Rapid Subtractieve patroonvorming van Live-Cell Lagen met een microfluïdische Probe

1. MFP Head en Platform Reiniging en voorbereiding LET OP: Dit protocol maakt gebruik van verticaal georiënteerde silicium-glas hybride MFP hoofd 15,16. De siliciumcomponent van de kop bevat de microkanalen die geëtst tot een diepte van 100 urn zijn. De geëtste silicium gebonden aan glas gebruikt anodische binding. Het kanaal ontwerp bestaat uit een patroon van zes kanalen, twee elk voor injectie en aspiratie, en twee voor het injecteren van de immersievloeistof (figuur 1). De kanalen worden gebruikt voor het injecteren van onderdompeling vloeistof vullen de media rondom het biologisch monster, waardoor de verliezen als gevolg van aspiratie en verdamping vermeden. De binnenste en buitenste kanalen kanalen die gebruikt worden in de huidige werkzaamheden zijn 100 x 100 micrometer en 200 × 100 micrometer respectievelijk. Bericht fabricage en verwerking, MFP hoofden met duidelijke kanalen en gepolijste toppen worden verkregen. Voorbereiding van het pompstation en de vloeistof-handlinginrichting Gebruik capillairen met een 1/16 '' (1,59 mm) buitendiameter en 0,02 "(0,51 mm) binnendiameter alle slangen aangesloten op de spuiten. Variëren capillaire afmeting gebaseerd op de toepassing en het verkrijgen van de juiste connectors en accessoires voor de interface van de MFP hoofd met de spuiten. Gebruik ultrapuur water waar verdunningen nodig zijn. Schone spuiten (250-500 pi volume) en spuit plunjers door sonicatie in 0,5% bleekwater oplossing in ultrapuur water voorafgaand to-en post-live cell experimenten. Spoel ze grondig met water. Vullen met water door het volledig onderdompelen van de uiteinden in een waterbad en aanzuigen via de zuiger. Spoel de vloeistof, terwijl binnen het waterbad met de spuit as contact opnemen met de afdichting bij de uitgang van de spuit. Herhaal aspireren en spoelen tot er geen luchtbellen worden gezien in de spuit kolommen. Sluit injectiespuiten aan de spuit pompen met behulp van Luer lock-connectors. Gebruik een schakelklep aangebracht op depompen om de vloeistof van de spuit direct naar één van twee capillairen die ofwel de MFP hoofd of de vloeistofreservoirs (figuur 6). (Als er geen switch afsluiter is beschikbaar zie paragraaf 1.4.4). Purge beide capillairen met water uit de spuiten met een debiet van ongeveer 10-50 pl / min, afhankelijk van de grootte van de injectiespuit tot ongeveer 10 pl water achterblijft in de spuiten. Pre-steek de gespoeld haarvaten in een geschikte microfluïdische connector / adapter die raakvlakken met het kanaal via's in het hoofd (bv M1 connector – zie materialen). MFP hoofd voorbereiding Reinig de MFP hoofd door sonicatie behulp glaswerk wasmiddel voor het standaard reiniging of 0,5% bleekmiddel voor strenge schoonmaak, gedurende 5 minuten. Purge kanalen met water door onderdompeling van de apex in water en onder vacuüm brengen van de via. Inspecteer kanalen onder een stereomicroscoop voor potentiële obstakels (verstopping) en opnieuwturf de vorige stap indien nodig. Monteer het schone kop op de kophouder en schroef de connector met de vooraf geplaatst en gespoeld slang op de weg. Schroef de kophouder de Z-fase, die wordt gebruikt voor de bestrijding van openingsafstand tussen de kop en de cel monolaag. Kalibreren van de scanning stadia van de MFP-platform Voer eindpunt kalibratie van de X-, Y- en Z-fasen voorafgaand aan het verbinden van de kop naar het platform, volgens het protocol van de fabrikant met een geschikte software-interface. Gekalibreerde etappes zorgen voor nauwkeurigheid bij het positioneren van de MFP hoofd. Het verkrijgen van een ruwe nul openingsafstand (op nul zetten) door aanpassing van de MFP hoofd over een kamer dia zonder cellen en langzaam dalen in 5 micrometer stappen. Bij probe contact met het substraat, dient Newton ringen worden waargenomen. Dit is een ruwe schatting. Een nauwkeurige positie te verkrijgen na aanpassing coplanarity de probe apex naar het substraate. Om coplanarity de sonde apex waarborgen, past de kanteling van de kop met een goniometer (op het grensvlak van het hoofd en de Z platform). Wanneer gevormd opdat de ringen van Newton symmetrisch (figuur 1). Beweeg de MFP hoofd 20 urn uit de buurt van de ondergrond en stel tilt met behulp van de goniometer. Herhaal de afdaling, op nul zetten en kantelverstelling tot ringen van de Newton's zijn symmetrisch op contact. Met tilt bijgesteld, stel de Z-positie die symmetrisch Newton ringen produceert als nul. OPMERKING: De Z-fase regelt de head-to-substraat afstand, terwijl de kruistafel regelt het scannen van het substraat (figuur 2). Een gedetailleerde uitleg kunt u vinden in onze eerdere werk 14. Chemische producten voor de lokale verwijdering van cellagen Let op: In voorkomend geval, de veiligheid van het gebruik apparatuur (bijvoorbeeld, nitril handschoenen, een veiligheidsbril) voor de chemicaliën die worden voorbereid. Gebruik een fume hood zonodig voor het bereiden van oplossingen. Bereid alle chemicaliën en buffers met ultrapuur water als oplosmiddel. Bereid 50 mM NaOH oplossing de behandelingsvloeistof voor de binnenste injectiekanaal (i2 met stroom I2 Q in figuur 1). Bereid de extractiebuffer oplossing nodig voor de buitenste injectie (i1 met stroming Q I1 in figuur 1), bestaande uit 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0,5% Tween 20, en 10 uM rhodamine B in 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethaan bij pH 8. Voor zuivering, water gebruiken in het streven spuiten. Filtreer alle oplossingen met een 0,2 urn spuitfilter. Ontgas alle gefilterde oplossingen met behulp van een exsiccator totdat de opgeloste lucht stop opborrelen. Met behulp van de afvoerleiding aangesloten op de spuit pompen, zuiveren de rest water en zuig de ontgaste oplossingen in de injectiespuiten op 40 pl / min tot het spuiten zijn volledige (250 of 500 pi).Hierdoor luchtbellen vullen van de spuiten, connectoren en capillairen. De spuit-switch ventiel-twee-capillaire systeem maakt het vullen van de spuiten mid-experiment. Bij het ontbreken van een dergelijke switch klep, koppel de haarvaten van het hoofd en de haarvaten en de spuit te vullen door het opzuigen van de ontgaste oplossingen voor hen opnieuw aan te sluiten op het hoofd. Opzuigen verwerking en afscherming vloeistoffen door de capillairen maakt het gebruik van kleine volumes tijdens bedrijf. Indien de chemicaliën kunnen worden bereid in grote hoeveelheden, vullen injectiespuiten met de vereiste oplossingen direct. Zo kan de aspiratie spuiten die water bevatten worden gevuld met deze benadering. Spoel de haarvaten van de MFP hoofd met de voor elk kanaal, zoals omschreven in 1.4.1 en 1.4.2 toegewezen vloeistoffen. OPMERKING: De extractie bufferoplossing schermt het NaOH in de binnenste opsluiting en rhodamine component in de buffer maakt de visualisatie van de hHFC tijdens het gebruik. Als de cellen zijn over-confluent, met mobiele aggregaten die op het gekweekte oppervlak, een aanvulling op de extractie buffer met 10% Proteinase K. Deze aanvulling op de werking van NaOH op deze aggregaten door het oplossen van gedenatureerde eiwitten als het lysaat komt in de aspiratie kanalen. Dit voorkomt verstopping van de kanalen tijdens bedrijf. Bereiding van celmonolagen op kamer objectglaasjes Let op: Gebruik een celkweek kap voor het kweken van de cellen en verwerken apparatuur volgens de geldende voorschriften door de bioveiligheid officer van het laboratorium in te stellen. Let op speciale eisen van specifieke cellijnen en het protocol en de uitrusting aan te passen. Gebruik celkweek incubator (5% CO2 en 37 ° C) voor kweek en uitbreiding van cellen worden gevormd. Voer de uitbreiding van het gebruik van standaard celkweek protocollen 17,18 in T-kolven. Gebruik het kweken van media als per eisen van de specifieke cell lijn (bv serum en antibiotica aangevuld DMEM voor het kweken van MCF7 en MDAMB 231). Bij het ​​bereiken celconfluentie in de kweekkolven, trypsinize en laat cellen en zaden 2 x 10 5 cellen / cm2 in elk van de 2-kamer glijbanen voor patroonvorming en cultuur dan 48 uur. Gebruik de cellen in een van de kamers als controle voor celgroei en levensvatbaarheid. Bij het ​​bereiken celconfluentie op de kamer slides, incubeer de cellen gedurende 45 min met 500 ul cel tracker kleurstofoplossing (bijvoorbeeld groen – CMFDA of oranje – CMRA) en 10 uM concentratie bereid in serumvrij medium. Dit wordt gedaan voor mobiele visualisatie tijdens de patroonvorming. Was de gemerkte cellen met PBS door zachtjes spoelen elke kamer met een pipet, en vervolgens de cellen te kweken in serum-aangevuld medium voor patroonvorming experimenten. een referentiebeeld van het cel-tracker gekleurde celoppervlak verkrijgen ten behoeve van celtellingen. Dit wordt gewaarborgdconfluentie van de cellaag. Daarnaast dient het als een hulpmiddel voor de kwantificering experimenten als monster herstel en DNA-analyse zijn doelstellingen. LET OP: In het geval dat de levensvatbaarheid van de cellen is om tijdens de patroonvorming worden beoordeeld, kunnen de cellen worden gekleurd met een Live / Dead cytotoxiciteit kit volgens de instructies van de fabrikant. 2. Het creëren van de hiërarchische Hydrodynamische Flow Opsluiting (hHFC) Beweeg de MFP via cel monolaag een spleetafstand van 50 urn van het glaasje. Deze kloof afstand en tegelijkertijd contact van de hHFC verklaart ook monolaag oppervlak en de dikte variatie. Injecteer NaOH op 6 of 8 ul / min door i2. Evalueer andere debieten (dat wil zeggen, Q I1, Q en Q A1 A2) met behulp van de stroom regels in figuur 3. Moduleren omvang van de binnenste HFC door de verhouding van Q I2 / I1 Q met de injectiespuiten.Gebruik bijvoorbeeld een Q I1 tussen 1,3 pl / min en 4 pl / min, met de Q I2 in 8 pl / min, waardoor een NaOH voetafdruk van 150 vaste – 300 cellen (100 – 200 pm 2 / cel) ( figuur 3D). Injecteer volledig medium van de buitenste grootste openingen op de MFP kop met een stroomsnelheid van 20 pl / min te verklaren verdamping van de media en aspiratie tijdens de operatie van de hHFC. 3. patroonvorming celmonolagen behulp hHFC Opmerking: Het aftastpatroon bepaalt de gebieden van de cel monolaag waarbij de cellen worden gewonnen (subtractieve patronen), waarbij de resterende cellen tot specifieke biologische vragen bestuderen. Dit patroon kan worden rechte lijnen of een array van spots, bijvoorbeeld. Complexe patronen vereisen ontwerp van een geschikte scanning van de bal. Bijvoorbeeld, een geblokte aftast trajectorie verschaft een raster van celgebieden (getoond bijvoorbeeld op Figuur 4A </strong>), hetgeen mogelijk bestuderen van het effect van verschillende stimuli op cellen in verschillende vierkanten terwijl u vlak. Deze patronen kunnen worden gemaakt met behulp van de controle over de XY stadia van het platform, waar de besturingssoftware maakt scripting scan trajecten voor de MFP hoofd over de cel monolaag. De weg geëffend software om de meetkop via eencellige laag in gebruikerseenheden patronen scannen (door X, Y en Z-coördinaten) bij een scansnelheid van 10 pm / s op een openingsafstand van 50 urn. Met de geneste hHFC in bedrijf en in contact met de monolaag, scant de MFP met een baan van het gewenste patroon tot patroon celverwijdering bewerkstelligen. Voor een co-cultuur na de eerste celtype verwijdering, zaad een andere cel lijn om de leemtes op te vullen, met behulp van methoden in paragraaf 1.5 beschreven. Verplaatsen tussen geneste en kneep modi (door groeiende kloof afstand, bijvoorbeeld) naar cel verwijdering beheersen. LET OP: De scan snelheid kan zijn onderzoeksprocedure te zijngated voor de andere cellijnen. De scan snelheid gebruikt in deze demonstratie effecten volledige cel verwijdering over de gescande regio's voor de gebruikte cellijnen. 4. downstream processing voor monsterneming en DNA Amplification Bereid de bemonstering station voor downstream-analyse van het lysaat. Voor de bemonstering station, gebruik maken van een 3D geprint 8-strip PCR buishouder. Alternatief Kies een geschikte buishouder om als deze adapter, die kunnen worden binnen het scanbereik van het hoofd buiten het substraat aangebracht is. Veeg de buishouder met 70% ethanol of een ander oppervlak ontsmettingsmiddelen basis van de gewenste stringentie voor de toepassing. Gebruik een magnetische clip op de buis houder om het te hechten op het substraat houder. Na bereiding van de bemonstering station, plaatst u de MFP hoofd 100 micrometer uit de monolaag. Beginnen werken de hHFC met 50 mM NaOH oplossing de behandelingsvloeistof voor de binnenste injectiekanaal met stroomsnelheden van 1, 6, -7 En -17,5 pl / min Q respectievelijk I1, I2 Q, Q Q A1 en A2. Zodra de stroom opsluiting (ongeveer 10 seconden) is gestabiliseerd, dalen de meetkop een spleetafstand van 50 urn tot NaOH gebaseerde lokale lysis van de gekozen subpopulatie van cellen met de hHFC voeren. Zodra lysis van de subpopulatie voltooid (ongeveer 30 sec per footprint), richt de richting van de buizen in het monsternemingsstation. Verwijder de verzamelde lysaat in de PCR buisjes direct (figuur 6). Voor verdere verwerking van het lysaat eerst de pH van de oplossing te neutraliseren door het mengen van het lysaat met Tris buffer (1: 1). Na neutralisatie Verhit het lysaat aan 95 ° C gedurende 30 min. Vervolgens direct het lysaat laden in een standaard qPCR workflow zoals vastgesteld door leverancier van het instrument.