 x g, 5 min) en de trypsine + media wordt afgezogen, waardoor een cel pellet voor inkapseling. Inkapselen van cellen in Non-patroon Hydrogels. Onmiddellijk na het opzuigen van PBS, opschorten gepelleteerde cellen in PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP en PBS + PS + FZ zoals berekend in het werkblad tot een uiteindelijke concentratie van 5000 cellen / l. Schimmel en polymeriseren hydrogels als descrIBED in de stappen 2.1.2 tot 2.1.6. OPMERKING: Bij het inkapselen van cellen in glasplaatje vormen, is voorzichtigheid geboden bij het verwijderen van de bovenste slede post-polymerisatie te voorkomen afschuiving van de gel, wat kan leiden tot celdood. Om de verwijdering van de gel uit de vorm kan glijden schimmels in steriele PBS of kweekmedium worden geplaatst na de polymerisatie om de pakking en hydrogel nat, waardoor het makkelijker om de bovenste slede verwijderen. Een methode om dit afschuiving geheel te voorkomen is door het gebruik van de spuit matrijzen. Rinse gels 3 x 10 min in groeimedium om niet-gereageerd soorten en overtollige LAP te verwijderen. Incubeer gels in groeimedium bij 37 ° C en 5% CO2 totdat het gewenste tijdstip voor verdere analyse. Vul medium elke 48 uur of zoals bepaald voor de toepassing (bv typisch voeden interval voor specifieke celtype en gemiddeld). Inkapselen van cellen en Photopatterning in de tegenwoordigheid van Cells. Onmiddellijk na aanzuigen PBS,schorsen gepelleteerde cellen in PEG4SH, Pep2Alloc, LAP en PBS + PS + FZ zoals berekend in het werkblad tot een uiteindelijke concentratie van 5000 cellen / ul. Laat een geschikte concentratie van vrije thiolen (bijvoorbeeld 2 mm) voor latere reactie met Pep1Alloc. Mold, polymeriseren, en het patroon hydrogels, zoals beschreven in de stappen 2.2.2 tot 2.2.8. Rinse gels 3 x 10 min in groeimedium na gestructureerd om niet-gereageerd soorten en overtollige LAP te verwijderen. Incubeer gels in groeimedium bij 37 ° C en 5% CO2 totdat het gewenste tijdstip voor verdere analyse. Vul medium elke 48 uur of zoals bepaald voor de toepassing. 5. Het bepalen van de levensvatbaarheid en metabole activiteit van ingekapselde cellen Live / Dead cytotoxiciteit Assay om Encapsulated Cell levensvatbaarheid (Figuur 4A) te bepalen. Verwijder groeimedium uit gels en spoel 3 x 15 min met PBS om diffusie van medium uit g toestaanels. Dooi levend / dode cytotoxiciteit meetoplossingen (ethidiumhomodimeer-1 en calceïne AM). Voeg 2 ul van 2 mM ethidium homodimeer-1 en 0,5 pl van de 4 mM calceïne AM oplossingen 1 ml steriel PBS. Vortex om een ​​volledige menging te garanderen. Voeg 300 gl kleuroplossing voor elke spuit schimmel gel in 48-well platen, of voldoende om het oppervlak van gel betrekking op een glasplaatje in een steriele schotel en incubeer gedurende 45 minuten. Verwijder overtollig kleuroplossing en spoel om overtollige kleurstof uit de gels (3 x 15 min met PBS) te verwijderen. Beeld op een confocale microscoop (z-stack beelden) of op een epi-fluorescentie microscoop met z-stack-functie op 10X en 488/525 nm Ex / Em. Kwantificeren van het aantal levensvatbare cellen door het projecteren van de z-stacks en tellen van het aantal levende (groen gehele cellichaam) en dode (rode nuclei) cellen met beeldverwerkingssoftware. Voer metabolische activiteit test om celactiviteit post-inkapseling te bepalen (Figure 4B). 24 uur voorafgaande aan testen, voer ingekapselde cellen met vers groeimedium. OPMERKING: medium toe aan een paar extra putten (die geen gels of gels zonder cellen) als controle (achtergrond lezingen). Op het moment bezienswaardigheid, ontdooien MTS reagens oplossing. Opmerking: Om de metabole activiteit te bepalen tijd, wordt een initieel tijdpunt (12-24 uur na inkapseling) aanbevolen als een referentie ter vergelijking met latere tijdstippen. Voeg MTS reagens aan elk putje (20 pl per 100 ul groeimedium). Incubeer monsters gedurende 1-4 uur bij 37 ° C en 5% CO 2, volgens de instructies van de fabrikant. OPMERKING: Incubatietijden moet voldoende zijn voor cellen MTS verminderen en diffusie van het formazan product uit de gel. Bijgevolg kunnen dikkere gels zoals spuit gels langere incubatietijden (~ 4 uur) voor voldoende MTS reductie en diffusie vereisen. Pipet 100 ul verminderd MTS / Mediumnaar schone putjes van een 96-putjesplaat en opnemen absorptie bij 490 nm op een plaatlezer. Trek de achtergrondabsorptie voor putten zonder cellen van monster absorptiewaarden tot baseline absorptiewaarden genereren.