We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.
A sonda microfluídico (MFP) facilita a execução de química local sobre substratos biológicos, confinando volumes nanolitros de líquidos. Usando uma implementação específica do MFP, o confinamento fluxo hidrodinâmico hierárquica (hHFC), vários líquidos são simultaneamente postos em contato com um substrato. ação química local e formação de líquido usando o hHFC, é explorada para criar padrões celulares por lise e remover células localmente. Ao utilizar a capacidade de digitalização da MFP, padrões definidos pelo usuário de monocamadas de células são criadas. Este protocolo permite a rápida, em tempo real e padronização de células espacialmente controlada, o que pode permitir a célula-célula e célula-selectiva de matriz estudos de interacção.
Em seu ambiente nativo, as células em tecidos biológicos perceber uma série de pistas bioquímicas e físicas que dirigem o seu crescimento, organização e desenvolvimento. Entender essas pistas requer investigação seletiva de interações célula-célula e célula-matriz. Isto requer o desenvolvimento de métodos para monocamadas de células padronização. Métodos para diferentes tipos de células geometricamente separados em cultura (padronização) permitem amplos estudos de pistas físicas e químicas em biologia celular. A maioria das abordagens actuais para as camadas de células padronização 1-4 dependem depositar proteínas de adesão a células em superfícies ou utilizando matrizes microfabricados para o crescimento selectivo em substratos. Em contraste, aqui se apresenta um método para rapidamente monocamadas de células padrão in situ, isto é, as células em cultura, por remoção das células em regiões seleccionadas da monocamada. Métodos que executam tais subtrativo padronização 5-9 usually requerem substratos especializados, tratamento de superfície, operação complexa, de contato físico ou ablação usando um laser, afetando inadvertidamente as células vivas. Nós aqui usam uma sonda microfluídico (MFP) 10,11, um não-contato de varredura tecnologia microfluídica que hydrodynamically confina um líquido sobre um substrato. Um componente importante do MFP é a cabeça microfabricated contendo microcanais (Figura 1). A plataforma associado consiste em bombas de seringa para controle de líquidos, estágios para a digitalização de controle e um microscópio invertido para visualização e feedback (Figura 2). Na sua configuração básica, a cabeça MFP compreende dois microcanais com aberturas no ápice, um para injectar um líquido de processamento e a outra para aspirar o líquido de processamento injectado juntamente com algum líquido de imersão (Figura 3A). Durante a operação da MFP, o ápice é a uma distância fixa a partir do substrato. Quando o caudal de aspiração (QA) é sufficiently mais elevado do que o caudal de injecção (Q i), ou seja, um Q: Q i ≥ 2,5, o líquido de processamento é confinado no substrato. Isto resulta num confinamento fluxo hidrodinâmico (HFC). A região em que o líquido de processamento está em contacto directo com o substrato é denominado a pegada. Por condições normais de funcionamento, o fluxo do líquido de processamento no interior do HFC é caracterizado por um baixo número de Reynolds (Re ≈ 10 -2) e um elevado número de Péclet (Pe 10 ≈ 2). Isto implica fluxos líquidos em regime laminar com a convecção sendo o principal modo de transferência de massa de espécies químicas. Os modelos numéricos e analíticos para confinamento fluxo são descritos em outros lugares 12-14.
Neste trabalho, usamos a abordagem de confinar simultaneamente vários líquidos de processamento, que é chamado HFC hierárquica (hHFC) 14. Para implementar hHFC com o MFP, dois additional aberturas são necessários para fornecer uma fonte secundária de injecção e aspiração. Isso nos permite confinar um líquido dentro de um segundo líquido. Os interiores benefícios (de processamento) líquidos sejam protegidos de detritos de rua sobre o substrato pelo (blindagem) externa líquida. Além disso, hHFC permite o funcionamento em dois modos: (i) o modo de aninhada, em que o líquido de processamento nos contactos HFC interior da superfície (Figura 3B), e (ii) o modo comprimido, em que o líquido interno perde o contacto e apenas o líquido exterior está em contacto com o substrato (Figura 3C). A comutação entre os dois modos permite aos utilizadores para efectuar ou interromper o processamento do substrato e é conseguida por controlo da diferença de cabeça-a-superfície ou alterando a proporção entre os fluxos de injecção (Q I2 / I1 Q). Para uma determinada geometria do canal, a pegada do líquido de processamento sobre o substrato pode ser controlada pela modulação de condições de fluxo (Figura 3D). hydr de sódioóxido (NaOH) é utilizado como líquido de processamento interno para lisar as células, e o lisado é continuamente aspirado a partir da superfície. Porque os efeitos químicos de o líquido de processamento estão localizadas à pegada HFC interior, as células adjacentes permanecem não perturbada, o que permite estudos espaço-temporais de interacções célula-célula. A funcionalidade de digitalização da MFP permite a criação de geometrias definidas pelo usuário de padrões celulares (Figura 4). Além disso, a escolha de NaOH como líquido de processamento acomoda a análise do ADN a jusante (Figura 7).
Apresenta-se um protocolo versátil para a modelação subtractiva de monocamadas de células que permite a geração rápida de padrões de células espacialmente definidos. lise selectiva de monocamadas de células é realizada utilizando NaOH como do líquido de processamento no hHFC. O NaOH instantaneamente desnatura as proteínas contidas na membrana da célula. Recomendamos o uso da concentração de 50 mM de NaOH para assegurar o processamento a jusante do lisado. Esta concentração pode ser aumentada para a remoção mais rápida de células, processamento a jusante desde lisado não é um objetivo. O hHFC assegura que as áreas circundantes não transformados da monocamada de células não são afectados e estão disponíveis para qualquer expansão do padrão ou de sondagem outras propriedades das células.
A taxa de remoção de células é uma função tanto da química e de corte apresentado pelo fluxo. Nós escolhemos um alcance de taxas de fluxo para ter a remoção de células dominante química. velocidades de digitalização de 10-20 & #181; m / seg utilizando uma taxa de fluxo de injecção de NaOH de 6-8 ul / min são usados para facilitar a modelação subtractiva "rápida". A rápida taxa de remoção de células aborda alguns dos desafios enfrentados pela impressão de superfície padronização abordagens baseadas 20,21. Estes métodos requerem um mecanismo para limitar o crescimento de células em áreas espacialmente definidos, por exemplo, por deposição selectiva de proteínas de adesão celular, através da impressão de micro-contacto e subsequente sementeira de células para obter o padrão. Eles são limitados pela baixa taxa de transferência e requerem vários passos sequenciais para a geração de padrões, bem como um selo de estêncil / nova para cada padrão. O método descrito não requer o crescimento selectivo de células em áreas definidas, e supera as limitações através da realização de vários padrões subtractiva em contraste com a impressão, ao mesmo tempo não exigindo qualquer tratamento adicional do substrato de cultura de células.
Com o protocolo descrito no presente documento, a taxa de transferência de monocamadas de células padronizaçãoé aumentada, enquanto que a obtenção de um feedback visual imediata do padrão gerado. Isto facilita a modificação em tempo real dos padrões. Tal controle pode ser crucial em cenários em que a viabilidade celular em uma determinada superfície não é homogênea. Outra vantagem do método é que a mesma cabeça e da química podem ser usadas para gerar múltiplos padrões, reduzindo assim o número de passos envolvidos na geração de uma monocamada de células modelado.
As dimensões dos canais na cabeça e a geometria da cabeça pode ser dimensionada de acordo com os requisitos da aplicação, permitindo assim um controlo sobre a resolução da padronização. Todas as experiências no presente trabalho foram realizadas utilizando uma cabeça de MFP com dimensões abertura fixa, especificamente com aberturas internas a 100 × 100 mm e aberturas exteriores em 200 × 100 mm. Este design com aberturas exterior maior foi escolhido para garantir o funcionamento contínuo da hHFC sem entupimento das aberturas pelosdetritos celulares perdida. Nós testamos as cabeças com dimensões abertura interior 50 × 50 mm e 50 mm de espaçamento entre eles, com resultados bem sucedidos na remoção de células. A utilização de aberturas menores, abaixo de 10 x 10 um, com 10 um espaçamento, permitiria escala para um tamanho pegada menor (~ 30 × 30 mm), permitindo, assim, uma maior resolução em padronização. Observamos questões operacionais com abertura com dimensões inferiores a 10 mm, devido ao entupimento de partículas. Devido a estas dificuldades operacionais, 100 uM é o actual limite de resolução e, consequentemente, uma limitação da técnica descrito. No entanto, podemos resolver isso usando a habilidade formação líquida do hHFC. Nós demonstramos que a remoção de células de resolução pode ser sintonizado para um dado conjunto de dimensões de abertura, controlando Q I2 / I1 Q (Figura 4b) e a abertura do vértice para-substrato-10,14. As etapas utilizadas no trabalho atual tem um tamanho mínimo de passo de 100 nm.Uma combinação destes parâmetros controláveis pode melhorar a resolução espacial da remoção de células em termos de tamanho reduzido e a distância de exploração.
Se modelado co-culturas são desejados para estudar as interacções célula-célula específicas entre diferentes tipos de células, a semeadura sequencial e uma modelação pode ser efectuada utilizando o protocolo descrito. Finalmente, o ADN amplificável de alta qualidade pode ser obtida a partir do lisado, como é evidente pelo pico singular no DNA derreter curva (ver Figura 7). Nós avaliamos a quantidade de ADN de cerca de 1,6 ng a partir de uma única área de cobertura (cerca de 300 células) utilizando qPCR, que está perto de expectativa teórica (6-8 pg / célula). Isto indica uma quantidade do DNA extraído apropriado para vários processos a jusante, enquanto eliminando o uso de quaisquer métodos de isolamento do ADN. Isso abre caminhos para a DNA-análise baseada em locais sondagem de células cultivadas. A capacidade de moldar hHFC para líquidos também pode ser utilizado para depositar as células vivas e as proteínas sobre ACvado superfícies que, em combinação com o padrão subtractivo e de co-cultura sequencial apresentado neste protocolo permite a criação de padrões de célula e célula-matriz complexa de substratos de cultura. A versatilidade eo controle fornecido pela padronização subtrativo baseado em hHFC de monocamadas de células e a possibilidade de realizar análise de DNA nas células extraídas, fornece um novo e poderoso conjunto de ferramentas para biólogos para realizar estudos espacialmente resolvidos envolvendo interações celulares.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Research Council (ERC) Starting Grant, under the 7th Framework Program (Project No. 311122, BioProbe). We thank Dr. Julien Autebert and Marcel Buerge for technical assistance and discussions during the development of the protocol and the platform. Prof. Petra Dittrich (ETH Zurich), Prof. Bradley Nelson (ETH Zurich), Dr. Bruno Michel and Dr. Walter Riess are acknowledged for their continuous support.
Materials | |||
Microfluidic Probe (MFP) | NA | NA | Silicon/glass hybrid probe head with channels patterned in silicon. Fabrication done in-house at IBM Research – Zürich |
Lab Tek II Chamber slides with 2 chambers | ThermoFisher scientific, USA | 154461 | 2 Chamber chamber slides for cell culture with each chamber providing an area of 4 cm^2 and capable of holding upto 3 ml of media volume |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals and cell lines used | |||
Sodium Hydroxide, Tris-Cl, Ethylenediaminetetraaceticacid, Rhodamine B | SigmaAldrich chemicals, USA | S5881, 252859, E9884, R6626 | Chemicals used for processing and shielding liquids |
Proteinase K | Qiagen, Germany | 19131 | protease to digest denatuired proteins |
Deconex 16 Plus | Bohrer Chemie, Switzerland | NA | Universal cleaning agent for labaratory consumables. Used for non stringent cleaning. |
DNA away | ThermoFisher scientific, USA | 7010 | Surface decontaminant that denatures DNA and DNAases. |
DMEM, high glucose, GLUTAMAX supplement | ThermoFisher scientific, USA | 10566-016 | Culturing medium for epithelial cells. |
CellTracker Green CMFDA dye | ThermoFisher scientific, USA | C7025 | Membrane permeant live cell labeling dye. Dye active for 72 hours. |
CellTracker Orange CMRA dye | ThermoFisher scientific, USA | C34551 | |
β-actin genomic primers for qPCR | Integrated DNA technologies, USA | NA | Custom oligos used for DNA quality validation and qPCR. |
MCF7 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-22 | Cell lines used to produce co-cultures. |
MDA-MB-231 breast carcinoma cells | ATCC, USA | ATCC HTB-26 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment and fluidic connections | |||
Motorized high precision stages | Custom machined components. Linear axis motors from LANG GmBH, Germany | Customized linear axis stages from LT series | 3 × LT for 3 axes. LSTEP controller used for interfacing stages and PC through RS 232 port. |
Syringes | Hamilton, Switzerland | 1700 TLLX series | Interchangeable with syringes provided by other manufacturers with a 250-500 µl range. |
Nemesys low pressure syringe pumps | cetoni GmbH, Germany | NA | Component of pumping station. |
Circular M1-connector | Dolomite microfluidics, United Kingdom | 3000051 | Interface between vias in MFP head and tubing |
Tilt/rotation stage Goniometer | OptoSigma, USA | KKD-25C | Goniometer to adjust coplanarity of MFP apex |
DS Fi2 HD color camera (CCD) | Nikon, Switzerland | NA | Controlled using DS-U3 controller unit |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Win – Commander | LANG GmBH, Germany | NA | Stage control software. |
Qmix Elements | cetoni GmbH, Germany | NA | Pump control software. |
NIS Elements | Nikon, Switzerland | NA | Basic research module for image acquisition and analysis. |