דפוסי Subtractive מהירים של שכבות תא חיות עם בדיקת Microfluidic

1. ראש MFP ואת פלטפורמת ניקוי והכנה הערה: פרוטוקול זה משתמש-בכיוון אנכי היברידית סיליקון זכוכית MFP בראש 15,16. המרכיב סיליקון של הראש מכיל את microchannels, אשר חרוט עד לעומק של 100 מיקרומטר. סיליקון החרוט הוא קשור זכוכית באמצעות מליטת anodic. עיצוב הערוץ מורכב דפוס מורכב משישה ערוצים, שתי כל להזרקה ושאיפה, ושתי להזרקת נוזל הטבילה (איור 1). הערוצים המשמשים להזרקת נוזל טבילה לחדש את התקשורת סביב הדגימה הביולוגית, וכך למנוע הפסדים בשל שאיפה ואידוי. הערוצים הפנימיים והערוצים חיצוניים המשמשים ביצירה הנוכחית הם 100 × 100 מיקרומטר ו -200 × 100 מיקרומטר בהתאמה. ייצור ועיבוד פוסט, ראשי MFP עם ערוצים ברורים רכס מלוטש מתקבלים. הכנת תחנת השאיבה-טיפול נוזלמַנגָנוֹן השתמשו נימים עם 1/16 '' (1.59 מ"מ) קוטר חיצוני ו 0.02 '' (0.51 מ"מ) קוטר פנימי לכל וצינור מחובר המזרקים. וארי גודל נימי מבוסס על יישום ולקבל המחברים ואביזרים המתאימים להתממשק ראש MFP עם מזרקים. השתמש במים ultrapure מקום דילולים נחוצים. מזרקים נקיים (250 – 500 נפח μl) ו בוכנות מזרק על ידי sonication בתמיסה אקונומיקה 0.5% ל-לפני המים ultrapure ופוסט דוקטורנטים ניסויים תא חי. יש לשטוף אותן היטב במים. למלא אותם במים על ידי טבילת הטיפים שלהם לחלוטין בתוך אמבט מי aspirating באמצעות הבוכנה. טהר את הנוזל תוך בתוך אמבט מים עם פיר מזרק פנייה חותמת ביציאה של המזרק. לשאוב טיהור חוזר על פעולה עד שאין בועות אוויר נראים במדורי המזרק. חבר מזרקים מלאים עד משאבות המזרק באמצעות מחברי Luer נעילה. השתמש שסתום מתג רכוב עלמשאבות לכוון את הנוזל מן המזרק לאחת משתי נימים מובילות גם אל ראש MFP או למאגרים הנוזליים (איור 6). (אם לא שסתום מתג זמין ראה סעיף 1.4.4). טהר הוא נימים עם מים מן המזרקים בקצב זרימה של כ 10 – 50 μl / דקה, בהתאם לגודל של המזרק עד כ -10 μl של מים נשאר המזרקים. טרום להכניס את הנימים מטוהרים לתוך מתאם מחבר microfluidic מתאים / אשר ממשקים עם vias הערוץ בראש (למשל, מחבר M1 – ראה חומרים). הכנת ראש MFP נקו את הראש MFP ידי sonication משימוש בחומרי ניקוי זכוכית לניקוי רגיל או אקונומיקה 0.5% לניקוי מחמירים, במשך 5 דקות. טהר ערוצים במים על ידי טבילה במים איפקס וליישם ואקום vias. בדוק ערוצים תחת סטראו עבור חסימות פוטנציאל (סתימה) מחדשכבול בשלב הקודם במידת הצורך. הר הראש נקי על בעל ראש הבורג המחבר עם צינורות טרום מוכנס מטוהר על ראשו. בורג בעל ראש לבמה-Z, המשמש לשליטה על מרחק הפער בין הראש monolayer התא. כיול בשלבי הסריקה של פלטפורמת MFP בצע כיול נקודת סיום של ה- X, א- ו- Z-שלבים לפני מחבר את הראש אל הרציף, על פי הפרוטוקול של היצרן עם ממשק תוכנה מתאים. בשלבים מכוילים להבטיח דיוק במיצוב ראש MFP. השג מרחק פער אפס גולמי (איפוס) על ידי הבאת ראש MFP מעל שקופית קאמרית ללא תאים ויורד לאט 5 מיקרומטר צעדים. במגע בדיקה עם המצע, הטבעות של ניוטון יש לשים לב. זוהי הערכה גסה. עמדה מדויקת שתופק לאחר התאמת coplanarity של הקודקוד החללי אל substratדואר. כדי להבטיח coplanarity של הקודקוד החללי, לכוונן את הטיית הראש באמצעות goniometer (על הממשק של ראש במת Z). כאשר נוצר להבטיח כי הטבעות של ניוטון הן סימטרי (איור 1). הזז את מיקרומטר MFP ראש 20 מן המצע ולהתאים להטות באמצעות goniometer. יורד חזרה, מתאפס וכוונון להטות עד הטבעות של ניוטון הם סימטריים על קשר. עם הטיה מותאמת, לקבוע את מיקום z המייצר טבעות ניוטון סימטריות כמו אפס. הערה: בשלב Z שולט ראש אל מצע המרחק, ואילו בשלב XY שולט הסריקה של המצע (איור 2). ניתן למצוא הסבר מפורט ב קודם לכן עבודתנו 14. הכנות כימיות להסרה מקומית של שכבות תאים זהירות: במקרה הצורך, ציוד בטיחות השימוש (למשל, כפפות ניטריל, משקפי מגן) עבור כימיקלים שמכינים. השתמש hoo קטרד אם הדרושות להכנת פתרונות. הכן את כל כימיקלי המאגרים עם מי ultrapure כמו diluent. כן 50 פתרון המ"מ NaOH בעוד נוזל העיבוד לערוץ ההזרקה הפנימי (i2 עם I2 Q הזרימה באיור 1). הכן את פתרון חיץ החילוץ הנדרש הזרקה החיצונית (i1 עם I1 Q הזרימה באיור 1), מורכב 1 מ"מ חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 0.5% Tween 20, ו -10 מיקרומטר rhodamine B ב 50 המ"מימ טריס (hydroxymethyl) aminomethane ב pH 8. הקאה, להשתמש מי מזרקי השאיפה. לסנן את כל פתרונות באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. דגה כל הפתרונים המסוננים באמצעות ייבוש עד תחנת האוויר המומסת מבעבעת על פני השטח. באמצעות קו הניקוז מחובר משאבות המזרק, לטהר את המים שריד לשאוב פתרונות degassed לתוך מזרקי ההזרקה ב 40 μl / min עד המזרקים מלאים (250 או 500 μl).הדבר מבטיח מילוי חינם בועות של מזרקים, מחברים, ונימים. שסתום ושתיים נימי מזרק-מתג המערכת מאפשרת מילוי של מזרקים באמצע הניסוי. בהעדר מתג שסתום כגון, ניתק את הנימים מהראש ולמלא נימים ואת המזרק ידי aspirating פתרונות degassed לפני החיבור מחדש להם בראש. Aspirating עיבוד מגן נוזלים דרך הנימים מאפשר שימוש של כמויות קטנות במהלך המבצע. אם הכימיקלים ניתן להכין בכמויות גדולות, למלא מזרקים עם הפתרונות הנדרשים ישירות. לדוגמא, מזרקי השאיפה המכילים מים ניתן למלא באמצעות גישה זו. טהר את הנימים לראש MFP עם הנוזלים שהוקצו עבור כל ערוץ כהגדרתו 1.4.1 ו 1.4.2. הערה: פתרון חיץ החילוץ מגן על NaOH ב הכליאה הפנימית ואת רכיב rhodamine למאגר מקל על ויזואליזציה של הדואר hHFC במהלך המבצע. אם התאים יתר ומחוברות, עם אגרגטים תא המופיעים על פני השטח תרבותי, להשלים את מיצוי חיץ עם 10% proteinase ק אלה משלימים את הפעולה של NaOH על אגרגטים אלה על ידי המסת חלבונים מפוגל כמו lysate נכנס ערוצי שאיפה. הדבר מונע סתימת ערוצי במהלך המבצע. הכנת monolayers התא בשקופיות קאמרית זהירות: השתמש ברדס תרבית תאים עבור culturing התאים ולטפל ציוד על פי התקנות שנקבעו על ידי קצין הבטיחות הביולוגי של המעבדה. הערת דרישות מיוחדות של שורות תאים ספציפיות להתאים את הפרוטוקול וציוד בהתאם. השתמש תא חממות תרבות (ב 5% CO 2 ו ב 37 ºC) לתרבות והרחבת התאים להיות בדוגמת. בצע את ההתרחבות באמצעות פרוטוקולי תרבית תאים סטנדרטיים 17,18 צלוחיות T. השתמש בחומרי הדפסת culturing לפי דרישות של cel הספציפיl קו (למשל, סרום אנטיביוטיקה בתוספת DMEM עבור culturing MCF7 ו MDAMB 231). בהגיעו מפגש תא צלוחיות תרבות, trypsinize ולאסוף תאים וזרעי 2 × 10 5 תאים / 2 ס"מ בכל אחת השקופיות 2 קאמרית עבור דפוסים והתרבות מעל 48 שעות. השתמש תאים באחד החדרים כביקורת על גדילת תא כדאי. בהגיעו מפגש תא בשקופיות הקאמריות, דגירת התאים במשך 45 דקות עם 500 פתרון לצבוע μl תא-גשש (למשל, ירוק – CMFDA או כתום – CMRA) בשעת 10 ריכוז מיקרומטר ערוך סרום ללא בינוני. הדבר נעשה להדמית תא במהלך דפוסים. שוטף את התאים שכותרתו עם PBS על ידי שטיפת כל תא בעדינות בעזרת פיפטה, ולאחר מכן תרבות תאי מדיה-בתוספת סרום עבור ניסויי דפוסים. השג תמונת ייחוס של פני התא מוכתם תאי הגשש לצורך ספירת תאים. הדבר נעשה על מנת להבטיחconfluency של שכבת התאים. בנוסף, הוא משמש ככלי עזר עבור ניסויי כימותים אם התאוששות מדגם וניתוח DNA הם מטרות. הערה: במקרה זה כדאיות התא תוערך במהלך דפוסים, התאים יכולים להיות מוכתם ערכת cytotoxicity Live / Dead בהתאם להוראות היצרן. 2. יצירת מאסר זרימת הידרודינמית המבנה ההיררכי (hHFC) הזז את MFP מעל monolayer תא עד למרחק פער של 50 מיקרומטר משקופית הזכוכית. מרחק פער זה תוך הבטחת מגע של hHFC בחשבון גם משטח בשכבה וריאציה עובי. להזריק NaOH ב -6 או 8 μl / min דרך i2. הערכת ספיקות אחרות (כלומר, ש I1, ש A1 ו- Q A2) באמצעות חוקי הזרימה באיור 3. לווסת את גודל HFC הפנימי על ידי שינוי היחס של Q I2 / Q I1 באמצעות מזרקי ההזרקה.לדוגמה, השתמש Q I1 בין 1.3 μl / min ו -4 μl / דקה, עם ש I2 קבוע ב 8 μl / min, שתוצאתה טביעת רגל NaOH של 150 – 300 תאים (100 – 200 מיקרומטר 2 / תא) ( 3D איור). להזריק בינוני מלא מן הפתחים-החיצוניים ביותר על ראש MFP בקצב זרימה של 20 μl / min לתת דין וחשבון על אידוי של התקשורת ושל השאיפה במהלך המבצע של hHFC. 3. monolayers תא דפוסי שימוש hHFC הערה: תבנית הסריקה קובעת בתחומים בשכבת התא שבו התאים מחולצים (דפוסי תוסף), עוזבים את התאים הנותרים ללמוד שאלות ביולוגיות ספציפיות. דפוס זה יכול להיות קווים ישרים או מערך של כתמים, למשל. תבניות מורכבות דורשות עיצוב של מסלול סריקה מתאים. לדוגמא, מסלול סריקה משובץ מספק רשת של אזורי תא (מוצג למשל איור 4 א </strong>), אשר יאפשר אשר בדק את השפעתו של גירויים שונים על תאי ריבועים שונים בעת היותו בסמיכות. ניתן ליצור דפוסים אלה באמצעות שליטה בשלבי XY של הפלטפורמה, שבו תוכנות השליטה מאפשרת scripting של מסלולי סריקה עבור ראש MFP על monolayer התא. הגדר את תוכנת הבמה כדי לסרוק את ראש הבדיקה על monolayer התא בדפוסים המוגדר על ידי משתמש (על ידי הגדרת X, Y ו- Z קואורדינטות) בכל מהירות סריקה של 10 מיקרומטר / s במרחק פער של 50 מיקרומטר. עם hHFC מקוננות במבצע במגע עם monolayer, לסרוק את MFP עם מסלולו של התבנית הרצויה לבצע הסרת תא בדוגמת. עבור שיתוף תרבות לאחר הסרת תאי הסוג הראשונה, זרע קו תאים שונה כדי למלא את הפערים, תוך שימוש בשיטות המתוארות בסעיף 1.5. לעבור בין מצבים מקוננים וצבטו (על ידי הגדלת מרחק פער, למשל) כדי לשלוט הסרת תאים. הערה: מהירות הסריקה יכולה להיות investiמגודר עבור שורות תאים אחרות. מהירויות הסריקה המשמשות להסרת תאים להשלים תופעות הפגנה הזאת מעל האזורים סרקו את שטח שורות תאים בשימוש. 4. עיבוד במורד זרם עבור הגברת הדגימה ו- DNA הכן את תחנת דגימה לניתוח במורד הזרם של lysate. עבור תחנת הדגימה, להשתמש 3D מודפס 8-פס בעל צינור PCR. לחלופין, בחר בעל צינור מתאים לשמש מתאם זה, שהוא מסוגל להיות רכוב בטווח סריקה של הראש מחוץ המצע. נגב את בעל צינור עם 70% אתנול או decontaminants משטח אחר המבוססים על חומרא הרצוי עבור היישום. השתמש קליפ מגנטי על בעל צינור לצרף אותו על בעל המצע. לאחר הכנת תחנת הדגימה, מקמו את מיקרומטר MFP ראש 100 מ בשכבה. בגין הפעלת hHFC עם 50 פתרון המ"מ NaOH בעוד נוזל העיבוד לערוץ ההזרקה הפנימי עם ספיקות של 1, 6, -7 ו -17.5 μl / min ש I1, I2 Q, Q A1 ו- Q A2 בהתאמה. לאחר כליאת הזרימה התייצבה (ב כ 10 שניות), יורד ראש החללית למרחק פער של 50 מיקרומטר לבצע תמוגה מקומית המבוססת NaOH של תת-האוכלוסייה הנבחרת של תאים עם hHFC. לאחר תמוגה של האוכלוסייה משנה תושלם (כ -30 שניות לכל טביעת הרגל), לכוון את הראש כלפי הצינורות בתחנת הדגימה. הוצא את lysate שנאסף לתוך צינורות PCR ישירות (איור 6). עבור עיבוד במורד הזרם של lysate, הראשון לנטרל את ה- pH של התמיסה על ידי ערבוב של lysate עם טריס חיץ (1: 1). לאחר נטרול, לחמם את lysate ל -95 ºC למשך 30 דקות. ואז ישירות לטעון את lysate לתוך עבודת qPCR סטנדרטית כפי שנקבע על ידי ספק של המכשיר.