Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie
Summary
Een verbeterde polymerasekettingreactie-restrictiefragment lengte polymorfisme werkwijze voor genotyperen kogelvis soorten van vloeistofchromatografie / massaspectrometrie beschreven. Een omgekeerde-fase-silica monoliet kolom wordt toegepast voor het scheiden van geknipt amplicons. Deze methode kan de mono-isotopische massa van oligonucleotiden, die bruikbaar is voor het identificeren basissamenstelling helderen.
Abstract
Een verbeterde versie van een polymerase kettingreactie (PCR) -beperking fragment polymorfisme (RFLP) werkwijze voor het genotyperen van giftige kogelvis soorten van vloeistofchromatografie / electrospray ionisatie massaspectrometrie (LC / ESI-MS) is beschreven. DNA-extractie wordt uitgevoerd met een silica membraan-gebaseerde DNA extractie kit. Na de PCR amplificatie met behulp van een detergens-vrije PCR buffer, worden restrictie-enzymen toegevoegd aan de oplossing zonder zuiveren van de reactieoplossing. Een omgekeerde fase silica monoliet kolom en een Fourier-transformatie hoge resolutie massaspectrometer met een gemodificeerde Kingdon val analyzer worden gebruikt voor de scheiding en detectie, respectievelijk. De mobiele fase, bestaande uit 400 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol, 15 mM triethylamine (pH 7,9) en methanol wordt afgegeven met een stroomsnelheid van 0,4 ml / min. De cyclustijd voor LC / ESI-MS analyse 8 min inbegrip equilibratie van de kolom. Deconvolutie software met een isotoop distributiemodel of het oligonucleotide wordt gebruikt om de corresponderende mono-isotopische massa berekend uit het massaspectrum. Voor de analyse van oligonucleotiden (range 26-79 nucleotiden), nauwkeurigheid van massa's was 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) en een uitstekende nauwkeurigheid en precisie werden volgehouden 180 uur zonder gebruik te maken van een massa-standaard slot.
Introduction
Massaspectrometrie (MS) is een geaccepteerde techniek voor snelle en betrouwbare identificatie van nucleïnezuren, matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) en electrospray ionisatie (ESI) gebruikt voor ionisatie 1,2. De MALDI techniek wordt typisch gecombineerd met een time-of-flight (TOF) analyzer; echter de toepassing van MALDI-TOF MS beperkt tot korte oligonucleotiden (~ 25 nucleotiden (nt)) vanwege de volgende fragmentatie adduct vorming en lage ionisatie-efficiëntie 1,2. Daarentegen ESI geldt voor meer oligonucleotiden (> 100 nt), maar veel ladingstoestanden van meerdere geladen ionen ([M-nH] n-) gelijktijdig geproduceerd uit biomacromoleculen en derhalve de massa van de analyt kan het bovenste overschrijden limiet van de m / z van de spectrometer. Dit vereist de interpretatie van de ingewikkelde spectra, dat wil zeggen, transformatie van een laadtoestand serie in de overeenkomstige massavia deconvolutie.
Bij massameting van een klein molecuul, de piek van de mono-isotopische massa, dat wil zeggen de massa van het molecuul dat alleen de meest voorkomende isotoop van elk element de meest voorkomende en waargenomen natuurlijke 3. Naarmate het molecuulgewicht toeneemt, wordt het isotopische verdeling verschuift naar hogere m / z en de mono-isotopische piek verduisterd door basislijnruis 3-5. Zodra de mono-isotopische piek niet langer detecteerbaar massa groter dan 10 kDa 3, wordt het gemiddelde molecuulgewicht voor de metingen plaats van de mono-isotopische massa 5. In dergelijke gevallen kan de isotopische verdeling waarin elk van de individuele pieken gescheiden door 1 Da alleen waargenomen wanneer een hoge resolutie massa-analysator zoals een TOF een Fourier transformatie gemodificeerde Kingdons val analysator 6, of een Fourier transform ion cyclotron resonantie analysator wordt gebruikt voor analyse. Echter, de meest overvloedige piek sometimes niet in overeenstemming met de gemiddelde moleculaire massa 5. Deze problemen kunnen leiden tot problemen voor het nauwkeurig bepalen van analyten.
Gezien de variatie in de natuurlijke overvloed van stabiele isotopen en de moeilijkheden bij de bepaling van de molmassa, het meten van de mono-isotopische massa ideaal voor de massa van biomoleculen 3,4. In de praktijk, of een mono-isotopische piek kan worden waargenomen of de mono-isotopische massa kan worden geschat door het vergelijken van het patroon van de waargenomen isotopische distributie aan de theoretisch berekend uit een model analyt 4,7-10. De fitting algoritme 8 wordt nu opgenomen in proprietary software.
In de context van ESI-MS, dissociatie van een DNA-duplex, zuivering en ontzouting noodzakelijk zijn voor directe meting aan het falen van ionisatie voorkomen door ion onderdrukking en adductvorming 2,10-14. Deze procedures zijn troublesome echter volledig geautomatiseerde analysesystemen zijn commercieel ontwikkeld met polymerasekettingreactie (PCR), monstervoorbereiding en ESI-MS voor de detectie van pathogenen 15-20. Een andere benadering introduceert vloeistofchromatografie (LC) voor de scheiding. LC levert een online scheiding van analyten uit naast elkaar bestaande stoffen en vereist geen bewerkelijke monsterbereiding vóór ionisatie 21,22. Echter, scheiding van nucleïnezuren met een MS-compatibele mobiele fase is moeilijker dan bij de meeste andere verbindingen zoals geneesmiddelen, peptiden en eiwitten vanwege de polyanionische aard van de nucleotiden. De meest succesvolle voorbeelden van LC / ESI-MS omvatten het gebruik van ionenpaar omgekeerde-fase-LC. Een mobiele fase van 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -methanol werd aanvankelijk Apffel et al voorgesteld. Voor het scheiden en detecteren van korte oligonucleotiden 23. Toepassing van LC / ESI-MS genotypering voor differentiation van een ziekteverwekker soorten, single-nucleotide polymorfismen en short tandem repeats is gemeld met behulp van een capillair polymeer-monoliet column die langer oligonucleotiden 1,21,24-33 kan scheiden.
In Japan en de Verenigde Staten, heeft ernstige voedselvergiftiging opgetreden als gevolg van een verkeerde identificatie en onjuiste bereiding van pufferfish, en dit ondanks het feit dat de verdeling en de voorbereiding van de kogelvis streng wordt gecontroleerd door de voedselveiligheid wetgeving 34,35. Bovendien is een opzettelijke doodslag met behulp van kogelvis extract voorkwamen in Japan 36. Daarom wordt differentiatie van kogelvis soort vereist van zowel de volksgezondheid als forensisch onderzoekende standpunten. Bovendien, omdat Takifugu rubripes is veel duurder dan andere vormen van kogelvis, een differentiatie capaciteit is ook nodig in het kader van voedsel fraudeonderzoeken.
Hier wordt een gedetailleerde werkwijze voor het bepalen van de monoisotopic massa van een PCR-product met LC / ESI-MS met omgekeerde fase silica monoliet kolom en een hoge resolutie massaspectrometer wordt beschreven. Specifiek is de aanpak ontwikkeld om differentiatie van giftige kogelvis soorten gebaseerd op het gebruik van de PCR-restrictiefragment (RFLP) methode 37, waarbij het eerste voorbeeld speciesdifferentiatie dieren MS mogelijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om DNA te extraheren, wordt een commerciële kit voor het extraheren van DNA uit bloed en weefsels gebruikt volgens het protocol van de fabrikant met geringe wijziging (hoeveelheid proteïnase K en centrifugeren van de lysis oplossing). Echter kan elke extractie kit zolang cellulair DNA kunnen worden geëxtraheerd met voldoende herstel en zuiverheid voor PCR gebruikt. Deze methode is conform spier, vin, lever, eierstok en huid 37. Fin is bijzonder geschikt vanwege de grote oppervlakte, die een snelle lysis maakt met proteinase K. Vers, bevroren, gedroogd gekookt en gebakken kogelvis monsters werden met succes 37 getest.
De PCR-primer set (tabel 1) is ontworpen voor pufferfish en versterkt het mitochondriale 16S ribosomaal RNA gen van kogelvis. Het doel DNA te amplificeren is 114-115 bp (genus Takifugu) en 86 bp (genus lagocephalus) (Tabel 5). Methode developme vergemakkelijkennt, gesynthetiseerde oligonucleotiden met de doelsequenties werden gebruikt voor de plaatsreferentie verzamelen kogelvis authentieke monsters. De primer set kan worden vervangen door een andere primer in reactie op het doel echter uiteindelijke DNA lengte na enzymatische digestie moet kleiner zijn dan 100 nt in termen van behoud van de kwaliteit van het massaspectrum vereiste voor een succesvolle deconvolutie. Daarnaast moet stikstofdruk in de C-trap afnemen wanneer het beoogd oligonucleotide langer dan ongeveer 75 nt en de kwaliteit van het massaspectrum onvoldoende is voor een succesvolle deconvolutie. Dergelijke beperkingen kunnen worden gecontroleerd door de recente ontwikkelingen in Instrumentsoftware, anders wordt de klep voor de C-trap in het chassis moet worden afgestemd zoals beschreven in de sectie protocol. Voor monster voorbereiding, gebruik van detergent-vrije reagentia is van cruciaal belang voor de verdere LC in termen van de juiste vorm van de piek, voldoende piekintensiteit en stabiele retentietijd 31.
<p class = "jove_content"> A PS-DVB-monoliet capillaire kolom 21,24-33, een C 18 omgekeerde fase deeltjesvormig silicakolom 23,40,41 en een hydrofobe interactiechromatografie (HILIC) kolom 42 zijn gebruikt voor de LC / ESI-MS analyse van oligonucleotiden. Onder hen, de capillaire monoliet column is superieur aan de anderen in termen van scheiding capaciteit, maar de capillaire monoliet kolom gebruikt in eerdere studies werd gemaakt in-house en werken bij een lage stroomsnelheid (2 pl / min), die instrumentatie vereist gewijd aan micro LC. Gemakkelijk te vergemakkelijken, werden commercieel verkrijgbare kolommen geëvalueerd voor het scheiden van lange oligonucleotiden bij hogere stroomsnelheden (100-400 gl / min). Drie paren van DNA-duplexen (26, 37 en 53 bp) werden gescheiden onder toepassing van de bovengenoemde kolommen echter de cyclustijden van de -bonded deeltjesvormige silicakolom C 18 en PS-DVB-monoliet kolom waren 65 en 70 minuten respectievelijk , terwijl die van de C <sub> 18 -bonded silica monoliet kolom werd 8 min (figuur 1). Rekening houdend snelle analyse, werd de silica monoliet kolom C 18 -bonded gekozen voor onze doeleinden ondanks de beperkte scheiding capaciteit; maar de resterende twee kolommen kunnen worden toegepast bij verbeterde scheiding vereist. Theoretisch bij een monoliet kolom, is er geen interstitieel volume en de mobiele fase zou worden gedwongen te stromen door de poriën van de vaste fase met behoud van een constante weglengte, waardoor een efficiënte scheiding 27. Dergelijke werkwijzen worden geopenbaard, met name bij de analyse van biomacromoleculen zoals een oligonucleotide, zoals de langzame diffusie van grote moleculen. Een van de praktische voordelen van een monoliet kolom dat de tegendruk lager is dan die van een deeltjesvormig silicakolom 27. Ondanks de hoge stroomsnelheid (400 pl / min) en lage temperatuur kolom (20 ° C), maximale tegendruk van desysteem was 12,5 MPa 37. Dit is de eerste demonstratie van de voordelen van een C 18 -bonded silica monoliet kolom voor de snelle analyse van een lang oligonucleotide. Vanwege de hoge stroomsnelheid, zijn een speciaal instrument voor micro LC en nauwkeurige uitlijning op het raakvlak niet vereist. In plaats daarvan wordt een verwarmde ESI probe vereist om de DNA-duplex dissociëren en ionisatie van DNA helpen zoals later beschreven.Ionenpaar chromatografie wordt gewoonlijk gebruikt voor de MS-compatibele scheiding van oligonucleotiden. Echter een ionenpaar-reagens interfereert algemeen de ESI proces en vermindert de gevoeligheid van ESI-MS. Daarom wordt HFIP vaak gebruikt voor de mobiele fase om de gevoeligheid van het oligonucleotide te verbeteren. Echter, HFIP (kookpunt 59 ° C) verdampt snel aan het grensvlak voor methanol (kookpunt 65 ° C) en derhalve het verlies aan oplosmiddel verhoogt pH en bevordert de dissociatie van het ionenpaar-reagens (bijv TEA)van het oligonucleotide. Omdat de huidige werkwijze een verwarmde ESI sonde, die het eluaat met heet stikstofgas bij 350 ° C nebulizes in dienst heeft, kan dit effect worden benadrukt. In plaats van HFIP-TEA buffer, Erb en Oberacher aanbevolen cyclohexyldimethylammonium acetaat (CycHDMAA; pH 8,4) voor genotypering analyse als gevolg van een vermindering van de adduct formatie met sporen metaalionen 33. De auteurs afgeleid dat CycHDMAA zich onderdrukt de vorming van het adduct metaal. Ondanks de literatuur is significant adductvorming niet waargenomen bij de onderhavige werkwijze. Bovendien, het opmerkelijke voordeel van de HFIP-TEA-methanol is dat het piekoppervlak verkregen met HFIP-TEA-methanol systeem was 17 maal groter dan die verkregen uit de CycHDMAA-acetonitrile systeem bij het analyseren van een 86 bp amplicon van T. poecilonotus (gegevens niet getoond). Een nadeel van de HFIP-TEA-methanol systeem is echter de verhoogde kosten ten opzichte van de CycHDMAA-acetonitrile systeem.
Berekening van de mono-isotopische massa vereist de scheiding van isotopische pieken van meervoudig geladen ionen. Daarom is de resolutie is van cruciaal belang voor de huidige analyse. Hoewel vereiste oplossend vermogen is afhankelijk van de basepaar lengte van de analyt, conventionele TOF analysatoren, die een oplossend vermogen van enkele tienduizenden hebben, kunnen worden beperkt voor de analyse van korte oligonucleotiden.
De theoretische mono-isotopische massa getoond in Tabel 4 werden berekend uit de overeenkomstige base samenstellingen van de analyten. Als alternatief Muddiman et al. Ontwikkelde een softwaretoepassing naar de basis samenstelling berekenen op basis van de juiste massa 43. Een soortgelijk programma geïntegreerd in de geautomatiseerde ESI-MS systeem 16-18. Het gebruik van deze algoritmen kan de robuustheid van de onderhavige werkwijze te verbeteren omdat een gecontroleerde mono-isotopische massa niet altijd overeen met een unieke basissamenstelling ovleugel aan de massatolerantie van 3 ppm als gevolg van de onvermijdelijke meetfout. Helaas, we konden niet deze softwareproducten te krijgen voor de huidige studie.
De onderhavige mono-isotopische massa gebaseerde determinatie mag niet alleen geschikt voor de differentiatie van kogelvis, maar ook voor de detectie van andere DNA-polymorfismen omdat de onderhavige werkwijze is gebaseerd op de analyse van de basissamenstelling en geen die speciaal op kogelvis betrekken. Voor de detectie van DNA polymorfisme, de specifieke ESI-MS systeem is volledig geautomatiseerd en eenvoudig te bedienen, die geschikt zijn voor diagnostisch gebruik kan zijn zoals detectie van pathogenen 15,17,18,20,30. Omgekeerd, de onderhavige werkwijze uitvoerbaar gemeenschappelijke onderzoeksinstrumenten en apparaten en daarom geschikt voor research doeleinden. ESI-MS is al toegepast op menselijke DNA polymorfisme zoals enkele nucleotide polymorfisme 13,28,32, short tandem herhaling 26En mitochondriaal DNA analsis 16,19. Micro RNA werd geanalyseerd via capillair LC / ESI-MS 44. Deze gepubliceerde toepassingen kunnen ook worden gerealiseerd door de onderhavige werkwijze. Bovendien kan deze werkwijze geschikt voor het bewaken van de interactie tussen oligonucleotide en laag molecuulgewicht verbindingen, zoals de interactie van antibiotica en ribosomaal RNA 45 vanwege de scheiding lage temperatuur. In dergelijke gevallen, oligonucleotiden en laag molecuulgewicht verbindingen tegelijkertijd worden gedetecteerd, wat een voordeel van het gebruik van LC / ESI-MS.
Er is een beperking die de instrumentatie is niet geschikt voor het uitvoeren van parallelle analyse zoals in conventionele technieken zoals Sanger sequentiebepaling en real-time PCR. Bovendien is de onderhavige werkwijze identificeert alleen basissamenstelling en elke base substitutie in hetzelfde molecuul kan niet worden onderscheiden. Echter kan het MS-gebaseerde DNA-analyse beschreven nog verdienste in termens nauwkeurigheid ten opzichte van de DNA-bindende kleurstof gebaseerde technieken zoals gelelektroforese en real-time PCR.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).
Materials
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
| TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
| PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
| Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
| Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
| Detergent Free 5X Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
| Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
| dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
| 10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
| Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
| Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
| Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
| Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
| Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
| UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
| Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
| Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
| 300-μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
| Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
| Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
| Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
| Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
| ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
| Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
| Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
| Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
| Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
| Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |
References
- Oberacher, H. On the use of different mass spectrometric techniques for characterization of sequence variability in genomic DNA. Anal. Bioanal. Chem. 391, 135-149 (2008).
- Banoub, J. H., Miller-Banoub, J., Jahouh, F., Joly, N., Martin, P., Banoub, J. H., Limbach, P. A. Chapter 1, Overview of recent developments in the mass spectrometry of nucleic acid and constituents. Mass spectrometry of nucleosides and nucleic acids. 1, 1-90 (2010).
- Yergey, J., Heller, D., Hansen, G., Cotter, R. J., Fenselau, C. Isotopic distributions in mass spectra of large molecules. Anal. Chem. 55, 353-356 (1983).
- Zubarev, R. A., Demirev, P. A. Isotope depletion of large biomolecules: Implications for molecular mass measurements. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 149-156 (1998).
- Null, A. P., Muddiman, D. C. Determination of a correction to improve mass measurement accuracy of isotopically unresolved polymerase chain reaction amplicons by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 1714-1722 (2003).
- Hu, Q., Noll, R. J., Li, H., Makarov, A., Hardman, M., Cooks, R. G. The Orbitrap: a new mass spectrometer. J Mass Spectrom. 40, 430-443 (2005).
- Senko, M. W., Beu, S. C., McLaffertycor, F. W. Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 6, 229-233 (1995).
- Horn, D. M., Zubarev, R. A., McLafferty, F. W. Automated reduction and interpretation of high resolution electrospray mass spectra of large molecules. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, 320-332 (2000).
- Frahm, J. L., Mason, C. J., Muddiman, D. C. Utility of accurate monoisotopic mass measurements to confidently identify lambda exonuclease generated single-stranded amplicons containing 7-deaza analogs by electrospray ionization FT-ICR mass spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 234, 79-87 (2004).
- Frahm, J. L., Muddiman, D. C. Nucleic Acid analysis by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry at the beginning of the twenty-first century. Curr. Pharm. Des. 11, 2593-2613 (2005).
- Null, A. P., George, L. T., Muddiman, D. C. Evaluation of sample preparation techniques for mass measurements of PCR products using ESI-FT-ICR mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13, 338-344 (2002).
- Null, A. P., Benson, L. M., Muddiman, D. C. Enzymatic strategies for the characterization of nucleic acids by electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 2699-2706 (2003).
- Manduzio, H., Ezan, E., Fenaille, F. Evaluation of the LTQ-Orbitrap mass spectrometer for the analysis of polymerase chain reaction products. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 3501-3509 (2010).
- Manduzio, H., Martelet, A., Ezan, E., Fenaille, F. Comparison of approaches for purifying and desalting polymerase chain reaction products prior to electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Biochem. 398, 272-274 (2010).
- Hofstadler, S. A., et al. TIGER: the universal biosensor. Int. J. Mass Spectrom. 242, 23-41 (2005).
- Eduardoff, M., et al. Mass spectrometric base composition profiling: Implications for forensic mtDNA databasing. Forensic Sci. Int. Genet. 7, 587-592 (2013).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J. Clin. Microbiol. 51, 40-45 (2013).
- Legoff, J., et al. Broad-range PCR-electrospray ionization mass spectrometry for detection and typing of adenovirus and other opportunistic viruses in stem cell transplant patients. J. Clin. Microbiol. 51, 4186-4192 (2013).
- Kiesler, K. M., Coble, M. D., Hall, T. A., Vallone, P. M. Comparison of base composition analysis and Sanger sequencing of mitochondrial DNA for four U.S. population groups. Forensic Sci. Int. Genet. 8, 226-232 (2014).
- Bacconi, A., et al. Improved sensitivity for molecular detection of bacterial and Candida infections in blood. J. Clin. Microbiol. 52, 3164-3174 (2014).
- Huber, C. G., Oberacher, H. Analysis of nucleic acids by on-line liquid chromatography-mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 20, 310-343 (2001).
- Pourshahian, S., McCarthy, S. M., Bonilla, J. V., Srivatsa, G. S. Chapter 4, Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography and mass spectrometry. Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products. , 137-166 (2011).
- Apffel, A., Chakel, J. A., Fischer, S., Lichtenwalter, K., Hancock, W. S. Analysis of Oligonucleotides by HPLC-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 69, 1320-1325 (1997).
- Premstaller, A., Oberacher, H., Huber, C. G. High-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry of single- and double-stranded nucleic acids using monolithic capillary columns. Anal. Chem. 72, 4386-4393 (2000).
- Oberacher, H., Oefner, P. J., Parson, W., Huber, C. G. On-Line Liquid Chromatography Mass Spectrometry: A Useful Tool for the Detection of DNA Sequence Variation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 3828-3830 (2001).
- Oberacher, H., Parson, W., Muhlmann, R., Huber, C. G. Analysis of polymerase chain reaction products by on-line liquid chromatography-mass spectrometry for genotyping of polymorphic short tandem repeat loci. Anal. Chem. 73, 5109-5115 (2001).
- Oberacher, H., Huber, C. G. Capillary monoliths for the analysis of nucleic acids by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Trends Anal. Chem. 21, 166-174 (2002).
- Oberacher, H., et al. Re-sequencing of multiple single nucleotide polymorphisms by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 30, e67 (2002).
- Oberacher, H., Parson, W., Holzl, G., Oefner, P. J., Huber, C. G. Optimized suppression of adducts in polymerase chain reaction products for semi-quantitative SNP genotyping by liquid chromatography-mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 1897-1906 (2004).
- Mayr, B. M., et al. Identification of bacteria by polymerase chain reaction followed by liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 4563-4570 (2005).
- Oberacher, H., Niederstatter, H., Casetta, B., Parson, W. Some guidelines for the analysis of genomic DNA by PCR-LC-ESI-MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 124-129 (2006).
- Beer, B., et al. CYP2D6 genotyping by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 400, 2361-2370 (2011).
- Erb, R., Oberacher, H. Comparison of mobile-phase systems commonly applied in liquid chromatography-mass spectrometry of nucleic acids. Electrophoresis. 35, 1226-1235 (2014).
- Cohen, N. J., et al. Public health response to puffer fish (Tetrodotoxin) poisoning from mislabeled product. J. Food Prot. 72, 810-817 (2009).
- Cole, J. B., et al. Tetrodotoxin poisoning outbreak from imported dried puffer fish–Minneapolis, Minnesota 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 63, 1222-1225 (2015).
- Ohno, Y., et al. The influence of tetrodotoxin on the toxic effects of aconitine in vivo. Tohoku J. Exp. Med. 167, 155-158 (1992).
- Miyaguchi, H., Yamamuro, T., Ohta, H., Nakahara, H., Suzuki, S. Genotyping of Toxic Pufferfish Based on Specific PCR-RFLP Products As Determined by Liquid Chromatography/Quadrupole-Orbitrap Hybrid Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem. 63, 9363-9371 (2015).
- Sambrook, J. F., Russell, D. W. . Neutral polyacrylamide gel electrophoresis. in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 40-46 (2001).
- Moini, M., Jones, B. L., Rogers, R. M., Jiang, L. Sodium trifluoroacetate as a tune/calibration compound for positive- and negative-ion electrospray ionization mass spectrometry in the mass range of 100-4000 Da. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 977-980 (1998).
- Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 646-653 (2003).
- Chen, B., Bartlett, M. G. Evaluation of mobile phase composition for enhancing sensitivity of targeted quantification of oligonucleotides using ultra-high performance liquid chromatography and mass spectrometry: application to phosphorothioate deoxyribonucleic acid. J. Chromatogr. A. 1288, 73-81 (2013).
- Gong, L., McCullagh, J. S. Analysis of oligonucleotides by hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to negative ion electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1218, 5480-5486 (2011).
- Muddiman, D. C., Anderson, G. A., Hofstadler, S. A., Smith, R. D. Length and base composition of PCR-amplified nucleic acids using mass measurements from electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 69, 1543-1549 (1997).
- Kullolli, M., Knorf, E., Arampatzidou, M., Tewari, M., Pitteri, S. J. Intact MicroRNA analysis using high resolution mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 80-87 (2013).
- Cummins, L. L., Chen, S., Blyn, L. B., Sannes-Lowery, K. A., Drader, J. J., Griffey, R. H., Hofstadler, S. A. Multitarget affinity/specificity screening of natural products: finding and characterizing high-affinity ligands from complex mixtures by using high-performance mass spectrometry. J. Nat. Prod. 66, 1186-1190 (2003).
