マイクロ流体プローブとのライブの細胞層の急速なサブトラクティブパターニング

1. MFPヘッドとプラットフォームのクリーニングと準備注：このプロトコルは、MFPが15,16ヘッド縦型シリコン・ガラスハイブリッドを使用しています。ヘッドのシリコン成分は、100μmの深さまでエッチングされたマイクロチャネルを、含まれています。エッチングされたシリコンを陽極接合を用いてガラスに接合されています。チャネルの設計は、液浸液（ 図1）を注入するための6チャネル、注入及び吸引用の2つのそれぞれ、および2つからなるパターンを含みます。浸漬液を注入するために使用されるチャネルは、このように吸引し、蒸発による損失を回避し、生物学的サンプルを周囲の媒体を補充します。内側チャンネルと現在の仕事で使用される外側のチャンネルは100×100μmでそれぞれ200×100μmです。ポスト製造および処理、クリアなチャネルと洗練頂点とMFPヘッドが得られます。 ポンプステーションと流体ハンドリングの調製装置注射器に接続されているすべてのチューブのための1/16 ''（1.59ミリメートル）の外径および0.02 ''（0.51ミリメートル）内径の毛細管を使用してください。アプリケーションに基づいて、毛細管サイズを変更し、注射器でMFPヘッドをインターフェースするために適切なコネクタおよび付属品を得ます。希釈が必要で、どこにいても、超純水を使用してください。 超純水の前対と後生細胞実験では0.5％の漂白剤溶液中で超音波処理により – （500μlの容量250）とシリンジプランジャクリーンシリンジ。水でそれらを徹底的に洗浄します。水浴中で完全にその先端を浸漬し、プランジャーを使用して吸引することにより、水でそれらを埋めます。一方、注射器の出口にシールを接触させ、シリンジ軸と水浴内の液体をパージします。空気の泡がシリンジ列に見られなくなるまで吸引パージを繰り返します。 ルアーロックコネクタを使用して、シリンジポンプに充填された注射器を接続します。搭載された切替弁を使用してくださいMFPヘッドにまたは液体貯蔵槽（ 図6）のいずれかをリードする2つの毛管のいずれかに注射器から液体を方向付けるためのポンプ。 （何の切替弁が利用できない場合はセクション1.4.4を参照してください）​​。水の約10μlのがシリンジ内に残されるまで、シリンジのサイズに応じて、50μL/分 – 約10の流速で注射器から水と毛細血管の両方を消去します。 （ -資料を参照してください。 例えば、M1コネクタ）ヘッドのチャネルのビアとのインタフェースを適切なマイクロ流体コネクタ/アダプタにパージ毛細血管を事前に挿入します。 MFPヘッドの準備 5分間、厳しい洗浄のための標準的な洗浄または0.5％の漂白剤用ガラス製品の洗剤を使用して超音波処理によるMFPヘッドを清掃してください。水に頂点を浸漬し、ビアに真空を適用することにより、水とチャンネルをパージします。 潜在的な障害物（目詰まり）と再用実体顕微鏡下でチャンネルを点検必要に応じて、前のステップを泥炭。 ヘッドホルダにクリーンヘッドをマウントして、頭の上に事前に挿入され、パージチューブとコネクタをネジ止めします。頭部および細胞単層との間のギャップ距離を制御するために使用されるZステージにヘッドホルダねじ。 MFPプラットフォームの走査ステージを校正 適切なソフトウェアインターフェースを備えた製造業者のプロトコルに従って、プラットフォームにヘッドを接続する前に、X軸、Y軸およびZ-ステージのエンドポイントキャリブレーションを実行します。キャリブレーションされたステージは、MFPヘッドの位置決め精度を確保します。 細胞を含まないチャンバースライド上でMFPヘッドをもたらし、ゆっくりと5μmのステップで下降することにより、粗ゼロギャップ距離（ゼロ）を取得します。基板とプローブ接触すると、ニュートンリングが観察されるはずです。これは、粗推定値です。正確な位置はsubstratにプローブ頂部のコプラナリティを調整した後に得られるべきです電子。 プローブ頂点のコプラナリティを確保するために、（頭のインタフェースおよびZステージで）ゴニオメーターを使用して、ヘッドの傾きを調整します。形成されたときにニュートンリングが対称（ 図1）であることを確認してください。 20μmの基板から離れMFPヘッドを移動し、ゴニオメータを使用して傾きを調整します。繰り返し下降、ニュートンリングが接触して対称になるまでゼロとチルト調整。チルト調整では、ゼロとして対称ニュートンリングを生成zの位置を設定します。 注：XYステージは、基板（ 図2）の走査を制御する一方、Zステージは、ヘッドと基板の距離を制御します。詳細な説明は、私たちの以前の研究14で見つけることができます。 細胞層の局所的な除去のための化学的製剤 注意：必要に応じて、用意されている化学物質のために（ 例えば 、ニトリル手袋、安全眼鏡を）安全装置を使用しています。ヒュームHOOを使用します必要に応じて溶液を調製するためのDは希釈剤として超純水ですべての化学物質およびバッファを準備します。 内側の注入チャンネル（ 図1のフローQ I2とI2）のための処理液として50mMのNaOH溶液を準備します。 50 mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンで抽出バッファを1mMからなる外注射のために必要な溶液（ 図1の流量Q I1とI1）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、0.5％のツイーン20、及び10μMのローダミンBを準備パージのためのpH 8.、吸引注射器で水を使用しています。 0.2μmシリンジフィルターを使用して、すべてのソリューションをフィルタリングします。ドガは、すべての面にバブリング溶存空気停止するまでデシケーターを使用してソリューションを濾過しました。 シリンジポンプに接続されたドレイン線を使用して、残余の水をパージし、シリンジ（250または500μl）をいっぱいになるまでの40μl/分で注入シリンジに脱気ソリューションを吸引。これは、気泡のない注射器の充填、コネクタ、および毛細血管を保証します。注射器スイッチバルブ-2-キャピラリーシステムは、注射器の半ば実験の充填を可能にします。このような切替弁が存在しない場合には、ヘッドからの毛細血管を切断し、頭部にそれらを再接続する前に脱気したソリューションを吸引することにより、毛細血管および注射器を埋めます。 毛細血管を介して処理し、シールドの液体を吸引すると、動作中に、小容量の使用を可能にします。化学物質が大量に調製することができる場合は、直接、必要な溶液で注射器を充填します。例えば、水を含む吸引注射器は、このアプローチを使用して充填することができます。 1.4.1と1.4.2で定義されているように、各チャネルのために割り当てられた液体とMFPヘッドにキャピラリをパージします。 注：抽出緩衝液は、内側閉じ込め中​​のNaOHを遮蔽し、緩衝液中のローダミン成分は番目の可視化を容易にします動作中の電子hHFC。 細胞は、細胞凝集体が培養表面に現れると、過剰コンフルエントである場合は、10％のプロテイナーゼKで抽出緩衝液を補足これは、溶解物を吸引チャンネルに入るように変性したタンパク質を溶解することによってこれらの凝集体でのNaOHの作用を補足します。これは、動作中のチャネルの目詰まりを防ぐことができます。 チャンバースライド上の細胞単層の調製 注意：細胞を培養するための細胞培養フードを使用して、実験室でのバイオセーフティ担当者によって設定された規則に従って機器を扱います。特定の細胞株の特別な要件に注意し、それに応じてプロトコルや機器を適応させます。 文化や細胞の拡大のために使用する細胞培養インキュベーター（5％CO 2で、37ºCで）がパターン化されます。 Tフラスコ内で標準的な細胞培養プロトコル17,18を使用して拡張を行います。特定のセルの要件に応じて培養培地を使用してくださいリットルライン（ 例えば 、血清および抗生物質は、MCF7とMDAMB 231を培養するためのDMEMを補足します）。 培養フラスコに細胞コンフルエンスに達すると、トリプシン処理し、48時間かけてパターニングと文化のための2チャンバースライドの各セルとシード2×10 5細胞/ cm 2を収集します。細胞の増殖および生存のためにコントロールとしての室のいずれかで細胞を使用してください。 無血清培地中で調製10μMの濃度で、チャンバースライド上の細胞コンフルエンスに達すると、500μlの細胞トラッカー色素溶液（CMRA – – CMFDAまたはオレンジ例えば 、緑色）で45分間、細胞をインキュベートします。これは、パターニングの際に、細胞の可視化のために行われています。静かにパターニング実験のために血清を補充した培地中で細胞をピペットを用いて、その後、文化の各チャンバーを洗浄することによりPBSで標識された細胞を洗浄。 細胞計数のために、細胞トラッカー染色された細胞表面の基準画像を取得します。これは保証するために行われています細胞層の密集。また、サンプルの回収およびDNA分析が目的であれば定量化実験のための助剤として機能します。 注：細胞生存率は、パターニング時に評価されるべきである場合には、細胞は、製造者の指示に応じて、生/死細胞毒性キットを用いて染色することができます。 2.作成階層的流体力学的流動閉じ込め（hHFC） ガラススライドから50μmのギャップ距離に細胞単層上でMFPを移動します。 hHFCの接触を確保しつつ、このギャップ距離は、また、単層の表面と厚さの変化を占めます。 i2を介して6または8μL/ minでのNaOHを注入します。 図3のフロールールを使用して、他の流量（ すなわち、Q I1、Q A1とQ A2）を評価します。 注射器を使用してQ I2 / I1 Qの比を変化させることにより、内側HFCの大きさを調節します。300細胞（100 – – 200μmの2 /セル）（Q I2が 150のNaOHのフットプリントをもたらす8μL/分に固定して、例えば、1.3μL/分および4μL/分の間Q I1を使用図3D）。 hHFCの動作中に媒体と吸引の蒸発を考慮して20μL/分の流速でMFPヘッド上の最も外側の開口部から完全培地を注入します。 hHFCを使用した3パターニング細胞単層注：スキャンパターンは、特定の生物学的な質問を研究するために、残りの細胞を残して、細胞が抽出された細胞単層（サブトラクティブパターニング）の領域を決定します。このパターンは、例えば、直線又はスポットのアレイとすることができます。複雑なパターンは、適切な走査軌跡の設計を必要とします。例えば、市松走査軌跡は、 図4（a）の例に示す細胞領域（のグリッドを提供します</stronグラム>）、近接しながら別の正方形のセルに異なる刺激の効果を研究する有効であろう。これらのパターンは、制御ソフトウェアは、細胞単層上でMFPヘッドのスキャン軌道のスクリプトを可能にするプラットフォームのXYステージの制御を使用して作成することができます。 50μmのギャップ距離で10ミクロン/秒のスキャン速度で（X、YおよびZ座標を設定することにより）ユーザ定義パターンで細胞単層を介してプローブヘッドをスキャンする段階ソフトウェアを設定します。 ネストされたhHFC操作で単層に接触すると、パターン化された細胞の除去を達成するために、所望のパターンの軌道でMFPをスキャンします。 第1の細胞型を除去した後、共培養のために、セクション1.5に記載の方法を用いて、ギャップを埋めるために、異なる細胞株をシード。細胞の除去を制御する（例えば、ギャップ距離を増加させることによって）、ネストされたとピンチモードの間で移動します。 注：スキャン速度はinvestiしなければならないことがあります他の細胞株のためのゲーティング。使用した細胞株のためにスキャンされた領域上に、このデモの影響完全な細胞の除去に使用される走査速度。 サンプリングとDNA増幅のための4ダウンストリーム処理溶解物の下流の分析のためのサンプリングステーションを準備します。サンプリングステーションの場合、3Dは8ストリップPCRチューブホルダーを印刷してください。代替的に、基板の外部ヘッドの走査範囲内に装着されることができる、このアダプタとして機能するために適切なチューブホルダーを選択します。 70％エタノールまたは用途に所望のストリンジェンシーに基づいて、他の表面除染とチューブホルダを拭いてください。基板ホルダー上にそれを接続するチューブホルダーに磁気クリップを使用してください。 サンプリングステーションを準備した後、単層から複合機ヘッドは100μmを置きます。 1の流量で内部注入チャンネル用の処理液として50mMのNaOH溶液でhHFCの動作を開始6それぞれQ I1、Q I2、Q A1とQ A2ため、-7および-17.5μL/分。 フロー閉じ込めが（約10秒で）安定した後、hHFCによる細胞の選択された亜集団のNaOHをベースのローカル溶解を実行するために50μmのギャップ距離にプローブヘッドを下降。亜集団の溶解が（設置面積あたり約30秒）完了すると、サンプリングステーションでチューブに向かって頭を向けます。 （ 図6）を直接PCRチューブに回収し、溶解物を取り出します。 溶解物の下流処理のために、第一のトリス緩衝液（1：1）を用いて溶解物を混合することによって溶液のpHを中和します。中和した後、30分間、95ºCに溶解物を加熱します。機器のサプライヤーによって設定されるように、直接、標準のqPCRワークフローにライセートをロードします。