Modélisation soustractive rapide des couches de cellules vivantes avec une sonde microfluidique

1. MFP Tête et plate-forme de nettoyage et de préparation NOTE: Ce protocole utilise orienté verticalement hybride silicium-verre MFP dirige 15,16. Le composant de silicium de la tête contient les micro-canaux, qui sont gravés à une profondeur de 100 um. Le silicium gravé est lié au verre par collage anodique. La conception de canal comprend un motif constitué de six canaux, chacun deux pour l' injection et l' aspiration, et deux pour injecter le liquide d'immersion (figure 1). Les canaux utilisés pour l'injection de liquide d'immersion reconstituer les médias entourant l'échantillon biologique, évitant ainsi les pertes dues à l'aspiration et l'évaporation. Les canaux intérieurs et canaux extérieurs utilisés dans les travaux en cours sont 100 x 100 um et 200 x 100 um, respectivement. fabrication Post et le traitement, les têtes de MFP avec chaînes claires et apex polis sont obtenus. Préparation de la station de pompage et de traitement des fluidesappareil Utilisez capillaires avec un 1/16 '' (1,59 mm) de diamètre extérieur et 0,02 '' (0,51 mm) de diamètre intérieur pour tous les tuyaux reliés aux seringues. Variez la taille capillaire sur la base de l'application et obtenir les connecteurs et raccords appropriés à l'interface de la tête de MFP avec les seringues. Utiliser de l'eau ultrapure où dilutions sont nécessaires. seringues propres (250 – 500 volumes pi) et de seringues poinçons par sonication dans une solution chlorée à 0,5% dans l'eau ultrapure To- avant et après des expériences de cellules vivantes. Rincez-les soigneusement à l'eau. Remplissez-les avec de l'eau en plongeant leurs conseils complètement dans un bain d'eau et d'aspiration à l'aide du piston. Purger le liquide tandis que dans le bain d'eau avec l'axe de la seringue en contact avec le joint d'étanchéité à la sortie de la seringue. Répétez aspirée et purge jusqu'à ce qu'aucune bulle d'air sont visibles dans les colonnes de la seringue. Connectez seringues remplies aux pompes à seringue à l'aide de connecteurs luer-lock. Utiliser une soupape de commutation montée sur laLes pompes pour diriger le liquide de la seringue à l' un des deux capillaires conduisant soit à la tête d'imprimante multifonction ou les réservoirs de liquide (figure 6). (Si aucune vanne de commutation est disponible voir la section 1.4.4). Purger les deux capillaires avec de l'eau à partir de la seringue à une vitesse d'environ 10 d'écoulement – 50 ul / min, en fonction de la taille de la seringue jusqu'à environ 10 ul d'eau sont laissés dans les seringues. Pré-insérer les capillaires purgés dans un connecteur microfluidique / adaptateur approprié qui interface avec les vias de canal dans la tête (par exemple, le connecteur M1 – voir matériaux). MFP préparation de la tête Nettoyez la tête MFP par sonication en utilisant un détergent pour le nettoyage de la verrerie standard ou 0,5% l'eau de Javel pour le nettoyage rigoureux, pendant 5 min. Purger les canaux avec de l'eau par immersion de la pointe dans l'eau et l'application de vide pour les vias. Inspecter les canaux sous un stéréomicroscope pour les obstructions potentielles (colmatage) et retourbe l'étape précédente si nécessaire. Montez la tête propre sur le support de tête et visser le connecteur avec le tube pré-inséré et purgé sur la tête. Visser le support de tête à l'étage Z, qui est utilisé pour le contrôle de la distance d'espacement entre la tête et la monocouche cellulaire. Calibrer les étapes de la plate – forme de numérisation MFP Effectuer le calibrage extrémité du X, Y et Z-étapes avant de connecter la tête à la plate-forme, selon le protocole du fabricant avec une interface logicielle appropriée. stades étalonnés assurent une précision dans le positionnement de la tête MFP. Obtenir un écart loin brut zéro (réduction à zéro) en amenant la tête MFP sur une lame de chambre sans cellules et descendre lentement dans 5 um étapes. Au contact de la sonde avec le substrat, les anneaux de Newton devraient être respectées. Ceci est une estimation brute. Une position précise doit être obtenue après réglage de la coplanéité de la pointe de la sonde jusqu'au substratee. Pour assurer la coplanarité de la pointe de la sonde, régler l'inclinaison de la tête à l'aide d'un goniomètre (à l'interface de la tête et la phase de Z). Lorsqu'elles sont formées en sorte que les anneaux de Newton sont symétriques (figure 1). Déplacez le MFP tête 20 um à distance du substrat et de régler l'inclinaison en utilisant le goniomètre. Répétez descente, réduction à zéro et réglage de l'inclinaison jusqu'à ce que les anneaux de Newton sont symétriques au contact. Avec l'inclinaison réglée, réglez la position z qui produit les anneaux de Newton symétriques comme zéro. NOTE: L'étape Z contrôle la distance tête-substrat, tandis que la platine XY commande le balayage du substrat (figure 2). Une explication détaillée peut être trouvée dans nos travaux antérieurs 14. Produits chimiques pour l' élimination locale des couches de cellules Attention: Si l' équipement approprié, l' utilisation de sécurité (par exemple, des gants en nitrile, lunettes de sécurité) pour les produits chimiques en cours de préparation. Utilisez un hoo de fuméed si nécessaire pour la préparation de solutions. Préparer tous les produits chimiques et les tampons avec de l'eau ultra-pure comme diluant. Préparer une solution à 50 mM de NaOH en tant que liquide de traitement pour le canal d'injection interne (i2 avec un débit Q I2 sur la figure 1). Préparer la solution de tampon d'extraction nécessaire à l'injection externe (i1 avec un débit Q I1 sur la figure 1), composé de 1 mM d' acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 0,5% de Tween 20, et 10 pM de rhodamine B dans du Tris 50 mM (en hydroxymethyl) de aminométhane à pH 8. Pour la purge, utiliser de l'eau dans les seringues d'aspiration. Filtrer toutes les solutions à l'aide d'un filtre à seringue de 0,2 um. Degas toutes les solutions filtrées en utilisant un dessiccateur jusqu'à l'arrêt de l'air dissous bouillonnant à la surface. Utilisation de la ligne de drain connectée aux pompes à seringue, purger l'eau reste et aspirer les solutions dégazées dans les seringues d'injection à 40 ul / min jusqu'à ce que les seringues sont pleines (250 ou 500 pi).Cela garantit le remplissage sans bulles des seringues, des connecteurs et des capillaires. Le système de commande de soupape à deux capillaire seringue commutateur permet le remplissage de la seringue milieu de l'expérience. En l'absence d'une telle soupape de commutation, déconnectez les capillaires de la tête et remplir les capillaires et la seringue en aspirant les solutions dégazées avant de les reconnecter à la tête. Aspirer le traitement et la protection des liquides à travers les capillaires permet l'utilisation de petits volumes au cours du fonctionnement. Si les produits chimiques peuvent être préparés en grandes quantités, remplir des seringues avec les solutions nécessaires directement. Par exemple, les seringues d'aspiration qui contiennent de l'eau peuvent être remplis en utilisant cette approche. Purger les capillaires à la tête de MFP avec les liquides alloués pour chaque canal tel que défini dans 1.4.1 et 1.4.2. REMARQUE: La solution de tampon d'extraction protège le NaOH dans le confinement interne et le composant de la rhodamine dans le tampon facilite la visualisation du ièmee hHFC pendant le fonctionnement. Si les cellules sont trop confluentes avec des agrégats de cellules apparaissant à la surface cultivée, de compléter le tampon d'extraction de 10% de la protéinase K. Cette complète l'action de NaOH sur ces agrégats en dissolvant les protéines dénaturées que le lysat pénètre dans les canaux d'aspiration. On évite ainsi le colmatage des canaux pendant son fonctionnement. Préparation des monocouches de cellules sur des lames de chambre Attention: Utiliser une hotte de culture cellulaire pour la culture des cellules et manipuler de l' équipement selon les règles fixées par l'agent de biosécurité du laboratoire. Remarque exigences particulières de lignées cellulaires spécifiques et d'adapter le protocole et l'équipement en conséquence. Incubateurs de culture Utilisation de cellules (à 5% de CO 2 et à 37 ° C) pour la culture et l' expansion des cellules à modelés. Effectuer l'expansion en utilisant des protocoles de culture cellulaire standard 17,18 dans T flacons. Utiliser les médias en culture selon les exigences de la cellulo spécifiquel ligne (par exemple, le sérum et antibiotiques complétés DMEM pour la culture MCF7 et MDAMB 231). En arrivant à la confluence des cellules dans les flacons de culture, trypsiniser et recueillir des cellules et des semences 2 × 10 5 cellules / cm 2 dans chacune des diapositives 2-chambre pour la structuration et de la culture de plus de 48 heures. Utiliser les cellules dans l'une des chambres en tant que contrôle pour la croissance et la viabilité cellulaire. En arrivant à la confluence des cellules sur les lames de chambre, incuber les cellules pendant 45 min avec 500 solution de colorant cellule-tracker ul (par exemple, vert – CMFDA ou orange – CMRA) à une concentration de 10 uM préparé dans un milieu sans sérum. Ceci est fait pour la visualisation des cellules au cours de formation de motifs. Laver les cellules marquées avec du PBS en rinçant délicatement chaque chambre à l'aide d'une pipette, et la culture ensuite les cellules dans des milieux de sérum supplémenté pour les expériences de mise en forme. Obtenir une image de référence de la surface cellulaire cellule-tracker tachés aux fins de comptage de cellules. Ceci est fait pour s'assurerla confluence de la couche cellulaire. En outre, il sert d'aide pour les expériences de quantification si la récupération des échantillons et l'analyse d'ADN sont objectifs. NOTE: Dans le cas où la viabilité des cellules est à évaluer au cours de structuration, les cellules peuvent être colorées avec un kit de cytotoxicité Vivant / Mort conformément aux instructions du fabricant. 2. Création du hiérarchique hydrodynamiques flux Confinement (hHFC) Déplacer le MFP sur la monocouche cellulaire à une distance d'intervalle de 50 pm à partir de la lame de verre. Cette distance d'espace tout en assurant le contact de la hHFC représente également la surface de la monocouche et la variation d'épaisseur. Injecter NaOH à 6 ou 8 pi / min à travers i2. Évaluer les autres débits (c. -à- Q I1, Q A1 et A2 Q) en utilisant les règles de flux de la figure 3. Moduler la taille du HFC interne en changeant le rapport de Q I2 / I1 Q en utilisant des seringues d'injection.Par exemple, utiliser un Q I1 entre 1,3 ul / min et 4 pl / min, Q I2 fixé à 8 ul / min, ce qui se traduit par une empreinte de NaOH de 150 – 300 cellules (100 – 200 um2 / cellule) ( La figure 3D). Injecter milieu complet des plus externe des ouvertures sur la tête de MFP à un débit de 20 ul / min débit pour tenir compte de l'évaporation des médias et de l'aspiration pendant le fonctionnement du hHFC. 3. monocouches de cellules patterning Utilisation hHFC Remarque: le motif de balayage détermine les zones de la monocouche cellulaire dans lequel les cellules sont extraites (soustractif de formation de motif), en laissant les cellules restantes à l'étude des questions biologiques spécifiques. Ce modèle peut être des lignes droites ou un tableau de points, par exemple. motifs complexes nécessitent la conception d'une trajectoire de balayage approprié. Par exemple, une trajectoire de balayage en damier fournit une grille de zones de cellules (représenté par exemple sur la figure 4A </strong>), ce qui permettrait d'étudier l'effet de différents stimuli sur les cellules dans les différents carrés tout en étant à proximité. Ces modèles peuvent être créés en utilisant le contrôle des étapes de XY de la plate-forme, où le logiciel de commande permet de script des trajectoires de balayage pour la tête MFP sur la monocouche cellulaire. Réglez le logiciel de scène pour balayer la tête de sonde sur la monocouche cellulaire dans les modèles définis par l'utilisateur (en définissant les coordonnées Z X, Y et) à une vitesse de balayage de 10 um / s à une distance d'intervalle de 50 pm. Avec le hHFC emboîtée en fonctionnement et en contact avec la monocouche, balayer le MFP avec une trajectoire du motif désiré pour effectuer l'élimination des cellules à motifs. Pour une co-culture après le premier enlèvement de type cellulaire, les semences d'une lignée cellulaire différente pour combler les lacunes, en utilisant des méthodes décrites à la section 1.5. Se déplacer entre les modes imbriqués et pincés (en augmentant la distance d'intervalle, par exemple) pour contrôler l'élimination des cellules. NOTE: La vitesse de balayage peut devoir être INVESTIfermée pour d'autres lignées cellulaires. La vitesse de balayage utilisé dans cet effet de démonstration élimination complète des cellules sur les régions numérisées pour les lignées cellulaires utilisées. 4. Traitement en aval pour l'échantillonnage et l'ADN Amplification Préparer la station d'échantillonnage pour l'analyse en aval du lysat. Pour la station d'échantillonnage, utilisez un 3D imprimé 8-bande PCR porte-tube. En variante, choisir un support de tube approprié pour servir de cet adaptateur, qui est susceptible d'être monté dans l'intervalle allant de la tête à l'extérieur du substrat à balayage. Essuyer le porte-tube avec 70% d'éthanol ou d'autres décontaminants de surface en fonction de la stringence souhaitée pour l'application. Utilisez une pince magnétique sur le support de tube pour le fixer sur le support de substrat. Après la préparation de la station d'échantillonnage, placez le MFP tête 100 um de la monocouche. Commencer à faire fonctionner le hHFC avec une solution de 50 mM de NaOH en tant que liquide de traitement pour le canal d'injection interne avec des débits de 1, 6, -7 Et -17.5 ul / min pour Q I1, I2 Q, Q A1 et A2 respectivement Q. Une fois que le confinement d'écoulement est stabilisé (dans environ 10 secondes), descendre la tête de la sonde à une distance d'intervalle de 50 pm pour effectuer la lyse locale à base de NaOH de la sous-population de cellules choisie avec le hHFC. Une fois que la lyse de la sous-population est terminée (environ 30 secondes par empreinte), diriger la tête vers les tubes dans la station d'échantillonnage. Ejecter le lysat collecté dans les tubes PCR directement (figure 6). Pour le traitement en aval du lysat, d'abord neutraliser le pH de la solution en mélangeant le lysat avec du tampon Tris (1: 1). Après neutralisation, la chaleur du lysat à 95 ° C pendant 30 min. Puis charger directement le lysat dans un flux de travail qPCR standard fixé par le fournisseur de l'instrument.