Licht-vermittelte Bildung und Musterung von Hydrogelen für Zellkulturanwendungen

1. Herstellung von Materialien für Hydrogelierung Synthesize Anhänger (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) und Vernetzungs Peptide (Pep2Alloc) durch Standard – Festphasen – Peptidsynthese (SPPS) Techniken und Thiol-funktionalisierten Polymeren durch dreistufiges Verfahren für Endgruppenmodifizierung (PEG4SH). 14,16 Alternativ kaufen PEG4SH (M n ~ 20 kDa), Pep1Alloc und Pep2Alloc im Handel. Synthesize den Photoinitiator (LAP) durch die zweistufige Reaktion beschrieben. 14,17 Führen Syntheseschritte (1.2.1-1.2.11) in einer Abzugshaube und seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Chemikalien (Schutzhandschuhe tragen, Kleidung und Brillen) . LAP können auch im Handel erworben werden. Trocknen Sie alle Glaswaren im Ofen (> 2 h, 80 ° C). Fügen Sie einen Rührstab in einen leeren Single-Hals-Rundkolben (100 ml) und Abdeckung mit einem Septum. Sichern Sie den Kolben auf einem Magnetrührstab Heizplatte mit einem Ringständer und Klemme. ichnsert eine Nadel (18 G) durch das Septum und verlassen das äußere Ende zur Atmosphäre hin offen. Legen Sie eine zweite Nadel in einer inerten Gasleitung befestigt ist. Öffnen Sie die Inertgas Leitung (zB Argon oder Stickstoff) und spülen Kolben für 10-15 min. HINWEIS: Das System wird kontinuierlich mit Inertgas, Argon oder Stickstoff gespült, während der Reaktion. Transfer 1,5 g (~ 1,4 ml) dimethyl phenylphosphonit (Vorsicht) in den Kolben einer Spritze mit Nadel durch das Septum zu durchstechen. Schalten Sie die Rührplatte (mittlere Geschwindigkeit) und achten Sie darauf, dass der Inhalt spritzen nicht auf die Seiten des Kolbens. Hinzufügen, 1,6 g (~ 1,46 ml) 2,4,6-trimethylbenzoyl Chlorid (Vorsicht) tropfenweise zu dem Kolben, der dimethyl phenylphosphonit, eine Spritze mit einer Nadel, das Septum zu durchstechen. Decken Sie das Reaktionsgefäß mit einer Folie vor Licht zu schützen und rühre 18 Stunden unter Argon oder Stickstoff. Am nächsten Tag zu erhöhen, die Höhe des Kolbens am Rührer ein Ölbad zu platzieren, einnb vorsichtig den Kolben in das Ölbad senken. Erhitzen Sie das Bad und den Kolben auf 50 ° C während magnetisches Rühren gehalten wurde. Man löst 3,05 g Lithiumbromid in 50 ml 2-Butanon. Heben Sie den Kolben aus dem Ölbad und fügen Sie die Lithium-Bromid-Lösung in den Rundkolben, der kurz das Septum Entfernung in den Kolben zu gießen. Der Kolben wird wieder mit dem Septum (ACHTUNG: Septum wird immer noch eine Nadel haben, die zu den Argonlinien und einer Nadel zu entlüften), senken Sie den Kolben zurück in erhitztes Ölbad, und lassen Sie die Reaktion für 10 Minuten, um fortzufahren. Ein fester Niederschlag bilden. Nach 10 Minuten, schalten Sie den Kolben aus Hitze Argon, zu entfernen, und lassen Sie die Mischung für 4 Stunden (abgedeckt mit einer Folie zum Ausruhen vor Licht zu schützen als ein lichtempfindlicher Initiator hergestellt worden ist. Entlüftungs Nadel aufbewahren. Gießen Produkt in einen Glasfrittentrichter oder Trichter mit geeigneten Filterpapier ausgekleidet. Rinse Filtrat 3 mal mit je 50 ml 2-Butanon zu reMove nicht umgesetztem Lithiumbromid. Dry (zuerst auf Benchtop und dann im Vakuum Exsikkator) und analysieren Produkt durch 1 H – NMR in D 2 O. Charakteristischen Peaks bei 1,8-1,9 (6H, s), 2.1-2.2 (3H, s), 6,7-6,8 (2H, s), 7,3-7,4 (2H, m), 7,4-7,5 (1H, m) und 7,5 -7.7 (2H, m). 14,17 Verwenden Sie eine Tabelle das Volumen und die Konzentration jeder Stammlösung (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP) zu berechnen , die vorbereitet werden müssen , um Hydrogele zu machen (Tabelle 1). Um nicht strukturierten Gele, sicherzustellen, dass [SH] = [Alloc], so dass alle reaktiven Gruppen während der Polymerisation verbraucht werden. Wenn Photostrukturierungs von Gelen geplant ist, umfassen eine überschüssige Menge an Thiol – funktionelle Gruppen während der Gelbildung bezogen auf Stöchiometrie (zB 0,2-5 mM, [SH]> [Alloc]) für die spätere Umsetzung mit Pep1Alloc. HINWEIS: Die Gele sollte größer als 5 Gewichtsprozent enthalten (wt%) PEG4SH schnelle Polymerisation, um sicherzustellen, (innerhalb von 5 min). Jedoch niedriger Gew% -Bereichs kann geprüft werden , ob die Anwendung für Hydrogele mit niedrigeren Moduli nennt (zB <0,5 kPa); Polymerisation sollte entsprechend für diese niedrigen wt% Zusammensetzungen geprüft und eingestellt werden. In ähnlicher Weise kann Pep1Alloc Konzentration für verschiedene Anwendungen eingestellt werden (beispielsweise 0,2-5 mM) wie für Thiol-funktionalisierte Peptide in der Literatur berichtet. 18-21 LAP Konzentration um 0,067 wt% empfohlen wird (2,2 mm) oder weniger, wie beschrieben, als höhere Konzentrationen können die Lebensfähigkeit der Zellen zu verringern. Stocklösungen von Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH und LAP unter sterilen Bedingungen für die Zellkultur , die auf Berechnungen in der Tabelle 1. Für Pep1Alloc und Pep2Alloc, individuell die Gesamtmasse der Pep1Alloc und Pep2Alloc aus der Peptidsynthese wiegen und in steriler Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 1% Penicillin / Streptomycin (PS) und 0,5 & mgr; g / ml Fungizon (FZ) aufzulösen. Typische Konzentrationen von vorbereiteten Stammlösungen Bereich20-100 mg / ml des Peptids. Mischen Sie diese Bestände zu erzielen Gele mit abschließender moduli relevant für Weichteilanwendungen (E-Modul ~ 0,5-5 kPa). 22,23 aliquotieren und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Für PEG4SH, wiegen PEG4SH in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und lösen sich in PBS + PS + FZ. Typische Konzentrationen dieser Stammlösung Bereich von 250 bis 430 mg / ml (20-30% PEG4SH nach Gewicht). Für LAP, LAP in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen wiegen und in PBS + PS + FZ zu einer Endkonzentration von 7,5 mg / ml auflösen. HINWEIS: Die Vorbereitung frische Lösungen von PEG4SH und LAP für jede Verkapselung oder Gel Experiment empfohlen konsistente Polymerisationszeiten zu gewährleisten. Bereiten Sie Sterile Spritzenspitze Formen für Hydrogele bilden. Schneiden Sie vorsichtig die Spitzen weg von 1 ml Spritzen mit einer Rasierklinge und anschließend die Kolben aus der Spritze Wellen entfernen. Unterzutauchen der Spritzen Wellen und Kolben in 70% Ethanol für 15 min eind in einem sterilen Zellkultur Haube zum Trocknen (30 min). Wenn überschüssige Tropfen Ethanol innerhalb Spritze Welle bleiben, verwenden Sie den Kolben, sie drücken aus. Bereiten Sie sterile Glas Slide Formen für Hydrogele bilden. Soak Glasobjektträger (ein Vielfaches von 2) und Gummidichtungen (0,254 mm dick, 2 kleine Stücke als Beilagen verwendet, gestanzt ein Rechteck mit Scheiben aus, oder quadratische Rahmenform) in 70% Ethanol für 15 Minuten, und in sterile Zellkultur Haube trocknen. Coat Hälfte der sterilisierten Objektträger mit Anti-Haftbeschichtung gemäß Hersteller Richtungen Haftung der Oberseite des Gels auf der Gleitfläche zu verhindern (beispielsweise , wenn es 4 gleitet sind, 2 Folien werden beschichtet mit anti-Klebstoff). Diese dienen als die Oberseite des Glasschiebeform. Kalibrieren Sie die Lampe für Spritze oder Objektträger aus Glas Formen. HINWEIS: Bei diesen Experimenten wurde eine Quecksilber-Bogenlampe mit einem externen Filteradapteranordnung und 365 nm Außenfilter verwendet wurde. Andere Lampes , die entsprechenden Intensitäten der langwelligen UV – Licht erzeugen kann verwendet werden , wie von anderen berichtet. 24-27 Bringen Sie eine Kollimationslinse zum Ende des flüssigkeitsgefüllten Lichtleiter relativ gleichmäßige Lichtintensität in allen Proben zu gewährleisten. Bei Bedarf stellen Sie den Abstand des Lichtleiters von der Probe (n) eine Punktgröße zu erreichen, die Proben von Interesse abdecken wird. Legen Sie eine Schnittspritzenform in einer Mikrorohrhalter (Spritzenform in vertikaler Position halten). Halten Sie die Radiometers auf der Höhe der Spritzenspitze , wo die Proben gehalten werden und stellen Verschluss (% offen) eine Lichtintensität von 10 mW / cm 2 bei 365 nm zu erreichen. Notieren Sie sich die geänderten Einstellungen für die spätere Verwendung. Ein Glasschiebeform auf die Oberseite einer sterilen Oberfläche (zB die Spitze eines Pipettenspitze Kastens innerhalb eines Biosicherheitsschrank). Halten Sie den Radiometers Detektor auf der Höhe des Glasschiebeform und stellen Sie Blende (% offen) mit einer Lichtintensität von 10 zu erreichen, mW / cm 2 bei 365 nm. Notieren Sie sich die geänderten Einstellungen für die spätere Verwendung. 2. Hydrogelierung und Photopatterning Herstellung von nicht-gemusterten Hydrogelen. HINWEIS: An diesem Punkt in dem Protokoll, wenn Hydrogele in Zellkulturanwendungen verwendet werden sollen, sollten alle nachfolgenden Schritte unter sterilen Bedingungen in einem sterilen Gehäuse oder Haube durchgeführt werden. Mischen Sie Stammlösungen von PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP und PBS + PS + FZ entsprechend der Tabellenkalkulation (siehe Tabelle 1 Beispiel). Pipette, um die resultierenden Gelvorläufers Lösung kräftig selbst, um sicherzustellen, der Lösung zu mischen. Bereiten Sie dicke Hydrogele in Spritzenspitzen geformt durch Pipettieren 10-20 ul der Gel-Precursor-Lösung (PEG / Pep / LAP / PBS) in die Spitze einer sterilen, schneiden Spritze. Machen Sie eine einzelne Gel pro Spritze, etwa 0,5 bis 1,5 mm dick auf das Volumen und die Spritze Durchmesser. Hinweis: Größere Mengen untersucht werden können, basierend aufdie gewünschte Gelgröße wo obere Grenzwerte für Diffusionsbeschränkungen für Pep1Alloc existieren basieren kann während Photostrukturierung und / oder Nährstoffe / Abfälle zu / von eingekapselten Zellen während der Zellkultur. Bereiten dünnen Hydrogele in Glasobjektträger Formen durch die Gummidichtung Plazieren (0,254 mm dick), um die Ränder der unbeschichteten Glasträger. Pipette 5-10 ul Gel-Vorläuferlösung auf die nicht-beschichteten Glasobjektträger und legen Sie den Objektträger aus Glas, beschichtet mit antiadhäsiven (einzelne oder mehrere 5-10 ul Gele können durch Pipettieren einen oder mehrere Punkte aus Lösung auf eine einzelne Folie hergestellt werden) auf der Oberseite der Gellösung (größere Gele, bis zu der Größe des Glasobjektträger, kann in Abhängigkeit von der Endanwendung getroffen werden). Sichern Sie sich die Objektträger aus Glas mit kleinen Binder Clips zu stabilisieren. Platz Formen unter der Lampe und stellen Sie die Lampenintensität (zB% Verschluss geöffnet) zu erreichen , 10 mW / cm 2 an der Geloberfläche für Spritzenspitze Formen oder Glasträger Formen auf Basis von Messungen in Schritt 1.7.2 und1.7.3 sind. Anwenden Licht für 1 bis 5 min eine vollständige Polymerisation von Gelen zu ermöglichen. Verwenden Sie eine kürzere Polymerisationszeit für Gele mit höheren PEG4SH Gehalt (8 Gew% oder mehr beträgt, 1 min) und mehr für Gele mit niedriger PEG4SH Gehalt (5-8 Gew%, 3-5 min) zur Erzeugung vollständig polymerisiert Hydrogele mit Moduli innerhalb der Bereich der Weichgewebe (0,5-5 kPa). Ort Gele aus Spritzenspitze Formen in eine sterile nicht-behandelten 48-Well-Platte und Ort Glasobjektträger in eine sterile Schüssel. Spülen 3 x 15 min mit Zellkulturmedium oder einem geeigneten Puffer (zB PBS + PS + FZ, Ellman-Reaktionspuffer) , basierend auf geplanten Experimenten, wie im Folgenden beschrieben. Herstellung von Patterned Hydrogele. Mischen Sie Stammlösungen von PEG4SH, Pep2Alloc, LAP und PBS + PS + FZ entsprechend der Tabellenkalkulation, so dass freie Thiole (0,2-5 mM) für die spätere Umsetzung mit Pep1Alloc. Pipette, um die Vorläuferlösung kräftig selbst, um sicherzustellen, der Lösung zu mischen. Bereiten Sie dick und dünn Hydrogele wie in den Schritten 2.1.2 bis 2.1.6 angelegt. HINWEIS: Stellen Sie keine Gele in einem Wachstumsmedium vor der Photostrukturierung. Freie Thiole können durch Spezies in dem Wachstumsmedium (zB Disulfidbildung mit Thiol-haltigen Proteinen) und wird nicht zulassen , Strukturieren des Gels , ohne zusätzliche Verarbeitungsschritte (zB Reduktion von Disulfidbindungen) verbraucht werden. Bereiten Sie Lösungen von Pep1Alloc (Endkonzentration ~ 3-20 mg / ml) und 2,2 mM LAP. Abdecken vorgeformte Gele mit Pep1Alloc / LAP-Lösung und Inkubation für 1 Stunde bei 37 ° C. Überschüssiges Pep1Alloc / LAP Lösung. Wenn Gele in einer Spritzenspitze geformt wurden, mit einem Spachtel vorsichtig die Gele aus der 48-Well-Platte übertragen, in der sie in ein steriles Glasträger zur Strukturierung werden inkubiert werden. Legen Sie eine Fotomaske mit dem gewünschten Muster direkt auf der Spritzen- und Objektträger aus Glas geformten Gele. Stellen Sie sicher, dass die gedruckte Teil der Maske das Gel berührt für eine optimale pattern Treue (dh sollte Maske richtig gelesen und Emulsionsseite sein nach unten). Platz Proben unter der Lampe und bestrahlen für 1 min mit den Lampeneinstellungen verwendet für Glasobjektträger (Schritt 1.7.3). Nach Strukturierung Ort Gele in eine sterile, 48-Well nicht Gewebekultur behandelten Platte und Ort Glas Gele-Spritze geformt Einschub geformt, die auf die Glasobjektträger in eine sterile Schale eingehalten werden. Spülen 3 x 15 min mit Zellkulturmedium oder einem geeigneten Puffer (zB PBS + PS + FZ, Ellman-Reaktionspuffer) , basierend auf geplanten Experimenten. 3. Visualisieren und Quantifizierung von Photopatterning Ellman-Assay zum Nachweisen und Quantifizieren freie Thiole in photostrukturiert Hydrogelen. Bereiten Ellman-Reaktionspuffer, Cystein Arbeitslösung, Standards und Ellman-Reagens wie nachstehend beschrieben. Für Ellman-Reaktionspuffer, lösen sich 2,4 g Natriumhydrogenphosphat (Na 2 HPO4) und 74,4 mg Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in 200 ml DIH 2 O (0,1 M Na 2 HPO 4, 1 mM EDTA). Den pH – Wert auf 7,5-8 mit Lösungen von Natriumhydroxid (NaOH) oder Phosphorsäure (H 3 PO 4). Für Cysteine ​​Arbeitslösung lösen sich 5,27 mg Cystein in 15 ml Reaktionspuffer (2 mM Cystein). Für Cysteine ​​Standards, Cystein Arbeitslösung in Reaktionspuffer auf eine Endkonzentration von 2, 1,5, 1,25, 1, 0,75, 0,5, 0,25 und 0 mM Cystein verdünnen. Für Ellman-Reagenz lösen 4 mg Ellman-Reagens in 1 ml Reaktionspuffer. Beschallen vollständig das Reagenz des Ellman aufzulösen. Quantifizierung der Konzentration von freien Thiolen in Gelen mit Ellman-Assay (Abbildung 2). HINWEIS: 'Thin' 5 ul Hydrogele, zwischen Glasplättchen geformt, sind in der unten beschriebenen Verfahren und empfahl eine schnelle Diffusion von Ellman-Reagenz t zu ermöglichenurch das Gel (dh benötigt das Reagenz eine längere Zeit durch dicke Gele zu diffundieren). Bestimmen die gequollenen Gelvolumen "dünn" 5 ul Gelen (V S) auf der Grundlage der volumetrischen Quellverhältnis, Q. Machen Sie drei 20 ul 'dick' Gele mit Spritze Formen. Platz Gele in Ellman-Reaktionspuffer für 24 Stunden und anschließend wiegen (Gleichgewicht gequollenen Masse, M S). Lyophilisieren die Gele und anschließend wiegen (Trockenmasse, M D). Unter Verwendung der gemessenen Massen für dicke Gele, die Berechnung der Volumenquellverhältnis von 28 Q = 1 + ρ Polymer / ρ Lösungsmittel (M S / M D -1) wobei ρ Polymer = 1,07 g / cm 3 für PEG, 29 ρ Lösungsmittel = 1,0 g / cm 3 für PBS / H 2 O. Berechnen Sie die theoretische Trockenmasse des Gels für Ellman-Assay verwendet werden (hier: 5 ul "dünn" Gele sind in der Regel uSED), durch die Massen der einzelnen Komponenten summiert PEG4SH, Pep1Alloc und Pep2Alloc (M D = M PEG4SH + M + M Pep1Alloc Pep2Alloc). Beispielsweise ein 5 & mgr; l Gel 10 Gew% enthält PEG4SH enthält etwa 0,000535 g PEG , wie durch M PEG4SH berechnet = 0,005 cm 3 x 1,07 g / cm 3 x 0,10. Pep1Alloc und Pep2Alloc Massen können in ähnlicher Weise berechnet werden , basierend auf Gewichts-% in Lösung (siehe die Tabelle für Werte), p ≈ 1,0 g / cm 3 für diesen wäßrigen Lösungen übernehmen. HINWEIS: Die Gele auch getrocknet und stattdessen gewogen werden, um die theoretischen Trockenmasse zu berechnen. Es kann jedoch konsequent die Trockenmasse der dünnen, 5 ul Gele messen schwierig sein, zu. Basierend auf der vorhergesagten Trockenmasse und dem Wert Q bestimmt von 'dick' Gele, die Berechnung der vorhergesagten geschwollene Masse M S für die "dünne" Gel (Gleichung in Schritt 3.1.2.1.1). Es sei angenommen, daß ρ ≈ 1,0 g / cm <sup> 3 ist , dann V S ≈ M S. Verwenden Sie diese berechnet V S quantitative Ellman-Test durchzuführen. HINWEIS: Das obige Verfahren wird empfohlen, V s für geschwollene Gele als "dünn" 5 ul Gele sind schwierig zu übertragen zum Wiegen bestimmen. Bilden dünne Hydrogele zur Strukturierung, wie in Abschnitt 2.2 (5 ul Volumen) beschrieben. Insbesondere machen Gele mit einem Überschuss an freien Thiolen und "Muster" die Hälfte dieser Proben mit Pep1Alloc einen klaren Deck das gesamte Gel mit Licht (zB 6 insgesamt Gele mit einem Überschuss an Thiol zu überfluten mit aussetzen: 3 unmodifizierten nicht'patterned 'und 3' gemustert'). HINWEIS: Für diesen Test "gemustert" Gele Flut ohne eine Photomaske Licht ausgesetzt sind. Diese Methode wird verwendet, um die Gesamtzahl der freien Thiole in der gesamten Gelprobe verbraucht zu bestimmen und zu zeigen, wie wirksam freie Thiole können mit dem Peptid modifiziert werden. Aus diesen Informationendie Anzahl der freien Thiole während der Strukturierung mit einem Photomaske verbraucht kann basierend auf der Geldicke und Musterbereich (Bereiche belichtet) vorhergesagt werden. Place 'gemustert' und nicht-'patterned 'Gelen in Vertiefungen einer 48-Well-Platte und Spülen 3 x 15 min mit Ellman-Reaktionspuffer Diffusion von nicht umgesetzten Spezies zu ermöglichen, aus dem Gel und Quellgleichgewicht auftreten. Fügen Sie zusätzliche Ellman-Reaktionspuffer zu den gespülten Gele , so dass V s mit Reaktionspuffer ein Vielfaches von 20 & mgr; l ist. Wenn beispielsweise die vorhergesagte V S 15 & mgr; l ist, werden 5 & mgr; l Reaktionspuffer (20 ul), und wenn die vorhergesagte V S 30 & mgr; l, mit 10 & mgr; l Reaktionspuffer (40 ul). Pipettieren die Cystein – Standards in einzelne Vertiefungen (nicht haltigen Gelen) einer 96-Well – Platte in Vielfachen von 20 & mgr; l in Abhängigkeit von dem Volumen in dem vorhergehenden Schritt verwendet wird (dh wenn der vorherige Schritt hatte V S + extra Reaktions bUffer = 40 & mgr; l, dann werden 40 ul jeder Standard auf einzelne leere Brunnen). Verdünnen Ellman-Reagenz in Reaktionspuffer ( ein Vielfaches von 180 & mgr; l Reaktionspuffer + 3,6 ul Ellman-Reagenz, zB 183,6 für 20 & mgr; l oder 367,2 ul für 40 & mgr; l in Schritt 3.1.2.5). In verdünnter Ellman-Reagenz in Vertiefungen, die Standards und Proben. Für 20-ul-Proben, fügen Sie zu jeder Vertiefung 183,6 ul-Lösung. Doppel diese Menge an verdünntem Reagenz des Ellman für 40 & mgr; l-Proben (oder maßstäblich auf die Größe der Probe entsprechend basiert). Inkubieren oder legen Sie auf einem Schüttler für 1 Stunde und 30 min (bei Raumtemperatur) oder bis die Farbe der Lösung die Farbe der Gele durch visuelle Inspektion übereinstimmt ausreichende Diffusion des gelben 2-Nitro-5-Thiobenzoat Dianion (TNB, um sicherzustellen, 2-), die bei der Reaktion von Ellman-Reagenz mit freien Thiolen, aus dem Gel erzeugt wird. Nehmen Sie 100 ul Lösung von Proben und standards aufnehmen und in Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Lesen Sie die Absorption bei 405 nm auf einem Plattenleser. Um die Daten, zeichnen Sie die Standardkurve (Proben aus Schritt 3.1.1.3) (Absorption gegen Konzentration) und passen eine lineare Funktion verarbeiten. Mit Hilfe der linearen Funktion, um die Konzentration von freien Thiolen in der "verdünnt Gel-Lösung (Gel + Reaktionspuffer) kann basierend auf Absorptionswerte berechnet werden. Schließlich unter Berücksichtigung der "Verwässerung" mit Reaktionspuffer, bestimmen die freie Thiol-Konzentration in den Gelen ohne Reaktionspuffer. (Beispielsweise , wenn 15 ul Gel mit 5 & mgr; l Reaktionspuffer verdünnt, multipliziere mit 20/15). Visualisierung von photopatterns mit Ellman-Reagens (3A). Soak dünne Hydrogele gemustert mit Pep1Alloc in Ellman-Reaktionspuffer für 1 Stunde. Entfernen Puffer überschüssige Reaktion vorsichtig mit einem Tuch um die Ränder des Hydrogels abwischen. Pipette Ellman-Reagenz direkt auf der Oberfläche des Gels. Unmittelbar Bild auf einem Lichtmikroskop mit 10facher oder Stereomikroskop mit einer Farbkamera. Hinweis: Die Gele müssen sofort abgebildet werden , da Visualisierungsmuster innerhalb von 5 Minuten , wie das gelbe TNB 2- Ion durch Spaltung von Ellman-Reagenz bei der Reaktion mit Thiolen in nicht strukturierten Gebiet erzeugt zerstreuen diffundiert im gesamten Gel. Nicht strukturierte Bereiche erscheinen schwach gelb mit dem bloßen Auge; für eine bessere Auflösung und kleinere Muster, Vergrößerung (beispielsweise Verwendung eines Mikroskops) erforderlich. Visualisierung von Photopatterns mit fluoreszierenden Peptide (3B). Für Muster mit höherer Auflösung oder in drei Dimensionen zu visualisieren, photopattern eine AF488 modifizierten Pep1Alloc (oder ähnliches fluoreszierendes Peptid) zu den Gelen in Schritt 2.2. Bild auf einem Fluoreszenzmikroskop. Ein konfokales Mikroskop kann hier verwendet werden, z-st zu nehmenack Bilder des Gels, so dass das Muster in der x- beobachtet werden kann, y- und z-Ebenen. HINWEIS: Bei Fluoreszenz, Gelen muß vor Licht geschützt werden, um die Stabilität des AF488 Fluorophor und maximale Fluoreszenz zu gewährleisten. Gele müssen nicht sofort abgebildet werden, da das fluoreszierende Peptid ziemlich stabil, wenn von Licht (Speicher in einem Behälter in Folie bei 4 ° C verpackt) geschützt. 4. Zellverkapselung in Hydrogele und Photopatterning Das Sammeln und Vorbereiten Zellen für die Verkapselung. Nach Standard sterilen Kulturverfahren Säugerzelle, trypsinize und Zellen von Interesse von den Platten zu sammeln. Um das Trypsin mit Wachstumsmedium Quench nach der Ablösung auftritt (zB für einen T-75 – Kolben, 5 ml Trypsin, mit 5 ml Medium auslöschen spülen Platte mit 5 ml Medium für insgesamt 15 ml). HINWEIS: Trypsinisierung Zeiten zwischen Zelltypen variieren kann, aber typischerweise zwischen 5 und 15 min auftreten. Alternative Zelle detachment Mittel (zB Versene) verwendet werden , um Zellen zu sammeln , falls gewünscht. Zählen von Zellen (ein Minimum von 100 oder per Protokoll des Herstellers) von Aliquots der Zellsuspension trypsinisiert unter Verwendung eines Hämozytometers oder anderen Zell Zählvorrichtung während Zentrifugieren der Massenzellsuspension (90-110 xg, 5 min). Re-suspendieren Zellpellet nach der Zentrifugation in einem minimalen Volumen von PBS oder Wachstumsmedium und NACHZÄHLUNG wenn die anfängliche trypsiniert Zellsuspension zu verdünnen. Re-suspendieren Zellen in einem minimalen Volumen von PBS und aliquote Teile für jedes Gel Zustand in Mikrozentrifugenröhrchen, so dass 5000 Zellen / & mgr; l, wenn es mit dem Gel-Lösung (vor der Polymerisation) gemischt wird. HINWEIS: Typische Zell Aliquots enthalten 300.000-500.000 Zellen und sind ausreichend 60-100 ul Gel / Zellsuspension zu bilden, die 3-5 x 20 & mgr; l-Gelen mit 5.000 Zellen / & mgr; l verwendet werden können. Höhere oder niedrigere Zelldichten für die Verkapselung verwendet werden können, abhängig von der Menge an Zell-Zellvs. Zell-Matrix-Kontakt gewünscht sind, und sollte für jede Anwendung bestimmt werden. Zentrifugenzelle / PBS Aliquots (90-110 xg, 5 min). Sorgfältig absaugen PBS aus Zellpellet in Mikrozentrifugenröhrchen direkt vor der Einkapselung. HINWEIS: Wenn Zellen sind empfindlich gegenüber Scherkräften kann die zweite Zentrifugationsschritt durch Zählen (zB Hämozytometer) und anschließend Aliquotieren der Zellsuspension trypsinisiert (Trypsin + Medien + Zellen) in Abschnitte für jede Gelzustand benötigt beseitigt werden. Diese Aliquots werden einmal zentrifugiert (90-110 xg, 5 min) und das Trypsin + Medium wird abgesaugt, ein Zellpellet für die Verkapselung zu verlassen. Einkapseln von Zellen in nicht strukturierten Hydrogele. Unmittelbar nach PBS Ansaugen suspendieren pelletierten Zellen in PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP und PBS + PS + FZ, wie in der Tabelle auf eine Endkonzentration von 5000 Zellen / & mgr; l errechnet. Schimmel und polymerisieren Hydrogele als Beschribed in Schritten 2.1.2 bis 2.1.6. HINWEIS: Wenn Zellen in Glasobjektformen Einkapseln darauf geachtet werden muss, wenn der obere Objektträger Nachpolymerisation Entfernen des Gels zu verhindern Scherung, die zum Zelltod führen kann. Um Hilfe bei der Entfernung des Gels aus der Form, Dia-Formen können in sterilem PBS oder Wachstumsmedium nach der Polymerisation gebracht werden, um die Dichtung und Hydrogel zu benetzen, wodurch es einfacher, um den Oberschlitten entfernen. Verfahren diese Scher gänzlich zu verhindern, ist die Verwendung von Spritzenformen. Rinse Gele 3 x 10 min in einem Wachstumsmedium zu entfernen, nicht umgesetzten Spezies und überschüssiges LAP. Inkubieren Gelen in Wachstumsmedium bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zum gewünschten Zeitpunkt für die weitere Analyse. Aufzufüllen Medium alle 48 h oder bestimmt für die Anwendung (beispielsweise typische Zuführungsintervall für spezifische Zelltyp und Medium). Einkapseln von Zellen und Photopatterning in Gegenwart von Zellen. Unmittelbar nach PBS AbsaugenSuspend pelletierten Zellen in PEG4SH, Pep2Alloc, LAP und PBS + PS + FZ, wie in der Tabelle auf eine Endkonzentration von 5000 Zellen / & mgr; l errechnet. Lassen eine angemessene Konzentration an freien Thiolen (zB 2 mm) für eine spätere Reaktion mit Pep1Alloc. Mold, polymerisieren, und das Muster Hydrogele wie in den Schritten 2.2.2 bis 2.2.8 beschrieben. Rinse Gelen 3 x 10 min in einem Wachstumsmedium nach dem Strukturieren nicht umgesetzten Spezies und überschüssigem LAP zu entfernen. Inkubieren Gelen in Wachstumsmedium bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zum gewünschten Zeitpunkt für die weitere Analyse. Füllt Medium alle 48 Stunden oder so für die Anwendung bestimmt. 5. Die Ermittlung der Viability und die metabolische Aktivität von verkapselten Zellen Führen Sie Live / Dead Zytotoxizitätstest Encapsulated Cell Viability (4A) zu bestimmen. Entfernen Wachstumsmedium aus Gelen und spülen Sie 3 x 15 min mit PBS Diffusion von Medium zu ermöglichen, von gels. Thaw Live / Dead-Zytotoxizitätstest Lösungen (Ethidiumhomodimer-1 und Calcein AM). Hinzufügen 2 & mgr; l der 2 mM Ethidium Homodimer-1 und 0,5 & mgr; l der 4 mM Calcein AM Lösungen zu 1 ml sterilem PBS. Vortex vollständige Vermischung zu gewährleisten. In 300 ul Färbungslösung zu jeder Spritze Form Gel in 48-Well-Platten, oder genug, um die Oberfläche des Gels auf einem Glasobjektträger in einer sterilen Schale zu bedecken, und für 45 min inkubiert. Entfernen Sie überschüssige Färbelösung und spülen überschüssige Farbstoff aus den Gelen zu entfernen (3 x 15 min mit PBS). Bild auf einem konfokalen Mikroskop (z-Stapel-Bilder) oder auf einem Epi-Fluoreszenzmikroskop mit z-Stack-Fähigkeit bei 10X und 488/525 nm Ex / Em. Quantifizierung der Zahl der lebensfähigen Zellen durch den z-Stapel vorsteht und Zählen der Anzahl von lebenden (grün gesamten Zellkörper) und tote (rot Kerne) Zellen, die mit Bildbearbeitungssoftware. Führen Sie die metabolische Aktivität Assay Zellaktivität post-Verkapselung (Figu zu bestimmenre 4B). 24 Stunden vor, Futtermittel eingekapselten Zellen mit frischem Wachstumsmedium zu untersuchen. HINWEIS: In mittleren bis ein paar zusätzliche Vertiefungen (enthaltend keine Gele oder Gele ohne Zellen) als Kontrolle (Hintergrund Lesungen). Zu dem Zeitpunkt, von Interesse, tauen MTS Reagenzlösung. HINWEIS: Um die metabolische Aktivität im Laufe der Zeit ist, ein Anfangszeitpunkt (12-24 Stunden nach der Verkapselung) als zum Vergleich zu späteren Zeitpunkten Referenz empfohlen, um zu bestimmen. Hinzufügen MTS-Reagens in jede Vertiefung (20 & mgr; l pro 100 & mgr; l Wachstumsmedium). Inkubieren Proben für 1-4 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2, den Anweisungen des Herstellers. HINWEIS: Die Inkubationszeiten ausreichend sein sollte, für Zellen MTS zu reduzieren und aus dem Gel Diffusion des Formazan-Produkt ermöglichen. Folglich dickere Gele wie Spritzenspitze Gele können längere Inkubationszeiten (ca. 4 h) benötigen für eine ausreichende MTS Reduktion und Diffusion. Je 100 & mgr; l reduziert MTS / Mediumin saubere Vertiefungen einer 96-Well-Platte und Aufzeichnung der Absorption bei 490 nm auf einem Plattenleser. Ziehen Sie die Hintergrundabsorption für Vertiefungen ohne Zellen, die aus Probenabsorptionswerte mit Baseline-Absorptionswerte zu erzeugen.