液体クロマトグラフィー/質量分析法による有毒フグの改善されたポリメラーゼ連鎖反応 - 制限断片長多型ジェノタイピング

1. DNA抽出注：このようなゲル電気泳動およびLC / ESI-MSなどのDNA抽出とPCR後の検査のための別の部屋を使用してください。緩衝液1（含む塩酸グアニジン）、およびDNA抽出キットプロトコルに従って洗浄バッファー2（塩酸グアニジンを含まない）を洗浄するためにエタノールを加えます。魚試料は、日本の魚の卸売業者や小売市場から得ました。 0.5ミリリットルまたは1.5ミリリットルマイクロチューブに魚の組織の30から50ミリグラムを置きます。 （フィンと皮膚を除く）マイクロスパチュラを使用して組織をつぶします。 注：フィンの場合には、浸漬0.5 mlチューブを使用しています。 溶解バッファーと簡単にプロテイナーゼKと渦の40μlの180μlのを追加します。 2時間または一晩のためにブロックヒータで56℃でインキュベートします。簡単にインキュベーションの間15分毎にボルテックスして混合します。 注：完全な溶解は必要ありません。 13,000×gで5分間遠心分離します。遠心分離後、小AMO場合油のUNTは肝臓などの脂肪サンプルの場合の表面上に存在する、それを捨てます。新しい1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移します。 グアニジン塩酸塩を含むカオトロピック緩衝液200μlを加え、ボルテックスで混和します。再びボルテックスすることにより、エタノール（99.5％）とミックスの200μlのを追加します。 2 mlのコレクションチューブに入れスピンカラムに混合物を転送します。 13,000×gで1分間遠心操作します。フロースルーを捨てます。 注意：グアニジンは、漂白剤との反応性が高い化合物を形成することができるので、無駄に漂白剤を追加しないでください。 13,000×gで1分間洗浄バッファー1（含む塩酸グアニジン）と遠心機の500μLを加えます。フロースルーとコレクションチューブを捨てます。 キットで提供される新しい2 mlのコレクションチューブにスピンカラムを配置します。 2万×gで3分間洗浄バッファー2と遠心機の500μLを加えます。フロースルーとコレクションチューブを捨てます。新しいにスピンカラムを移します1.5ミリリットルマイクロチューブ。 ピペットでスピンカラム・メンブレンの中央に溶出緩衝液200μl。 1分後、6,000×gで1分間遠心操作します。 ピペット50使い捨てUVキュベットに溶出液μlの220から300 nmでの溶出液のUVスペクトルおよび分光光度計を用いて260 nmの吸光度を測定します。 260 nmにピークを有するDNAのUVスペクトルを確認します。簡単な方程式「DNA濃度（ngの/μL）は260 nmの×50の吸光度を=」を使用して、おおよそのDNA濃度を計算します。 注：フグのフィンから抽出された典型的なDNA濃度は63±30 ngの/μL（N = 20）です。 DNA濃度を10ng /μl以上である場合は、5 ngの/μLまでのTris-EDTA（TE）緩衝液（pH8）でDNAサンプルを希釈します。 -20℃でサンプルを保存したり、PCR増幅（セクション2）に進みます。 2. PCR 各EXTRのために25μlのPCRを設定しますDNA試料、陽性対照の汚染を回避するために、クリーンベンチの表1および2に従って氷上および陰性対照（代わりにDNA試料の超純水）（TE緩衝液pH8.0中の標的配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した0.2μM）の作用。 注：簡単な操作のために、テンプレートDNAなしで全ての試薬を含むカクテルの十分な量を作り、それを分配します。 PCR産物の3 'オーバーハングの付加を回避するために、DNAポリメラーゼを有する校正活性を使用します。 表3に示したサイクルプログラムを使用してサーマルサイクラーでPCR増幅を行います。 3.酵素消化 PCR溶液に100mMのトリス-HCl（pH7.5）、100mMのMgCl 2を、10mMのジチオスレイトール、および500mMのNaClを含む溶液2μlを添加します。 各制限酵素（DRA IおよびMSP I）の1μl加え、穏やかに混合します。目に37℃で30分間インキュベートermalサイクラー。 MSP I.によって生成された粘着末端を埋め、残りのDNAポリメラーゼを活性化するために72℃で5分間インキュベートオプション：15（w / vの％）のクロスリンク比3.33の（％C、ビスアクリルアミドの割合）（重量％）と、ポリアクリルアミドゲル濃度（％のT）を用いてポリアクリルアミドゲル電気泳動によって反応液の各々2.5μlの分析38。蛍光DNA染色液を用いてゲルを染色し、琥珀色の画面を使用して、青色光トランスイルミに二本鎖DNAを観察します。 分析カラムを損傷することになる、目詰まりを防止するために0.2ミクロン遠心濾過装置を用いて反応溶液を濾過します。 分析まで-20℃でテーパー状ポリプロピレンバイアルとストアにろ液を転送します。 4. LC / ESI-MS分析 1 LボトルにTEAのHFIPの67.2グラム（ 約 42ミリリットル）および1.52グラム（ 約 2.0ミリリットル）を計量します。超純水（LC / MS GRAの955ミリリットルを追加します。ド）および試薬が完全に溶解するまでマグネチックスターラーを用いて攪拌します。溶液のアリコートを取り、pHをチェックし（7.85と7.95の間を、理想的でpH = 7.9）pHメーターを使用して。 注意：金属イオンによる汚染を避けるために、ボトルにアリコートを返さないでください。 pHが7.9でない場合は、pHを調整し、再度pH値を測定するためにHFIPまたはTEAのいずれかを少量加えます。 蒸発を防ぐために（家庭用）直接冷却ポータブル冷蔵庫を使用して、ボトルの冷却を液体クロマトグラフの線にボトルを接続します。 B.行目にメタノールで満たされた別の瓶を接続液体クロマトグラフにガードカラムと分析カラム（2.0×50ミリメートル、= 30nmのメソ細孔サイズ）を接続します。カラムを平衡化するために、初期移動相（95％Aおよび5％B）を流れ始めます。 較正39として0.5 mg / mlとナトリウムトリフルオロ酢酸（pHは3.5）を準備します。 トリフルオロ交流を50mg（ 約 34μl）を計量ビーカー内のid。 超純水30mlを添加し、pHメーターを用いて10mMの水酸化ナトリウムでpH3.5に滴定します。 超純水で50mlに埋めます。アセトニトリル（LC / MSグレード）の50ミリリットルを加え、混ぜます。 ワーキング溶液の一部を取り、室温で保管してください。 4°Cで溶液の残りの部分を格納します。 次のようにC-トラップの窒素圧力を減らします。 注：最近のフーリエ変換は、無傷のタンパク質分析に適している質量分析計を、変換圧力を制御するための制御ソフトウェアを有します。 質量分析計の左側上部カバーを取り外します。 C-トラップ弁は、左前の角にあります。 制御ソフトウェアの機器ステータスウィンドウに、高真空圧力値を確認してください。 注：値は、一般的に、3×10 -8バーです。 ロックを解除し、高真空プレスを減らすために非常にゆっくりとノブを反時計回りに回すためにノブを引いて1/3（典型的には、1×10 -8バール）にURE。示された圧力が遅れるようにして徐々に変更する必要があります。低圧に関する警告メッセージは無視してください。ロックするには、ノブを押してください。 安全のためにトップカバーを復元します。 トリフルオロ酢酸ナトリウム39を使用して、質量分析計を調整します。 注：毎日の質量較正は、このプロトコルで置き換えることができる、しかし、製造元が推奨する推奨キャリブレーションは、このキャリブレーションの前に完了している必要があります。 次のようにスキャンパラメータおよびチューニングソフトウェアの機器コントロールボックス内の加熱されたESI源のパラメータを設定します。スキャンタイプフルMSを。スキャン範囲m / zの 500-4,000;断片化（インソース衝突誘起解離（CID）電圧60 eVで、極性が負、シースガス流量5;補助ガス流量0、スイープガス、自動利得制御（AGC）は、1×10 6、最大注入時間50ミリ秒を標的率0を流れ、電圧3 kVのスプレー;キャピラリー温度320°C; S-レンズ高周波（RF）レベル100;ヒーター温度30℃です。 マイナスイオンの入力リストは、m / zの 792.85908、1064.80870、1336.75832、1608.70794、1880.65755、2152.60717、2424.55679、2696.50640、2968.45602、3376.38045として監視します。 質量分析計（位置B）のインターフェースに近い加熱ESIプローブを移動します。プローブとチューブとシリンジを接続します。 埋め込まれたシリンジポンプを用いて10μL/分の流速で常に較正を注入。カスタマイズされたキャリブレーションテーブル内の唯一の6低質量イオン（ のm / z 792.85908から2152.60717）を確認してください。 信号の強度が安定した後、キャリブレーションを続行します。キャリブレーション後、わずか6より高い質量のイオン（ のm / z 1880.65755から3376.38045）をチェックし、キャリブレーションを続行します。失敗を避けるために、一度に全てのイオンを使用して校正することは避けてください。 appropriaにプローブを移動します0.4ミリリットル/分（位置D）との流量のためのテ位置が不活性金属管を液体クロマトグラフに接続します。 次のようにチューニングソフトウェアの機器コントロールボックス内の加熱されたESI源のパラメータを設定します。シースガス流量50を、補助ガス流量15。ガス流量1のスイープ。電圧を2.5 kVのスプレー。キャピラリー温度350°C; S-レンズRFレベル100;ヒーター温度350℃です。 楽器の設定画面で、質量分析計の設定取得パラメータを次のようにメソッド時間8分。バルブ、質量分析計に3.5-6分、0から3.5と無駄に6-8分をそらします。ランタイム3.5〜6分。負極性;ソースCID電圧15.0 eVの中で、マイクロスキャン3。 14万（ のm / z 200で）公称分解能; AGCの目標1×10 6;最大イオン時間50ミリ秒。スキャン1の数。スキャン範囲m / zの 700-3,500;スペクトルデータ型プロファイル。 液体クロマトグラフのパラメータを設定し、次のように：カラムオーブン温度20°C; samplEトレイ温度10℃。勾配プログラム0-0.5分5％B、0.5分で5〜30％のB、1-3.5分30〜40％のB、3.5-5分40〜98％のB、5~6分98％のB、6- 6.05分98-5％のB、6.05から8分で5％B。レート0.4ミリリットル/分を流します。 パージは、バイアルの底部をタップすることで泡。サンプルラック上のサンプルバイアルを設定し、分析を開始するオートサンプラーを用いて、サンプルの1.0μLを注入します。 ブラウザソフトウェアで、生データファイルを開き、すべての買収が正常に正および負の対照を含め、完了していることを確認します。 注：フグのDNAが正常に増幅し、消化された場合、通常、2個または3個のピークが4〜5.5分の保持時間で総イオン電流クロマトグラムにおいて観察されるであろう。 5.デコンボリューションと解釈デコンボリューションソフトウェアを起動します。実験型」自動抽出物（同位体解決）」を選択します。 次のパラメータを用いる方法を編集します。出力質量Mを、 S / NのthresholD 3、相対的な量のしきい値0;負電荷はい。 m / z範囲700-3,500;はい、現在のクロマトグラム（XIC）イオン抽出計算し、電荷キャリアのH +。検出された電荷3の最小数。同位体比のヌクレオチド;適合率80％。剰余しきい値0％。はい重複を考慮して、範囲3-50を充電します。最小強度1。予想される強度誤差3。 新しいメソッドとして保存し、それを選択します。 生データファイルが存在するディレクトリを選択します。分析すべき生データファイルを選択し、ボタン「キューに追加」をクリックします。 デコンボリューションを開始するには[実行キュー]タブで[実行]ボタンをクリックします。 キューが完了した後、行を選択し、デコンボリューションの結果を得るために上部のキャプションに「オープン結果」をクリックします。 表4を使用して、4から5.5分の保持時間にピーク由来モノアイソトピック質量の結果を解釈します。