الزخرفة مطروح السريع لطبقات الخلايا الحية مع التحقيق ميكروفلويديك
Summary
We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.
Abstract
التحقيق ميكروفلويديك (MFP) يسهل أداء الكيمياء المحلي على ركائز البيولوجية عن طريق حصر كميات نانولتر من السوائل. باستخدام تطبيق واحد معين من MFP، وهرمي الهيدروديناميكية الحبس تدفق (hHFC)، يتم جلب السوائل متعددة في وقت واحد في اتصال مع الركيزة. مفعولها الكيميائي المحلي وتشكيل السائل باستخدام hHFC، واستغلالها لخلق أنماط الخلية عن طريق الناشر محليا وإزالة الخلايا. من خلال الاستفادة من القدرة المسح الضوئي من خلال الجهاز نفسه، يتم إنشاء أنماط المعرفة من الطبقات الوحيدة الخلية. هذا البروتوكول يتيح السريع، في الوقت الحقيقي وتسيطر مكانيا الزخرفة الخلية، والتي يمكن أن تسمح انتقائية خلية خلية وخلية مصفوفة دراسات التفاعل.
Introduction
في بيئتهم المحلية، والخلايا في الأنسجة البيولوجية تنظر مجموعة من الإشارات البيوكيميائية والفيزيائية توجيه نموها، والتنظيم، والتنمية. فهم هذه العظة يتطلب التحقيق الانتقائي للخلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات. وهذا يتطلب تطوير أساليب الطبقات الوحيدة الخلية الزخرفة. الأساليب لمنفصلة هندسيا أنواع مختلفة من الخلايا في الثقافة (الزخرفة) تمكين دراسات واسعة من الإشارات الفيزيائية والكيميائية في بيولوجيا الخلية. معظم النهج الحالية لطبقات الخلايا الزخرفة 1-4 تعتمد على إيداع بروتينات الخلية الالتصاق على السطوح أو استخدام الإستنسل microfabricated للنمو الانتقائي على ركائز. في المقابل، هنا نقدم طريقة لبسرعة الطبقات الوحيدة الخلية نمط في الموقع، أي خلايا في الثقافة، عن طريق إزالة الخلايا في مناطق مختارة من أحادي الطبقة. الأساليب التي تؤدي هذا مطروح الزخرفة 5-9 usuaتتطلب LLY ركائز المتخصصة، والمعالجة السطحية، عملية معقدة، الاتصال الجسدي أو الاجتثاث باستخدام الليزر، مما يؤثر عن غير قصد الخلايا الحية. نحن هنا استخدام مسبار ميكروفلويديك (MFP) 10،11، عدم الاتصال مسح تكنولوجيا ميكروفلويديك أن تحصر hydrodynamically السائل على ركيزة. عنصر واحد مهم من MFP هو رئيس microfabricated تحتوي على microchannels (الشكل 1). تتكون منصة المرتبطة مضخات حقنة من أجل السيطرة السائلة، مراحل لمسح السيطرة ومجهر مقلوب لتصور وردود الفعل (الشكل 2). ، يضم رئيس MFP في التكوين الأساسي وهما microchannels مع فتحات في ذروة، واحدة لحقن السائل تجهيز والآخر لالشفط السائل معالجة حقن جنبا إلى جنب مع بعض السائل الغمر (الشكل 3A). خلال عملية MFP، قمة هي على مسافة ثابتة من الركيزة. عندما يكون معدل تدفق الطموح (QA) هو sufficieأعلى ntly من معدل تدفق الحقن (س ط)، أي سؤال من: س ط ≥ 2.5، يقتصر السائل المعالجة على الركيزة. وهذا يؤدي إلى حبس تدفق الهيدروديناميكية (HFC). ويطلق على المنطقة التي السائل المعالجة في اتصال مباشر مع الركيزة البصمة. لظروف التشغيل العادية، وتدفق السائل المعالجة في إطار HFC يتميز عدد رينولدز منخفضة (إعادة ≈ 10 -2) وعدد كبير Péclet (بي ≈ 10 2). وهذا يعني تدفق السائل في نظام الصفحي مع الحمل يكون هو الوسيلة الأساسية للنقل الجماعي من الأنواع الكيميائية. يتم وصف النماذج العددية والتحليلية للحبس تدفق أماكن أخرى 12-14.
في هذه الورقة، ونحن نستخدم هذا النهج من حصر في وقت واحد السوائل معالجة متعددة، وهو ما يسمى HFC الهرمي (hHFC) 14. لتنفيذ hHFC مع MFP، وهما additionaوهناك حاجة إلى فتحات لتر إلى توفير مصدر ثانوي للحقن والطموح. وهذا يتيح لنا أن نحصر السائل واحدة داخل السائل الثاني. والداخلية فوائد (معالجة) السائل من أن محمية من الحطام طائشة على الركيزة التي (التدريع) السائل الخارجي. وبالإضافة إلى ذلك، hHFC يسمح العملية في وضعين: (ط) وضع المتداخلة، التي السائل المعالجة في الاتصالات HFC الداخلية السطح (الشكل 3B)، و (ب) وضع مقروص، والذي يفقد السائل الداخلي الاتصال و فقط السائل الخارجي في اتصال مع الركيزة (الشكل 3C). التبديل بين وضعي يسمح للمستخدمين لإحداث أو إيقاف معالجة الركيزة ويتحقق عن طريق التحكم في الفجوة الرأس إلى السطح أو عن طريق تغيير النسبة بين التدفقات حقن (Q شركة i2 / س I1). للهندسة قناة معينة، البصمة للسائل المعالجة على ركيزة يمكن السيطرة عليها عن طريق تحوير ظروف تدفق (الشكل 3D). HYDR الصوديومأكسيد (هيدروكسيد الصوديوم) يتم استخدام السائل تجهيز الداخلي لليز الخلايا، ويستنشق المحللة باستمرار من السطح. لأنه يتم ترجمة الآثار الكيميائية للسائل المعالجة إلى بصمة HFC الداخلية، تبقى الخلايا المجاورة رابط الجأش، والذي يسمح الدراسات الزمانية المكانية من التفاعلات خلية خلية. وظيفة المسح الضوئي للطابعة متعددة الوظائف تسمح للإنشاء وهندستها المعرفة من أنماط الخلية (الشكل 4). وعلاوة على ذلك، واختيار من هيدروكسيد الصوديوم مثل تجهيز السائل يستوعب تحليل الحمض النووي المصب (الشكل 7).
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم بروتوكول تنوعا للالزخرفة مطروح من الطبقات الوحيدة الخلية التي تمكن جيل السريع لأنماط الخلايا المحددة مكانيا. يتم تنفيذ تحلل الانتقائي من الطبقات الوحيدة الخلية باستخدام هيدروكسيد الصوديوم كما السائل التجهيز في hHFC. وهيدروكسيد الصوديوم يبدل طبيعة الفور البروتينات الموجودة في غشاء الخلية. نحن نوصي باستخدام 50 التركيز ملي من هيدروكسيد الصوديوم لضمان التجهيز النهائي للالمحللة. ويمكن زيادة هذا التركيز لمزيد من إزالة الخلايا السريعة، شريطة المحللة التجهيز النهائي ليس هدفا. وhHFC يضمن أن المناطق المحيطة بها غير المجهزة من أحادي الطبقة الخلية لا تزال تتأثر وتتوفر لأي توسيع نمط أو التحقيق خصائص أخرى من الخلايا.
معدل إزالة الخلايا هي وظيفة كل من الكيمياء والقص التي قدمها التدفق. نختار مجموعة التشغيل من معدلات تدفق لديك الكيمياء إزالة الخلايا المهيمنة. سرعات المسح الضوئي من 10-20 & #تستخدم 8 ميكرولتر / دقيقة لتسهيل "السريع" الزخرفة مطروح – م / ثانية باستخدام معدل تدفق الحقن هيدروكسيد الصوديوم من 6؛ 181. المعدل السريع للإزالة الخلايا يتناول بعض التحديات التي تواجه الطباعة سطح نهج الزخرفة على أساس 20،21. تتطلب هذه الأساليب آلية للحد من نمو الخلايا في مناطق محددة مكانيا، على سبيل المثال، من خلال ترسب الانتقائي للبروتينات التصاق الخلية عن طريق الطباعة الاتصال الصغرى والبذر لاحق من الخلايا للحصول على نمط. تقتصر من قبل إنتاجية منخفضة وتتطلب عدة خطوات متتابعة لتوليد نمط فضلا عن الاستنسل / ختم جديد لكل نمط. لا يتطلب الأسلوب هو موضح النمو الانتقائي للخلايا في مجالات محددة، ويتغلب على العديد من القيود عن طريق أداء الزخرفة مطروح على النقيض من الطباعة، في حين لا تتطلب أي علاج إضافي من الركيزة ثقافة الخلية.
مع بروتوكول الواردة في هذه الورقة، ومرت من الطبقات الوحيدة الخلية الزخرفةوزيادة، في حين الحصول على التغذية الراجعة البصرية الفوري للنمط الذي تم إنشاؤه. هذا يسهل تعديل في الوقت الحقيقي من الأنماط. قد تكون هذه السيطرة حاسما في سيناريوهات بقاء الخلية على سطح معين ليست متجانسة. ميزة أخرى لهذا الأسلوب هو أن نفس الرأس والكيمياء يمكن استخدامها لتوليد أنماط متعددة، مما يقلل من عدد من الخطوات المتبعة في توليد أحادي الطبقة خلية المزخرفة.
أبعاد القنوات في الرأس والهندسة رئيس يمكن زيادتها وفقا لمتطلبات التطبيق، مما يسمح بالسيطرة على قرار من الزخرفة. تم إجراء جميع التجارب في العمل الحالي باستخدام رأس MFP ذات أبعاد الفتحة الثابتة، وتحديدا مع فتحات داخلية في 100 × 100 ميكرون وفتحات الخارجية في 200 × 100 ميكرون. وقد تم اختيار هذا التصميم مع فتحات الخارجية أكبر لضمان التشغيل المستمر من hHFC دون انسداد فتحات من قبلحطام خلية طائشة. لقد اختبرنا رؤساء ذات أبعاد الفتحة الداخلية 50 × 50 ميكرون و 50 ميكرون تباعد بينهما، وكانت النتائج ناجحة في إزالة الخلايا. استخدام فتحات صغيرة، وصولا الى 10 × 10 ميكرون مع 10 ميكرون تباعد، من شأنه أن يسمح التحجيم إلى حجم البصمة أصغر (~ 30 × 30 ميكرون)، وبالتالي توفير دقة أعلى في الزخرفة. لاحظنا المسائل التشغيلية مع فتحة أحجام أصغر من 10 ميكرون بسبب انسداد من الجسيمات. بسبب هذه الصعوبات التشغيلية، و 100 ميكرون هو الحد الحالي من القرار، وبالتالي الحد من تقنية وصفها. ومع ذلك، يمكننا معالجة هذه باستخدام القدرة تشكيل السائلة من hHFC. لقد أثبتنا أن حل إزالة الخلايا يمكن ضبطها لمجموعة معينة من أبعاد الفتحة عن طريق التحكم س I2 / س I1 (الشكل 4B) والفجوة قمة إلى الركيزة 10،14. المراحل المستخدمة في العمل الحالي لديه الحد الأدنى من حجم خطوة من 100 نانومتر.مزيج من هذه المعلمات السيطرة عليها يمكن أن تحسن دقة مكانية إزالة الخلايا من حيث حجم البصمة وبعد المسح.
وإذا رغبت نمط المشترك الثقافات لدراسة التفاعلات خلية خلية معينة بين أنواع مختلفة من الخلايا، بذر متسلسل والزخرفة يمكن القيام بها باستخدام بروتوكول صفها. وأخيرا، الحمض النووي amplifiable ذات جودة عالية يمكن الحصول عليها من المحللة، كما يتضح من ذروة فريدة في الحمض النووي تذوب منحنى (انظر الشكل 7). قمنا بتقييم كمية الحمض النووي لنحو 1.6 نانوغرام من بصمة واحدة (حوالي 300 خلية) باستخدام QPCR، التي هي قريبة من التوقع النظري (6-8 غ / الخلية). وهذا يدل على كمية من الحمض النووي المستخرج مناسبة لعدة عمليات المصب في حين تفادي استخدام أي أساليب عزل الحمض النووي. هذا يفتح آفاقا لالحمض النووي التحليل المستندة المحلية تحقق من الخلايا المستزرعة. ويمكن أيضا القدرة على hHFC لتشكيل السوائل استخدامها لإيداع الخلايا والبروتينات الحية على ميلانالسطوح tivated، والتي في تركيبة مع الزخرفة مطروح ومتتابعة شارك في زراعة الواردة في هذا البروتوكول تمكن من خلق خلية وخلية مصفوفة أنماط معقدة على ركائز الثقافة. براعة والسيطرة التي تقدمها الزخرفة مطروح على أساس hHFC من الطبقات الوحيدة الخلية وإمكانية إجراء تحليل الحمض النووي في الخلايا المستخرجة، ويوفر أداة قوية جديدة لتعيين علماء الأحياء إلى إجراء دراسات حل مكانيا التي تنطوي على تفاعلات الخلية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the European Research Council (ERC) Starting Grant, under the 7th Framework Program (Project No. 311122, BioProbe). We thank Dr. Julien Autebert and Marcel Buerge for technical assistance and discussions during the development of the protocol and the platform. Prof. Petra Dittrich (ETH Zurich), Prof. Bradley Nelson (ETH Zurich), Dr. Bruno Michel and Dr. Walter Riess are acknowledged for their continuous support.
Materials
| Materials | |||
| Microfluidic Probe (MFP) | NA | NA | Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research – Zürich |
| Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers | ThermoFisher scientific, USA | 154461 | 2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm^2 and capable of holding upto 3 ml of media volume |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals and cell lines used | |||
| Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B | SigmaAldrich chemicals, USA | S5881, 252859, E9884, R6626 | Chemicals used for processing and shielding liquids |
| Proteinase K | Qiagen, Germany | 19131 | protease to digest denatuired proteins |
| Deconex 16 Plus | Bohrer Chemie, Switzerland | NA | Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning. |
| DNA away | ThermoFisher scientific, USA | 7010 | Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases. |
| DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement | ThermoFisher scientific, USA | 10566-016 | Culturing medium for epithelial cells. |
| CellTracker Green CMFDA dye | ThermoFisher scientific, USA | C7025 | Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours. |
| CellTracker Orange CMRA dye | ThermoFisher scientific, USA | C34551 | |
| β-actin genomic primers for qPCR | Integrated DNA technologies, USA | NA | Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR. |
| MCF7 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-22 | Cell lines used to produce co-cultures. |
| MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-26 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment and fluidic connections | |||
| Motorized high precision stages | Custom machined components. Linear axis motors from LANG GmBH, Germany | Customized linear axis stages from LT series | 3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port. |
| Syringes | Hamilton, Switzerland | 1700 TLLX series | Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range. |
| Nemesys low pressure syringe pumps | cetoni GmbH, Germany | NA | Component of pumping station. |
| Circular M1-connector | Dolomite microfluidics, United Kingdom | 3000051 | Interface between vias in MFP head and tubing |
| Tilt/rotation stage Goniometer | OptoSigma, USA | KKD-25C | Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex |
| DS Fi2 HD color camera (CCD) | Nikon, Switzerland | NA | Controlled using DS-U3 controller unit |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Win – Commander | LANG GmBH, Germany | NA | Stage control software. |
| Qmix Elements | cetoni GmbH, Germany | NA | Pump control software. |
| NIS Elements | Nikon, Switzerland | NA | Basic research module for image acquisition and analysis. |
References
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J. Cell Sci. 123 (Pt 24), 4201-4213 (2010).
- Goubko, C. A., Cao, X. Patterning multiple cell types in co-cultures: A review. Mater. Sci. Eng. C. 29 (6), 1855-1868 (2009).
- Kaji, H., Camci-Unal, G., Langer, R., Khademhosseini, A. Engineering systems for the generation of patterned co-cultures for controlling cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 1810 (3), 239-250 (2011).
- Cho, C. H., Park, J., Tilles, A. W., Berthiaume, F., Toner, M., Yarmush, M. L. Layered patterning of hepatocytes in co-culture systems using microfabricated stencils. Biotechniques. 48 (1), 47-52 (2010).
- Schütze, K., Lahr, G. Identification of expressed genes by laser-mediated manipulation of single cells. Nat. Biotechnol. 16 (8), 737-742 (1998).
- Salazar, G. T. A., Wang, Y., et al. Micropallet arrays for the separation of single, adherent cells. Anal. Chem. 79 (2), 682-687 (2007).
- Guillaume-Gentil, O., Zambelli, T., Vorholt, J. A. Isolation of single mammalian cells from adherent cultures by fluidic force microscopy. Lab Chip. 14 (2), 402-414 (2014).
- Iwata, F., Adachi, M., Hashimoto, S. A single-cell scraper based on an atomic force microscope for detaching a living cell from a substrate. J. Appl. Phys. 118 (13), (2015).
- Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration. J. Lab. Autom. 17 (1), 59-65 (2012).
- Juncker, D., Schmid, H., Delamarche, E. Multipurpose microfluidic probe. Nat. Mater. 4 (8), 622-628 (2005).
- Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Delamarche, E. Microfluidics in the "open space" for performing localized chemistry on biological interfaces. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51 (45), 11224-11240 (2012).
- Qasaimeh, M. A., Gervais, T., Juncker, D. Microfluidic quadrupole and floating concentration gradient. Nat. Commun. 2 (May), 464 (2011).
- Christ, K. V., Turner, K. T. Design of hydrodynamically confined microfluidics: controlling flow envelope and pressure. Lab Chip. 11 (8), 1491-1501 (2011).
- Autebert, J., Kashyap, A., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. Hierarchical hydrodynamic flow confinement: efficient use and retrieval of chemicals for microscale chemistry on surfaces. Langmuir. 30 (12), 3640-3645 (2014).
- Kaigala, G. V., Lovchik, R. D., Drechsler, U., Delamarche, E. A Vertical Microfluidic Probe. Langmuir. 27 (9), 5686-5693 (2011).
- Cors, J. F., Lovchik, R. D., Delamarche, E., Kaigala, G. V. A compact and versatile microfluidic probe for local processing of tissue sections and biological specimens. Rev. Sci. Instrum. 85 (3), 034301 (2014).
- Pollard, J. W., Walker, J. M. . Basic Cell Culture Protocols. , (1997).
- Mitry, R. R., Hughes, D. R. Human cell culture protocols. Methods Mol. Biol. Springer. 531 (1), (2012).
- Sakai, K., Ushida, T., Nagase, T., Nakamigawa, H. Quantitative analysis of cell detachment by shear stress. Mater. Sci. Eng. C. 17 (1-2), 55-58 (2001).
- Rodriguez, N. M., Desai, R. A., Trappmann, B., Baker, B. M., Chen, C. S. Micropatterned multicolor dynamically adhesive substrates to control cell adhesion and multicellular organization. Langmuir. 30 (5), 1327-1335 (2014).
- Tasoglu, S., Demirci, U. Bioprinting for stem cell research. Trends Biotechnol. 31 (1), 10-19 (2013).
