Rapid Субтрактивный структурирование живых слоев клеток с микрожидком Probe

1. МФУ Голова и платформа для очистки и подготовки Примечание: Этот протокол использует вертикально ориентированный кремний-стекло гибрид МФУ возглавляет 15,16. Компонент кремния головки содержит микроканалы, которые вытравлены на глубину 100 мкм. Протравленная кремния связан со стеклом с помощью анодной сварки. Конструкция канала содержит рисунок , состоящий из шести каналов, два каждый для инъекций и аспирации, а также два для инжекции иммерсионной жидкости (рисунок 1). Каналы, используемые для инъекций иммерсионной жидкости пополнения среды, окружающей биологического образца, что позволит избежать потерь в результате аспирации и испарения. Внутренние каналы и внешние каналы, используемые в текущей работе 100 × 100 мкм и 200 × 100 мкм соответственно. Сообщение изготовление и обработка, МФУ головки с четкими каналами и полированных верхушек получаются. Подготовка насосной станции и жидкости обработкиустройство Используйте капилляры с 1/16 '' (1,59 мм) и наружным диаметром 0,02 '' (0,51 мм), внутренний диаметр для всех тюбингов, соединенных со шприцами. Варах размер капилляров, основанный на применении и получить соответствующие разъемы и фитинги для сопряжения головки MFP с шприцами. С помощью сверхчистой воды везде, где разведений необходимы. Чистые шприцы (250 – 500 объем мкл) и шприц плунжеры с помощью ультразвуковой обработки в 0,5% растворе хлорной извести в воде высокой степени предварительного около- и пост- экспериментов живых клеток. Тщательно промойте их водой. Заполните их водой, погрузив их кончики полностью на водяной бане и аспирацией с помощью плунжера. Чистки жидкость в то время как в водяной бане со шприцем вала, контактирующей уплотнение на выходе из шприца. Повторите аспирата и продувки, пока без пузырьков воздуха наблюдаются в колонках шприцев. Подключите заполненные шприцы к шприцевые насосы с использованием Луера соединителей. С помощью переключателя клапан, установленный нанасосы , чтобы направить жидкость из шприца к одному из двух капилляров , ведущих либо к головке MFP или жидкостных резервуаров (рисунок 6). (Если переключатель клапан не доступен смотри раздел 1.4.4). не Purge оба капилляры с водой из шприца со скоростью потока около 10 – 50 мкл / мин, в зависимости от размера шприца до примерно 10 мкл воды остается в шприцах. Предварительно вставьте Продутый капилляры в соответствующий разъем микрожидком / адаптер , который взаимодействует с межслойных каналов в головке (например, разъем M1 – см материалы). Подготовка МФП головки Почистите головку многофункционального устройства с помощью ультразвука, используя стеклянную посуду моющее средство для стандартной очистки или 0,5% хлорной извести для строгой очистки, в течение 5 мин. Чистки каналы с водой, погрузив апекс в воде и создания вакуума с переходными отверстиями. Проверьте каналы под стереомикроскопа для потенциальных препятствий (засорения) и повторноторфа предыдущий шаг, если это необходимо. Установите чистую головку на держателе головки и привинтить разъем с предварительно вставленной и продувают трубы на голову. Прикрутите держатель головки к Z-стадии, который используется для контроля расстояния зазор между головкой болта и монослой клеток. Калибровка этапы сканирования платформы MFP Выполнение конечной точки калибровки X, Y и Z-стадии до подключения головки к платформе, в соответствии с протоколом производителя с соответствующим программным интерфейсом. Калиброванные этапы обеспечить точность позиционирования головки MFP. Получают сырой нулевой зазор расстояния (обнуление) путем приведения головки многофункционального устройства над камерой слайде без клеток и медленно спускаться с шагом 5 мкм. После зонда контакт с подложкой, следует соблюдать кольца Ньютона. Это грубая оценка. Точное положение должно быть получено после корректировки Некомпланарность зонда верхушки к substratе. Для обеспечения Некомпланарность зонда вершины, отрегулируйте наклон головы с помощью гониометра (на границе головы и стадии Z). Когда формируется убедитесь , что кольца Ньютона симметричны (рис 1). Перемещение MFP головки 20 мкм от подложки и регулировки угла наклона с помощью гониометра. Повторите спуск, обнуление и регулировка наклона до колец Ньютона симметричны при контакте. С помощью наклона регулируется, установите положение г, который производит симметричные кольца Ньютона как ноль. Примечание: Z-ступень управляет расстоянием головы до подложки, в то время как стадия XY управляет сканированием подложки (рисунок 2). Подробное объяснение можно найти в нашей более ранней работе 14. Химические препараты для локального удаления клеточных слоев Внимание: В случае необходимости использования оборудования для обеспечения безопасности (например, нитриловые перчатки, защитные очки) для химических веществ , в стадии подготовки. Использование дымов ого-гоd, если это необходимо для приготовления растворов. Подготовьте все химические вещества и буферы с сверхчистой воды в качестве разбавителя. Готовят 50 мМ раствора NaOH , в качестве технологической жидкости для внутреннего канала инжекции (I 2 с потоком Q I2 на фигуре 1). Подготовка буфера для экстракции раствора , необходимое для внешней инжекции (I1 с потоком Q I1 на фиг.1), состоящий из 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,5% Tween 20, и 10 мкМ родамина В в аминметан в 50 мМ трис (гидроксиметил) рН 8. Для продувки, используйте воду в аспирационных шприцы. Фильтр всех растворов с помощью шприца 0,2 мкм фильтр. Дега все отфильтрованные растворы с использованием эксикаторе до тех пор, растворенный воздух остановки не прорывается к поверхности. Использование сливного трубопровода, соединенный с шприцевые насосы, продуть остатка воды и отсасывание дегазированной растворов в шприцы для инъекций при 40 мкл / мин до тех пор, шприцы не заполнятся (250 или 500 мкл).Это гарантирует, без пузырьков заполнение шприцев, соединителей и капилляров. Клапан-два-капиллярная система шприц-переключатель позволяет заполнение шприцов середине эксперимента. При отсутствии такого выключателя клапана, отсоедините капилляры от головы и заполняют капилляры и шприц аспирационных Дегазированную решения перед повторным подключением их к голове. Аспирационных обработки и защиты жидкостей через капилляры позволяет использовать малых объемов во время работы. Если химические вещества могут быть получены в больших объемах, заполнить шприцы с требуемыми растворы непосредственно. Например, стремление шприцы, которые содержат воду, могут быть заполнены с использованием этого подхода. Чистки капилляры к головке MFP с жидкостями, выделенных для каждого канала, как определено в версии 1.4.1 и 1.4.2. Примечание: Буферный раствор экстракции экранирует NaOH во внутренней камере, и компонент родамина в буфере облегчает визуализацию ВЭС-е hHFC во время работы. Если клетки чрезмерно сплошности, с клеточные агрегаты появляются на культивируемой поверхности, дополняют буфера для экстракции с 10% протеиназы К. Это дополняет действие NaOH на этих агрегатах путем растворения денатурированные белки в лизат входит стремление каналов. Это предотвращает засорение каналов во время работы. Получение клеточных монослоев на слайдах камеры Внимание: Используйте капот культуре клеток для культивирования клеток и обращаться с оборудованием в соответствии с правилами , установленными сотрудником по биологической безопасности в лаборатории. Обратите внимание, специальные требования конкретных клеточных линий и адаптации протокола и оборудования соответственно. Использование клеточных культур инкубаторы (при 5% СО 2 и при 37 ° С ) для культуры и расширения клеток быть составлены по образцу. Выполните расширение с использованием стандартных протоколов культивирования клеток 17,18 в Т – колбах. Использование средств массовой информации культивирование в соответствии с требованиями конкретного челл линия (например, сыворотки и антибиотик , дополненной DMEM для культивирования MCF7 и MDAMB 231). При достижении клеток слияния в колбах культуры, Trypsinize и собирают клетки и семена 2 × 10 5 клеток / см 2 в каждой из 2- х камерные горками для кучность и культуры в течение 48 часов. Использование клеток в одной из камер в качестве контроля для роста клеток и их жизнеспособности. При достижении клеток сплошности на камеру слайдами, инкубировать клетки в течение 45 мин с помощью 500 мкл раствора красителя клеточного трекеру (например, зеленый – CMFDA или оранжевый – CMRA) при концентрации 10 мкМ , полученного в среде без сыворотки. Это делается для визуализации клеток во время формирования паттерна. Вымойте меченых клеток с PBS, осторожно промывке каждой камеры с помощью пипетки, а затем культивирования клеток в сывороткой средах для экспериментов формирования паттерна. Получить ссылку изображение клеточного следящей окрашенных поверхности клетки с целью подсчета клеток. Это делается для того,конфлуэнтности слоя клеток. Кроме того, он служит в качестве вспомогательного средства для экспериментов количественного определения, если восстановление образца и анализ ДНК цели. Примечание: В случае, когда жизнеспособность клеток должна быть оценена в ходе формирования паттерна, клетки могут быть окрашены с Live / Dead комплект цитотоксичности в соответствии с инструкциями изготовителя. 2. Создание Иерархическая гидродинамического потока конфайнмент (hHFC) Перемещение МФП над монослоя клеток к щели на расстоянии 50 мкм от предметное стекло. Этот разрыв расстояния, обеспечивая при этом контакт hHFC также объясняет поверхности монослоя и изменения толщины. Вводят NaOH в 6 или 8 мкл / мин через i2. Оценка других скоростей потока (т.е. Q I1, Q A1 и A2 Q) с использованием правил потока на рисунке 3. Модулировать размер внутреннего HFC путем изменения соотношения Q I2 / Q I1 с использованием шприца для инъекций.Например, можно использовать ватную I1 от 1,3 мкл / мин и 4 мкл / мин, с Q I2 установлен в 8 мкл / мин, что приводит к NaOH след 150 – 300 ячеек (100 – 200 мкм 2 / клетка) ( Рисунок 3D). Вводят полной среды из внешнего пространства, большинство отверстий на головке MFP при скорости потока 20 мкл / мин для учета испарения средств массовой информации и аспирации во время работы hHFC. 3. паттернирования монослоев клеток Использование hHFC Примечание: Шаблон сканирования определяет участки клеточного монослоя, где извлекаются клетки (субтрактивная структуризации), в результате чего оставшиеся клетки для изучения конкретных биологических вопросов. Эта модель может быть прямыми линиями или массив точек, например. Сложные структуры требуют проектирования подходящей траектории сканирования. Например, клетчатый траектории сканирования представляет собой сетку из областей клеток (показано, например , на рисунке 4A </stronг>), что позволило бы изучать влияние различных стимулов на клетки в разных квадратах, находясь в непосредственной близости. Эти модели могут быть созданы с помощью контроля над XY этапов платформы, где управляющее программное обеспечение позволяет сценариев траекторий сканирования для головы MFP через клеточный монослой. Установка программного обеспечения для сканирования этапа головку зонда над монослоя клеток в определенных пользователем шаблонов (путем установки X, Y и координаты Z) со скоростью сканирования 10 мкм / с при зазоре расстоянии 50 мкм. С помощью вложенной hHFC в эксплуатации и при контакте с монослоем, сканируют MFP с траекторией желаемого рисунка для осуществления узорной удаления клеток. Для совместного культивирования после первого удаления типа клеток, семян другую клеточную линию, чтобы заполнить пробелы, используя методы, описанные в разделе 1.5. Перемещение между вложенными и ущипнул режимами (за счет увеличения зазора расстояния, например), чтобы контролировать удаление клеток. Примечание: Скорость сканирования может иметь быть investiворотами для других клеточных линий. Скорость сканирования, который используется в этой демонстрации эффектов удаления полная клеток над сканированных областей для используемых клеточных линий. 4. Обработка Вниз по течению для отбора проб и ДНК-амплификации Подготовка станции отбора проб для нисходящего анализа лизата. Для выборки станции, использовать 3D-печатная 8-полосная держатель трубки ПЦР. В качестве альтернативы, выбрать соответствующий держатель трубки, чтобы служить в качестве этого адаптера, который с возможностью установки в пределах диапазона сканирования головки вне подложки. Протрите держатель трубки с 70% этанола или других поверхностных дегазации на основе жесткости, требуемой для применения. Используйте магнитный зажим на держателе трубки, чтобы прикрепить ее на держатель подложки. После подготовки станции отбора проб, установите MFP головки 100 мкм от монослоя. Начало работы с hHFC с 50 мМ раствором NaOH в качестве технологической жидкости для внутреннего канала впрыска с дебитом 1, 6, -7 И -17,5 мкл / мин для Q I1, I2 Q, Q A1 и A2 Q соответственно. После того, как удержание потока стабилизируется (примерно 10 сек), спускаемся головку зонда к щели на расстоянии 50 мкм для выполнения на основе NaOH локального лизиса выбранного субпопуляции клеток с hHFC. После того, как лизис субпопуляции завершена (примерно 30 сек на след), направить голову в сторону трубок в станции отбора проб. Выброс собранный лизата в пробирки для ПЦР непосредственно (рисунок 6). Для обработки вниз по течению лизата, сначала нейтрализуют рН раствора путем смешивания лизата с Трис-буфером (1: 1). После нейтрализации, нагревать лизата до 95 ° С в течение 30 мин. Затем непосредственно загрузить лизата в стандартный рабочий процесс КПЦР как установлено поставщиком прибора.