mikroakışkan Probe ile Canlı Hücre Katmanlar hızlı Subtractive Desenlendirme

1. MFP Kafa ve Platform Temizleme ve Hazırlama NOT: Bu protokol MFP 15,16 kafaları dikey yönelimli silikon-cam melez kullanır. kafa silikon bileşeni 100 um derinliğe kadar kazınmış olan mikro kanallar, içerir. kazınmış silikon anodik bağlama ile cama yapıştırılır. Kanal tasarım daldırma sıvı (Şekil 1) enjekte etmek için altı kanal, enjeksiyon ve aspirasyon için iki her iki kapsayan bir modeli ihtiva etmektedir. daldırma sıvısı enjekte etmek için kullanılan kanallar medya böylece nedeniyle aspirasyon ve buharlaşma kayıpları kaçınarak, biyolojik numune çevreleyen doldurmak. iç kanallar ve mevcut işlerinde kullanılan dış kanallar 100 × 100 mm ve sırasıyla 200 × 100 mikron bulunmaktadır. Mesaj imalat ve işleme, açık kanallar ve cilalı apexes ile MFP kafaları elde edilir. Pompa istasyonunun hazırlanması ve sıvı kullanımcihaz şırınga bağlı tüm boru donanımları için 1/16 '' (1.59 mm), dış çap ve 0.02 '(0.51 mm) iç çapı ile kılcal kullanın. uygulamaya göre kılcal boyutu değişir ve şırınga ile MFP kafasını arayüz uygun konnektörleri ve bağlantı parçaları edinin. seyreltmeler gerekli yerde ultra saf su kullanın. Temiz şırıngalar (250-500 ul hacmi) ve şırınga saf su önce to- içinde% 0.5 çamaşır suyu çözeltisi içinde sonikasyon ile pistonlara ve canlı hücre deneyleri kaymalı. suyla iyice durulayın. Bir su banyosu içinde tamamen kendi ipuçları çeker ve piston ile aspire su ile doldurun. ise şırınganın çıkışında mühür temas şırınga mili ile su banyosu içinde sıvı temizleyin. hiçbir hava kabarcığı kadar tekrarlayın aspirat ve tasfiye şırınga sütunlarda görülür. Luer-lock konnektörler kullanılarak şırınga pompaları dolu şırınga bağlayın. üzerine monte edilmiş bir anahtar vana kullanınPompalar (Şekil 6), MFP kafasına veya sıvı rezervuar ya giden iki kılcal bir şırınga sıvıyı doğrudan. (Anahtar yok vanası varsa bölüm 1.4.4 bakınız). Suyun yaklaşık 10 ul şırınga kalan kadar şırınga büyüklüğüne bağlı olarak, 50 ul / dk – 10 arasında bir akış hızında şırıngalardan su ile iki kılcal temizleyin. (- Malzemeleri görmek, örneğin, M1 konnektör) baş kanal yolların ile arayüzleri uygun bir mikroakışkan konnektör / adaptörüne temizlendi kılcal ön takın. MFP kafa hazırlığı 5 dakika boyunca, katı temizlik için standart temizleme veya% 0.5 ağartıcı bir cam deterjanla sonikasyonla MFP kafasını temizleyin. Suda apeks çeker ve yolların vakum uygulanarak, su ile kanal temizleyin. Potansiyel engel (tıkanma) ve yeniden bir stereomikroskop altında kanalları inceleyinönceki adımı gerekirse turba. Kafa tutucu temiz kafa monte ve baş üzerine önceden yerleştirilen ve tasfiye boru ile konnektör vida. baş ve hücre tek tabaka arasındaki boşluk mesafesi kontrolü için kullanılan Z-evre, baş tutucu vida. MFP platformunun tarama aşamalarını kalibrasyonu Uygun bir yazılım arayüzü ile üreticinin protokolüne göre, platforma baş bağlamadan önce X, Y ve Z-aşamalarının son nokta kalibrasyonunu gerçekleştirin. Kalibre aşamaları MFP kafa konumlandırma doğruluğunu sağlamak. hücreleri olmadan bir oda slayt üzerinde MFP kafa getirerek (sıfırlama) bir ham sıfır boşluk mesafesini elde etmek ve yavaş yavaş 5 mikron adımda inerler. alt-tabaka ile prob temas ettiği zaman, Newton halkaları dikkat edilmelidir. Bu ham tahmindir. Doğru pozisyon substrat prob apeks coplanarity ayarladıktan sonra elde edilecek olane. Prob apeksin coplanarity sağlamak için, (başın arayüzü ve Z'nin aşaması), bir gonyometre ile baş eğimini ayarlar. Oluştuğunda Newton halkaları simetrik (Şekil 1) olduğundan emin olun. alt tabakadan uzak MFP kafa 20 um Taşı ve gonyometre kullanılarak eğimini ayarlayın. Newton'un halkaları yineleyerek iniş, sıfırlama ve eğim ayarlama temas simetriktir. tilt ayarlanabilir ile, sıfır olarak simetrik Newton halkaları üretir z konumunu ayarlayın. NOT: XY substrat tarama (Şekil 2) kontrol oysa Z-aşamalı, head-to-substrat mesafeyi kontrol eder. Ayrıntılı bir açıklama daha önceki çalışmalarında 14 bulunabilir. Hücre tabakalarının yerel çıkarma için kimyasal müstahzarlar Dikkat: Uygun durumlarda, kullanım güvenlik ekipmanları (örneğin nitril eldiven, koruyucu gözlük) kimyasallar için hazırlanmaktadır. Bir duman hoo kullanınd çözümleri hazırlamak için gerekirse. seyreltici olarak saf su ile tüm kimyasalları ve tamponlar hazırlayın. (Şekil 1 'de akımı Q I2 ile I2), iç enjeksiyon kanalı için işlem sıvısı olarak 50 mM NaOH solüsyonu hazırlayın. 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA),% 0.5 Tween 20 oluşmaktadır (Şekil 1 'de akımı Q I1 ile I1), dış enjeksiyon için gerekli ekstraksiyon tampon çözeltisi hazırlayın ve 10 uM rodamin B, 50 mM tris (hidroksimetil) aminometan olarak bölgesindeki tasfiye için pH 8, aspirasyon şırıngalar içinde su kullanın. 0.2 mikron şırınga filtresi kullanılarak tüm çözümleri filtre. Gazını çözündürüldü hava stop yüzeyine kabarcıklar kadar bir kurutucu kullanarak tüm filtre çözümler. şırınga pompaları bağlı tahliye hattı kullanarak, kalan su tasfiye ve şırıngalar (250 veya 500 ul) kadar dolu 40 ul / dk enjeksiyon şırınga içine gazı alınmış çözümler aspire.Bu şırıngalar, konektörler ve kılcal damarların balon ücretsiz dolum sağlar. şırınga anahtarı valf iki kılcal sistem şırınga orta deney doldurulmasını sağlar. Böyle bir anahtar valf yokluğunda, baş kısmından itibaren kılcal ayırın ve baş bunları yeniden bağlanmadan önce gazı alınmış solüsyonlar aspire kılcal ve şırınga doldurun. işlem aspirasyon ve kılcal sıvıların koruma işlemi sırasında küçük hacimlerde kullanılması içindir. kimyasal büyük hacimlerde hazırlanabilir ise, doğrudan gerekli çözümler ile şırınga doldurun. Örneğin, su içeren aspirasyon iğneleri Bu yaklaşım kullanılarak doldurulabilir. 1.4.1 ve 1.4.2 tanımlanan her bir kanal için ayrılan sıvı MFP kafasına kılcal temizleyin. NOT: ekstraksiyon tampon çözeltisi iç lohusalık ve tamponda rodamin bileşeni NaOH kalkanlar th görüntülenmesini kolaylaştırırÇalışma sırasında hHFC e. hücreler, hücre agrega kültür yüzeyinde görünen ile aşırı konfluent iseniz, bu lizat aspirasyon kanalları girdiğinde denatüre proteinler çözerek bu agrega NaOH eylemi tamamlayan 10% Proteinaz K. ile ekstraksiyon tamponu tamamlar. Bu işlem sırasında kanalların tıkanmasını engeller. Odacıklı slaytlar üzerinde hücre mono tabakaları hazırlanması Dikkat: hücrelerin kültürlenmesi için bir hücre kültürü kaputu kullanın ve laboratuar biyogüvenlik görevlisi tarafından belirlenen düzenlemelere uygun olarak donanım işlemek. Spesifik hücre hatlarının özel gereksinimleri Not ve buna göre protokol ve ekipman uyum. Kültür ve hücrelerin genişlemesi için kullanın hücre kültürü inkübatör (% 5 CO 2 ve 37 ºC'de) desenli edilecek. T şişelerinde standart hücre kültürü protokolleri 17,18 kullanarak genişleme gerçekleştirin. Belirli cel ihtiyaçlarına göre kültürleme ortamı kullanınl hattı (örneğin, serum ve antibiyotik MCF7 ve MDAMB 231 kültürleme için DMEM desteklenmiş). Kültür şişelerinde hücre izdiham ulaşan, trypsinize ve hücreleri ve tohum 2 x 10 5 hücre 48 saat boyunca desen ve kültürü için 2 odacıklı slaytlar her / cm2 toplamak. hücre büyümesi ve canlılığı için bir kontrol olarak bölmelerin birinde hücreleri kullanır. Oda slaytlar üzerinde hücre kaynaşmaya eriştikten üzerinde, 500 ul hücre izleyici boya çözeltisi ile 45 dakika inkübe hücreleri (örneğin, yeşil – CMRA – CMFDA veya turuncu) serumsuz ortam içinde hazırlanmış olan 10 uM konsantrasyonda. Bu desen sırasında hücre görünüm için yapılır. hafifçe bir pipet kullanarak her odasına kızarma ve desenlendirme deneyleri için serum takviye medyada sonradan kültür hücreleri tarafından PBS ile etiketlenmiş hücreleri yıkayın. hücre sayımı amacıyla hücre izci lekeli hücre yüzeyinde bir referans görüntü elde. Bunu sağlamak için yapılırhücre tabakasının birbirine karışmaya. Buna ek olarak, bu örnek kurtarma ve DNA analizi hedefleri ise ölçümü deneyleri için bir yardımcı olarak hizmet vermektedir. NOT: hücre canlılığı desen sırasında değerlendirilecek olması durumunda, hücreler üreticinin talimatlarına uygun olarak bir Live / Dead sitotoksisite kiti ile boyanmış olabilir. 2. Oluşturma Hiyerarşik Hidrodinamik Akış Confinement (hHFC) Cam slayt 50 mikron boşluk mesafesi hücre tek tabaka üzerine MFP'yi taşıyın. hHFC temas sağlarken Bu boşluk mesafesi de tek tabaka yüzeyi ve kalınlık değişiminin oluşturmaktadır. i2 ile min / 6 veya 8 ul NaOH enjekte edilir. Diğer akış oranlarını değerlendirmek (yani, Q I1, Q A1 ve Q A2) Şekil 3'te akış kurallarını kullanarak. Enjeksiyon şırıngalar kullanılarak Q I2 / Q I1 oranını değiştirerek iç HFC boyutunu modüle eder.300 hücre – Örneğin, 150 NaOH kaplayan sonuçlanan 8 ul / dk sabit S I2 ile 1.3 ul / dk ve 4 ul / dk arasında bir S I1 kullanımı (100-200 mikron 2 / hücre) ( Şekil 3D). hHFC çalışması sırasında ortam ve aspirasyon buharlaşmanın hesaba 20 ul / dk'lık bir akış oranında, MFP kafasına en dış açıklıklardan tam orta enjekte edilir. hHFC kullanılması 3. Desen hücre tekli katmanlarına Not: Tarama deseni, belirli biyolojik soruları incelemek için kalan hücreleri bırakarak hücreler ayıklanır hücre tek tabaka (eksiltme desenlendirme) alanları belirler. Bu model, örneğin, düz çizgiler veya noktalar halindeki düzeni olabilir. Karmaşık desenler, uygun bir tarama yörüngesinin tasarım gerektirir. Örneğin, bir kareli tarama yörünge Şekil 4A, örneğin gösterilen hücre alanlarında ızgara (içerir </strong>), yakın olurken farklı meydanlarda hücreler üzerinde farklı uyaranların etkisini incelemek sağlayacak olan. Bu modeller kontrol yazılımı hücre tek tabaka üzerinde MFP kafa tarama yörüngeleri komut dosyalarına izin veren bir platform, XY aşamalarında kontrol kullanılarak oluşturulabilir. 50 um arasında bir boşluk mesafesi 10 mm / s'lik bir tarama hızında (X, Y ve Z koordinatlarını belirleyerek), kullanıcı tanımlı desen hücre tek üzerinde sondaj kafası tarama aşaması yazılımı ayarlayın. İç içe hHFC işlemi ve tek tabaka ile temas halinde olan, desenli hücre çıkarılmasını sağlamak için arzu edilen modelin bir yörünge ile MFP tarar. İlk hücre tipi çıkarıldıktan sonra, bir ko-kültür için, bölüm 1.5'de tarif edilen yöntemler kullanılarak, boşlukları doldurmak için farklı bir hücre hattı tohum. Hücre kaldırma kontrol etmek için (örneğin, boşluk mesafesini artırarak) iç içe ve sıkışmak modlar arasında taşıyın. NOT: Tarama hızı da inceledik olmak zorunda kalabilirsinizDiğer hücre çizgileri için kapı. kullanılan hücre hatları için taranan bölgeler üzerinde bu gösteri etkileri tam hücre çıkartılmasında kullanılan tarama hızı. Örnekleme ve DNA Amplifikasyon 4. Alt İşleme lizat aşağı analizleri için numune alma istasyonu hazırlayın. Örnekleme istasyonu için, 3D 8-şerit PCR tüp tutucu baskılı kullanın. Alternatif olarak, alt tabakanın dışında kafa tarama aralığında monte edilebilen bu adaptör olarak hizmet verecek uygun bir tüp tutucu seçin. % 70 etanol ya da uygulama için istenen sertlik dayalı diğer yüzey dekontaminasyonlara tüp tutucu silin. substrat tutucu üzerine takmak için tüp tutucu üzerindeki manyetik klibi kullanın. örnekleme istasyonu hazırladıktan sonra, tek tabaka MFP kafası 100 mikron yerleştirin. 1 akış hızı, 6 iç enjeksiyon kanalı için işlem sıvısı olarak 50 mM NaOH çözeltisi ile hHFC işletim başlayın, -7 Ve -17,5 ul / sırasıyla S I1 Q I2 Q, A1 ve Q A2 dak. Akış sınırlayıcı (yaklaşık 10 saniye içinde) stabilize edildikten sonra hHFC hücrelerin seçilen alt nüfusun NaOH dayalı yerel lizizi gerçekleştirmek için 50 um arasında bir boşluk mesafesi sondaj kafası inerler. alt nüfusun lizis tamamlandı (ayak izi başına yaklaşık 30 sn) sonra, örnekleme istasyonunda tüpler doğru başını yönlendirin. PCR tüplerine toplanır lizat çıkarma doğrudan (Şekil 6). Lizat sonraki işlem, ilk Tris tamponu (1: 1) ile lisat karıştırılarak çözeltinin pH nötralize eder. Nötralize edilmesinden sonra, 30 dakika boyunca 95 ° C lizat ısıtın. Cihazın tedarikçisi tarafından belirlenen daha sonra doğrudan standart bir qPCR iş akışına lizat yükleyin.