Migliorata la Polymerase Chain Reaction-restrizione frammento lunghezza polimorfismo genotipizzazione di Pufferfish Tossico per cromatografia liquida / spettrometria di massa
Summary
Un metodo lunghezza dei frammenti di reazione di restrizione polimorfismo a catena della polimerasi migliore per la genotipizzazione specie pesci palla da cromatografia liquida / spettrometria di massa è descritta. Una colonna monolite di silice in fase inversa è impiegato per separare ampliconi digerito. Questo metodo può chiarire le masse monoisotopico di oligonucleotidi, che è utile per identificare composizione di base.
Abstract
Una versione migliorata di una reazione a catena della polimerasi (PCR) frammento -restriction polimorfismo della lunghezza (RFLP) Metodo per la genotipizzazione specie tossiche pesci palla dal liquido spettrometria di massa cromatografia / ionizzazione elettrospray (LC / ESI-MS) è descritto. estrazione del DNA viene effettuata utilizzando un kit di estrazione del DNA su membrana di silice. Dopo l'amplificazione PCR utilizzando un buffer PCR priva di detersivo, enzimi di restrizione vengono aggiunti alla soluzione senza purificazione della soluzione di reazione. Una colonna monolite di silice in fase inversa e una trasformata di Fourier spettrometro di massa ad alta risoluzione con un analizzatore trap Kingdon modificati sono impiegati per la separazione e la rilevazione rispettivamente. La fase mobile, costituito da 400 mM 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo, 15 mM trietilammina (pH 7,9) e metanolo, viene consegnato ad una portata di 0,4 ml / min. Il tempo di ciclo per LC analisi / ESI-MS è 8 min compreso equilibrazione della colonna. software Deconvoluzione avere un isotopo modello di distribuzione of l'oligonucleotide viene utilizzato per calcolare la massa monoisotopica corrispondente dallo spettro di massa. Per l'analisi di oligonucleotidi (range 26-79 nucleotidi), accuratezza di massa era 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) e l'eccellente accuratezza e precisione sono stati sostenuti per 180 ore senza l'uso di uno standard di massa di blocco.
Introduction
La spettrometria di massa (MS) è una tecnologia accettata per l'identificazione rapida e affidabile di acidi nucleici, matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) e Elettrospray (ESI) essendo utilizzata per ionizzazione 1,2. La tecnica MALDI è tipicamente combinato con un tempo di volo (TOF) analizzatore; Tuttavia, l'applicazione di MALDI-TOF MS è limitata a brevi oligonucleotidi (~ 25 nucleotidi (nt)) a causa della conseguente frammentazione, formazione di addotti e bassa ionizzazione efficienza 1,2. Al contrario, ESI è applicabile a oligonucleotidi lunghi (> 100 nt), ma molti stati di carica di pluralità addebitato ioni ([M-nH] n-) sono prodotti contemporaneamente da Biomacromolecules e, di conseguenza, la massa dell'analita può superare la tomaia limite del campo m / z dello spettrometro. Ciò richiede l'interpretazione degli spettri contorto, cioè, trasformazione di una serie stato di carica nella massa corrispondentevia deconvoluzione.
Nel caso della misurazione massa di una piccola molecola, il picco della massa monoisotopica, cioè, la massa della molecola contenente solo l'isotopo più comune di ogni elemento è il più abbondante e osservato naturalmente 3. Con l'aumento del peso molecolare, i turni di distribuzione isotopica a più alto m / z e il picco monoisotopico diventa oscurati dal rumore della linea di base 3-5. Una volta che il picco monoisotopico non è più rilevabile per masse superiori a 10 kDa 3, la massa molecolare medio viene utilizzato per la misurazione piuttosto che la massa monoisotopico 5. In tali casi, la distribuzione isotopica in cui ciascuno dei singoli picchi è separato da 1 Da può essere osservata solo quando un analizzatore di massa ad alta risoluzione, come un TOF, una trasformata di Fourier modificato Kingdon trappola analizzatore 6, o una trasformata di Fourier ione risonanza ciclotronica analizzatore viene utilizzato per l'analisi. Tuttavia, il più abbondante picco è sometimes non è coerente con la massa molecolare media 5. Questi problemi possono portare a difficoltà di determinare con precisione analiti.
Data la variazione abbondanza naturale di isotopi stabili e le difficoltà nella determinazione della massa molecolare media, misurazione della massa monoisotopica è ideale per la caratterizzazione massa di biomolecole 3,4. In pratica, se un picco monoisotopico può essere osservato o no, la massa monoisotopico può essere stimata confrontando lo schema della distribuzione isotopica osservata a quella teorica calcolata da un modello analita 4,7-10. L'algoritmo di raccordo 8 è ora incorporato nel software proprietario.
Nel contesto di ESI-MS, la dissociazione di un duplex DNA, la purificazione e dissalazione sono necessari per la misura diretta per evitare il fallimento di ionizzazione a causa di soppressione ionica e addotto formazione 2,10-14. Queste procedure sono GUAesome, tuttavia, i sistemi analitici completamente automatizzati sono stati sviluppati commercialmente coinvolge reazione a catena della polimerasi (PCR), preparazione del campione e ESI-MS per l'individuazione di patogeni 15-20. Un altro approccio è l'introduzione di cromatografia liquida (LC) per la separazione. LC fornisce una separazione in linea degli analiti da sostanze coesistenti e non necessita di preparazione del campione laboriosa prima ionizzazione 21,22. Tuttavia, la separazione degli acidi nucleici utilizzando una fase mobile compatibile MS è più difficile che per la maggior parte degli altri composti, come farmaci, peptidi e proteine per la natura polianionica dei nucleotidi. Gli esempi più riusciti di LC / ESI-MS comportano l'uso di coppia ionica fase inversa LC. Una fase mobile di 1,1,1,3,3,3-esafluoro-2-propanolo (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanolo stato inizialmente proposto dalla Apffel et al. Per la separazione e la rilevazione corti oligonucleotidi 23. Applicazione di LC / ESI-MS genotipizzazione per differentiation di specie patogene, polimorfismi a singolo nucleotide e ripete breve tandem stato segnalato con una colonna di polimero monolite capillare in grado di separare gli oligonucleotidi più lunghi 1,21,24-33.
In Giappone e negli Stati Uniti, grave intossicazione alimentare si è verificato a causa di errori di identificazione e preparazione inadeguato di pesce palla, e questo nonostante il fatto che la distribuzione e la preparazione del pesce palla è strettamente controllato dalla legislazione sulla sicurezza alimentare 34,35. Inoltre, un omicidio volontario con estratto di pesci palla si è verificato in Giappone 36. Pertanto, la differenziazione delle specie pesce palla è richiesto sia dal punto di vista della salute pubblica e di indagine forense. Inoltre, poiché rubripes Takifugu è molto più costoso rispetto ad altri tipi di pesci palla, una capacità di differenziazione è necessaria anche nel contesto delle indagini sulle frodi alimentari.
Qui, un metodo dettagliato per determinare il mmassa onoisotopic di un prodotto di PCR mediante LC / ESI-MS usando una colonna di silice monolite fase inversa e uno spettrometro di massa ad alta risoluzione è descritto. In particolare, l'approccio è stato sviluppato per consentire differenziazione delle specie tossiche pufferfish basate sull'uso della lunghezza del frammento di restrizione PCR polimorfismo (RFLP) Metodo 37, che è il primo esempio di differenziazione specie di animali utilizzando MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per estrarre DNA, un kit commerciale per estrarre DNA da sangue e tessuti è utilizzato in conformità con il protocollo del produttore con lievi modifiche (quantità di proteinasi K e centrifugazione della soluzione di lisi). Tuttavia, qualsiasi kit di estrazione può essere utilizzato fintanto DNA cellulare può essere estratto con recupero e purezza appropriato per PCR. Questo metodo è stato testato utilizzando muscolare, pinna, fegato, ovaie, e la pelle 37. Fin è particolarmente adatto a causa della grande superficie, che consente una rapida lisi con proteinasi K. freschi, congelati, secchi, bolliti e campioni di pesci palla da forno sono stati testati con successo 37.
Il primer set PCR (Tabella 1) è stato progettato per pesci palla e amplifica il 16S mitocondriale ribosomiale gene RNA di pesci palla. Il DNA bersaglio per amplificare è 114-115 bp (genere Takifugu) e 86 bp (genere Lagocephalus) (Tabella 5). Per facilitare il metodo SVILUPPOnt, oligonucleotidi sintetizzati aventi le sequenze bersaglio sono stati utilizzati per il riferimento invece di raccogliere campioni di pesci palla autentici. Il primer può essere sostituito da un altro set di primer in risposta allo scopo, tuttavia, finale lunghezza del DNA dopo digestione enzimatica deve essere inferiore a 100 nt in termini di mantenimento della qualità dello spettro di massa necessaria per deconvoluzione successo. Inoltre, la pressione dell'azoto nel C-trappola deve essere ridotta quando l'oligonucleotide bersaglio è più lungo di circa 75 nt e la qualità dello spettro di massa è insufficiente per deconvoluzione successo. Tali limiti possono essere controllate attraverso recenti sviluppi nel software dello strumento, altrimenti la valvola per il C-trap all'interno del telaio deve essere sintonizzato come descritto nella sezione del protocollo. Per quanto riguarda la preparazione dei campioni, l'uso di reagenti senza detersivo è fondamentale per la successiva LC in termini di adeguata forma di picco, picco di intensità sufficiente e tempo di ritenzione stabile 31.
<p class = "jove_content"> Una colonna PS-DVB capillare monolite 21,24-33, una fase inversa colonna di particelle di silice C 18 23,40,41 e una cromatografia di interazione idrofobica (HILIC) colonna 42 sono stati utilizzati per la LC / analisi ESI-MS di oligonucleotidi. Tra questi, la colonna capillare monolite è superiore agli altri in termini di capacità di separazione, tuttavia, la colonna capillare monolite utilizzato in studi precedenti è stata fatta in casa e fatto funzionare a bassa portata (2 ml / min), che richiede strumentazione dedicata a micro LC. Per facilitare il funzionamento facile, colonne disponibili in commercio sono stati valutati per la separazione di lunghe oligonucleotidi a portate più elevate (100-400 ml / min). Tre coppie di duplex DNA (26, 37 e 53 bp) sono stati separati usando le colonne di cui sopra, tuttavia, i tempi di ciclo della colonna di silice in particelle -bonded C 18 e la colonna PS-DVB monolite erano 65 e 70 min, rispettivamente, , mentre quella della C <sub> 18 -bonded colonna monolite silice era 8 min (Figura 1). Prendendo una rapida analisi in considerazione, la colonna monolite di silice C 18 -bonded è stato scelto per i nostri scopi, nonostante la capacità di separazione limitata; tuttavia i rimanenti due colonne possono essere impiegati quando è richiesto migliorata separazione. Teoricamente, nel caso di una colonna monolitica, non c'è il volume interstiziale e la fase mobile sarebbe costretto a fluire attraverso i pori della fase solida, pur mantenendo una lunghezza di percorso coerente, permettendo così una separazione efficiente 27. Tali processi si manifesterebbe, soprattutto nell'analisi di biomacromolecole come un oligonucleotide, come la lenta diffusione delle molecole grandi. Uno dei vantaggi pratici di una colonna monolite è che la contropressione è inferiore a quella di una colonna di silice particellare 27. Nonostante l'elevata portata (400 ml / min) e bassa temperatura della colonna (20 ° C), contropressione massima delsistema era 12.5 MPa 37. Questa è la prima dimostrazione del vantaggio di un -bonded colonna di silice monolite C 18 per l'analisi rapida di un lungo oligonucleotide. A causa della elevata portata, uno strumento dedicato per micro LC e preciso allineamento all'interfaccia non sono necessari. Invece, una sonda ESI riscaldata è necessaria per dissociare il duplex DNA e assistere ionizzazione DNA come descritto più avanti.Ion-pair cromatografia viene comunemente utilizzato per la separazione compatibile MS di oligonucleotidi. Tuttavia, un reagente coppia ionica interferisce generalmente con il processo ESI e diminuisce la sensibilità di ESI-MS. Pertanto, HFIP viene spesso utilizzato per la fase mobile per migliorare la sensibilità del oligonucleotide. Tuttavia, HFIP (punto 59 ° C ebollizione) vaporizza rapidamente all'interfaccia prima (punto di ebollizione 65 ° C) metanolo e, quindi, questa perdita di solvente aumenta il pH e promuove la dissociazione del reagente coppia ionica (cioè, TEA)dal oligonucleotide. Poiché il presente metodo utilizza una sonda riscaldata ESI, che nebulizza l'eluato con azoto caldo a 350 ° C, questo effetto può essere troppo enfatizzata. Invece di tampone HFIP-TEA, Erb e Oberacher raccomandati acetato cyclohexyldimethylammonium (CycHDMAA; pH 8,4) per l'analisi genotipizzazione causa di una riduzione della formazione di addotti con ioni metallici traccia 33. Gli autori dedotto che CycHDMAA sé soppressa la formazione dell'addotto metallo. Nonostante letteratura, formazione significativa addotto non è stato osservato nel presente metodo. Inoltre, il vantaggio notevole di sistema HFIP-TEA-metanolo è che l'area del picco ottenuto con il sistema HFIP-TEA-metanolo era 17 volte maggiore di quella ottenuta dal sistema CycHDMAA-acetonitrile analizzando un amplicone 86 bp di T. poecilonotus (dati non riportati). Uno svantaggio del sistema HFIP-TEA-metanolo, tuttavia, è il costo maggiore rispetto al sistema CycHDMAA-acetonitrile.
Calcolo della massa monoisotopico richiede la separazione dei picchi isotopici di ioni a carica multipla. Pertanto, la risoluzione è critica per la presente analisi. Sebbene il potere di risoluzione necessaria dipende dalla lunghezza coppia di basi dell'analita, analizzatori TOF convenzionali, che hanno un potere di risoluzione di diverse decine di migliaia, può essere limitato per l'analisi di brevi oligonucleotidi.
Le masse monoisotopico teorici indicati nella tabella 4 sono stati calcolati dalle composizioni di base corrispondenti degli analiti. In alternativa, Muddiman et al. Ha sviluppato un software per calcolare la composizione di base dalla massa accurata 43. Un programma simile è stato integrato nel sistema automatizzato ESI-MS 16-18. L'uso di questi algoritmi può migliorare la robustezza del presente metodo perché una massa monoisotopica misurato non corrisponde sempre a una base unica composizione oala alla tolleranza di massa di 3 ppm risultante dalla errore di misura inevitabile. Purtroppo, non siamo riusciti a ottenere questi prodotti software per il presente studio.
La determinazione specie massa basato monoisotopico attuale può essere adatto non solo per la differenziazione dei pesci palla, ma anche per il rilevamento di altri polimorfismi del DNA perché il presente metodo si basa sull'analisi della composizione di base e non comporta una procedura appositamente progettato per pufferfish. Per quanto riguarda la rilevazione di DNA polimorfismo, il sistema ESI-MS dedicato è completamente automatizzato e facile da usare, che può essere adatto per uso diagnostico come il rilevamento di agenti patogeni 15,17,18,20,30. Viceversa, il presente metodo è realizzabile con comuni strumenti di ricerca e apparecchi e, quindi, adatti per impieghi di ricerca. ESI-MS è già stato applicato per il polimorfismo del DNA umano come singolo nucleotide 13,28,32 polimorfismo, breve tandem ripetizioni 26, E il DNA mitocondriale analsis 16,19. Micro RNA è stato anche analizzato tramite capillare LC / ESI-MS 44. Queste applicazioni pubblicate possono essere realizzati anche con il presente metodo. Inoltre, questo metodo può essere adatto per controllare l'interazione tra oligonucleotidi e basso peso molecolare composti, come l'interazione di antibiotici e RNA ribosomiale 45 causa la separazione a bassa temperatura. In tali casi, oligonucleotidi e composti a basso peso molecolare deve essere rilevata simultaneamente, il che è un vantaggio di usare LC / ESI-MS.
Vi è una limitazione che la strumentazione non è adatto per l'esecuzione di analisi parallelo come nelle tecniche convenzionali quali Sanger sequenziamento e PCR in tempo reale. Inoltre, il presente metodo identifica unica composizione di base ed ogni sostituzione di base all'interno della stessa molecola non possono essere distinte. Tuttavia, l'analisi del DNA MS-basato qui descritto può ancora avere il merito a termines di accuratezza rispetto alla tecniche dye come gel elettroforesi e real-time PCR DNA legame.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).
Materials
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
| TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
| PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
| Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
| Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
| Detergent Free 5X Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
| Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
| dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
| 10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
| Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
| Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
| Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
| Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
| Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
| UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
| Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
| Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
| 300-μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
| Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
| Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
| Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
| Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
| ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
| Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
| Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
| Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
| Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
| Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |
References
- Oberacher, H. On the use of different mass spectrometric techniques for characterization of sequence variability in genomic DNA. Anal. Bioanal. Chem. 391, 135-149 (2008).
- Banoub, J. H., Miller-Banoub, J., Jahouh, F., Joly, N., Martin, P., Banoub, J. H., Limbach, P. A. Chapter 1, Overview of recent developments in the mass spectrometry of nucleic acid and constituents. Mass spectrometry of nucleosides and nucleic acids. 1, 1-90 (2010).
- Yergey, J., Heller, D., Hansen, G., Cotter, R. J., Fenselau, C. Isotopic distributions in mass spectra of large molecules. Anal. Chem. 55, 353-356 (1983).
- Zubarev, R. A., Demirev, P. A. Isotope depletion of large biomolecules: Implications for molecular mass measurements. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 149-156 (1998).
- Null, A. P., Muddiman, D. C. Determination of a correction to improve mass measurement accuracy of isotopically unresolved polymerase chain reaction amplicons by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 1714-1722 (2003).
- Hu, Q., Noll, R. J., Li, H., Makarov, A., Hardman, M., Cooks, R. G. The Orbitrap: a new mass spectrometer. J Mass Spectrom. 40, 430-443 (2005).
- Senko, M. W., Beu, S. C., McLaffertycor, F. W. Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 6, 229-233 (1995).
- Horn, D. M., Zubarev, R. A., McLafferty, F. W. Automated reduction and interpretation of high resolution electrospray mass spectra of large molecules. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, 320-332 (2000).
- Frahm, J. L., Mason, C. J., Muddiman, D. C. Utility of accurate monoisotopic mass measurements to confidently identify lambda exonuclease generated single-stranded amplicons containing 7-deaza analogs by electrospray ionization FT-ICR mass spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 234, 79-87 (2004).
- Frahm, J. L., Muddiman, D. C. Nucleic Acid analysis by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry at the beginning of the twenty-first century. Curr. Pharm. Des. 11, 2593-2613 (2005).
- Null, A. P., George, L. T., Muddiman, D. C. Evaluation of sample preparation techniques for mass measurements of PCR products using ESI-FT-ICR mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13, 338-344 (2002).
- Null, A. P., Benson, L. M., Muddiman, D. C. Enzymatic strategies for the characterization of nucleic acids by electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 2699-2706 (2003).
- Manduzio, H., Ezan, E., Fenaille, F. Evaluation of the LTQ-Orbitrap mass spectrometer for the analysis of polymerase chain reaction products. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 3501-3509 (2010).
- Manduzio, H., Martelet, A., Ezan, E., Fenaille, F. Comparison of approaches for purifying and desalting polymerase chain reaction products prior to electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Biochem. 398, 272-274 (2010).
- Hofstadler, S. A., et al. TIGER: the universal biosensor. Int. J. Mass Spectrom. 242, 23-41 (2005).
- Eduardoff, M., et al. Mass spectrometric base composition profiling: Implications for forensic mtDNA databasing. Forensic Sci. Int. Genet. 7, 587-592 (2013).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J. Clin. Microbiol. 51, 40-45 (2013).
- Legoff, J., et al. Broad-range PCR-electrospray ionization mass spectrometry for detection and typing of adenovirus and other opportunistic viruses in stem cell transplant patients. J. Clin. Microbiol. 51, 4186-4192 (2013).
- Kiesler, K. M., Coble, M. D., Hall, T. A., Vallone, P. M. Comparison of base composition analysis and Sanger sequencing of mitochondrial DNA for four U.S. population groups. Forensic Sci. Int. Genet. 8, 226-232 (2014).
- Bacconi, A., et al. Improved sensitivity for molecular detection of bacterial and Candida infections in blood. J. Clin. Microbiol. 52, 3164-3174 (2014).
- Huber, C. G., Oberacher, H. Analysis of nucleic acids by on-line liquid chromatography-mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 20, 310-343 (2001).
- Pourshahian, S., McCarthy, S. M., Bonilla, J. V., Srivatsa, G. S. Chapter 4, Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography and mass spectrometry. Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products. , 137-166 (2011).
- Apffel, A., Chakel, J. A., Fischer, S., Lichtenwalter, K., Hancock, W. S. Analysis of Oligonucleotides by HPLC-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 69, 1320-1325 (1997).
- Premstaller, A., Oberacher, H., Huber, C. G. High-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry of single- and double-stranded nucleic acids using monolithic capillary columns. Anal. Chem. 72, 4386-4393 (2000).
- Oberacher, H., Oefner, P. J., Parson, W., Huber, C. G. On-Line Liquid Chromatography Mass Spectrometry: A Useful Tool for the Detection of DNA Sequence Variation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 3828-3830 (2001).
- Oberacher, H., Parson, W., Muhlmann, R., Huber, C. G. Analysis of polymerase chain reaction products by on-line liquid chromatography-mass spectrometry for genotyping of polymorphic short tandem repeat loci. Anal. Chem. 73, 5109-5115 (2001).
- Oberacher, H., Huber, C. G. Capillary monoliths for the analysis of nucleic acids by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Trends Anal. Chem. 21, 166-174 (2002).
- Oberacher, H., et al. Re-sequencing of multiple single nucleotide polymorphisms by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 30, e67 (2002).
- Oberacher, H., Parson, W., Holzl, G., Oefner, P. J., Huber, C. G. Optimized suppression of adducts in polymerase chain reaction products for semi-quantitative SNP genotyping by liquid chromatography-mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 1897-1906 (2004).
- Mayr, B. M., et al. Identification of bacteria by polymerase chain reaction followed by liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 4563-4570 (2005).
- Oberacher, H., Niederstatter, H., Casetta, B., Parson, W. Some guidelines for the analysis of genomic DNA by PCR-LC-ESI-MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 124-129 (2006).
- Beer, B., et al. CYP2D6 genotyping by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 400, 2361-2370 (2011).
- Erb, R., Oberacher, H. Comparison of mobile-phase systems commonly applied in liquid chromatography-mass spectrometry of nucleic acids. Electrophoresis. 35, 1226-1235 (2014).
- Cohen, N. J., et al. Public health response to puffer fish (Tetrodotoxin) poisoning from mislabeled product. J. Food Prot. 72, 810-817 (2009).
- Cole, J. B., et al. Tetrodotoxin poisoning outbreak from imported dried puffer fish–Minneapolis, Minnesota 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 63, 1222-1225 (2015).
- Ohno, Y., et al. The influence of tetrodotoxin on the toxic effects of aconitine in vivo. Tohoku J. Exp. Med. 167, 155-158 (1992).
- Miyaguchi, H., Yamamuro, T., Ohta, H., Nakahara, H., Suzuki, S. Genotyping of Toxic Pufferfish Based on Specific PCR-RFLP Products As Determined by Liquid Chromatography/Quadrupole-Orbitrap Hybrid Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem. 63, 9363-9371 (2015).
- Sambrook, J. F., Russell, D. W. . Neutral polyacrylamide gel electrophoresis. in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 40-46 (2001).
- Moini, M., Jones, B. L., Rogers, R. M., Jiang, L. Sodium trifluoroacetate as a tune/calibration compound for positive- and negative-ion electrospray ionization mass spectrometry in the mass range of 100-4000 Da. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 977-980 (1998).
- Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 646-653 (2003).
- Chen, B., Bartlett, M. G. Evaluation of mobile phase composition for enhancing sensitivity of targeted quantification of oligonucleotides using ultra-high performance liquid chromatography and mass spectrometry: application to phosphorothioate deoxyribonucleic acid. J. Chromatogr. A. 1288, 73-81 (2013).
- Gong, L., McCullagh, J. S. Analysis of oligonucleotides by hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to negative ion electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1218, 5480-5486 (2011).
- Muddiman, D. C., Anderson, G. A., Hofstadler, S. A., Smith, R. D. Length and base composition of PCR-amplified nucleic acids using mass measurements from electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 69, 1543-1549 (1997).
- Kullolli, M., Knorf, E., Arampatzidou, M., Tewari, M., Pitteri, S. J. Intact MicroRNA analysis using high resolution mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 80-87 (2013).
- Cummins, L. L., Chen, S., Blyn, L. B., Sannes-Lowery, K. A., Drader, J. J., Griffey, R. H., Hofstadler, S. A. Multitarget affinity/specificity screening of natural products: finding and characterizing high-affinity ligands from complex mixtures by using high-performance mass spectrometry. J. Nat. Prod. 66, 1186-1190 (2003).
