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Genetics

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

Published: September 20, 2016
doi:
10.3791/54402
1National Research Institute of Police Science

Summary

Eine verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP-Verfahren zur Genotypisierung Kugelfisch-Spezies durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie beschrieben. Eine Umkehrphasen-Silica-Monolith Säule wird zur Trennung verdaut Amplikons eingesetzt. Dieses Verfahren kann die monoisotopisch Massen von Oligonukleotiden aufzuklären, die zur Identifizierung Basenzusammensetzung nützlich ist.

Abstract

Eine verbesserte Version einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -Beschränkung Fragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) Verfahren zur Genotypisierung toxische Kugelfisch-Spezies durch Flüssigchromatographie / Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (LC / ESI-MS) beschrieben. DNA-Extraktion wird eine Silica-Membran-basierte DNA-Extraktions-Kits durchgeführt. Nach der PCR-Amplifikation ein Detergens-freien PCR-Puffer verwendet wird, werden Restriktionsenzyme zu der Lösung gegeben, die Reaktionslösung ohne Reinigung. Eine Umkehrphasen-Silica-Monolith-Säule und einer Fourier-Transformation für Trennung und Detektion eines modifizierten Kingdon trap Analysator mit Massenspektrometer hoher Auflösung verwendet, respectively. Die mobile Phase, bestehend aus 400 mM 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol, 15 mM Triethylamin (pH 7,9) und Methanol wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,4 ml / min geliefert. Die Zykluszeit für LC / ESI-MS-Analyse ist 8 min einschließlich Äquilibrierung der Säule. Deconvolution Software ein Isotop Verteilungsmodell o mitf das Oligonukleotid wird verwendet, um die entsprechenden monoisotopische Masse aus dem Massenspektrum zu berechnen. Für die Analyse von Oligonukleotiden (Bereich 26 bis 79 Nukleotide) wurde die Massengenauigkeit von 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) und eine ausgezeichnete Genauigkeit und Präzision wurden für 180 h ohne die Verwendung eines Verriegelungsmassenstandard aufrechterhalten.

Introduction

Massenspektrometrie (MS) ist eine anerkannte Technik für schnelle und zuverlässige Identifizierung von Nukleinsäuren, Matrix-unterstützte Laser – Desorption / Ionisation (MALDI) und Elektrospray – Ionisation (ESI) für die Ionisation 1,2 verwendet wird. Die MALDI-Technik wird typischerweise mit einem time-of-flight (TOF) Analysator kombiniert; jedoch ist die Anwendung von MALDI-TOF MS beschränkt auf kurze Oligonukleotide (~ 25 Nukleotiden (nt)) aufgrund der anschließenden Fragmentierung Adduktbildung und niedrige Ionisationseffizienz 1,2. Im Gegensatz dazu ist ESI längere Oligonukleotide anwendbar (> 100 nt), aber viele Ladungszustände von mehrfach geladenen Ionen ([M-nH] n-) von Biomakromolekülen gleichzeitig hergestellt und somit die Masse des Analyten die obere überschreiten Grenze des m / z – Bereich des Spektrometers. Dies erfordert die Interpretation der gewundenen Spektren, dh Umwandlung eines Ladungszustand Serie in die entsprechende Masseüber Entfaltungs.

Im Fall der Massenmessung eines kleinen Moleküls, der Spitze der monoisotopischen Massen, das heißt die Masse des Moleküls nur die häufigsten Isotops jedes Element enthält , ist das häufigste und beobachtet natürlich 3. Wenn das Molekulargewicht zunimmt, wird durch Grundrauschen 3-5 verdeckt die Isotopenverteilung verschiebt sich zu höheren m / z und dem monoisotopischen peak. Sobald die monoisotopischen Peaks nicht mehr nachweisbar für Massen größer als 10 kDa 3, wobei das mittlere Molekularmasse wird für die Messung verwendet , anstatt die monoisotopische Masse 5. In solchen Fällen, in denen das Isotopenverteilung jeder der einzelnen Peaks von 1 Da getrennt ist , kann nur beobachtet werden , wenn eine hohe Auflösung Massenanalysator wie einem TOF, einen Fourier – Analysator Kingdon trap 6 modifizierten Transformierte oder eine Fouriertransformation-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer Analysator für die Analyse verwendet. Jedoch ist das häufigste peak sanchmal nicht mit der mittleren Molekularmasse 5. Diese Probleme können zu Schwierigkeiten führen zur genauen Bestimmung von Analyten.

Aufgrund der Veränderung der natürlichen Häufigkeit von stabilen Isotopen und die Schwierigkeiten bei der die mittlere Molekularmasse zu bestimmen, die Messung der monoisotopisch Masse ist ideal für die Massen Charakterisierung von Biomolekülen 3,4. In der Praxis , ob ein monoisotop Peak beobachtet werden kann oder nicht, kann die monoisotopische Masse durch einen Vergleich des Musters der beobachteten Isotopenverteilung auf die theoretische man von einem Modell Analyten 4,7-10 berechnet abgeschätzt werden. Der Anpassungsalgorithmus 8 wird nun in proprietäre Software integriert.

Im Zusammenhang mit ESI-MS, Dissoziation eines DNA – Duplexes, Reinigung und Entsalzung werden zur direkten Messung erforderlich 2,10-14 den Ausfall Ionisation aufgrund Ionensuppression und Adduktbildung zu vermeiden. Diese Verfahren sind troublesome jedoch vollautomatische Analysesysteme wurden 15-20 kommerziell denen Polymerase – Kettenreaktion (PCR), Probenvorbereitung und ESI-MS zum Nachweis von Pathogenen entwickelt. Ein weiterer Ansatz ist die Einführung der Flüssigchromatographie (LC) für die Trennung. LC stellt eine On-line – Trennung der Analyte von koexistierenden Substanzen und erfordert keine mühsame Probenvorbereitung vor der Ionisation 21,22. Die Abtrennung von Nucleinsäuren eine MS-kompatible mobile Phase ist schwieriger als für die meisten anderen Verbindungen, wie Arzneimittel, Peptide und Proteine ​​an die polyanionische Natur der Nukleotide zurückzuführen ist. Die erfolgreichsten Beispiele für LC / ESI-MS beinhalten die Verwendung von Ionenpaar-Umkehrphasen-LC. Eine mobile Phase von 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP) -Triethylamin (TEA) -methanol wurde ursprünglich von Apffel et al. Zur Trennung und kurze Oligonucleotide 23 zu detektieren. Die Anwendung der LC / ESI-MS-Genotypisierung für differentiation der Erregerspezies, single-nucleotide polymorphisms und short tandem repeats wurde mit einem Kapillar – Polymer-Monolith – Säule berichtet , die länger Oligonukleotide 1,21,24-33 trennen kann.

In Japan und den Vereinigten Staaten, schwere Lebensmittelvergiftung hat sich aufgrund einer falschen Identifizierung und unangemessenen Zubereitung von Kugelfisch aufgetreten ist , und dies trotz der Tatsache , dass die Verteilung und Herstellung von Kugelfisch streng durch die Lebensmittelsicherheit Gesetzgebung 34,35 gesteuert wird. Darüber hinaus ist eine vorsätzliche Tötung Extrakt unter Verwendung von Kugelfisch hat in Japan 36 auftreten. Daher Differenzierung von Arten Kugelfisch ist aus dem öffentlichen Gesundheit und forensischer Ermittlungs Standpunkte erforderlich. Darüber hinaus, da Takifugu rubripes weit teurer als andere Arten von Kugelfisch ist, wird eine Differenzierungsfähigkeit auch im Zusammenhang mit der Lebensmittelbetrug Untersuchungen notwendig.

Hier wird eine detaillierte Verfahren zur Bestimmung der monoisotopic Masse eines PCR-Produkts durch LC / ESI-MS unter Verwendung einer Umkehrphasen-Silica-Monolith-Säule und eines hochauflösenden Massenspektrometer beschrieben. Spezifisch hat der Ansatz wurde Differenzierung von toxischen Kugelfisch – Spezies auf der Verwendung der PCR – Restriktionsfragmentlängen – Polymorphismus (RFLP) -Verfahren 37, basierend zuzulassen entwickelt , die das erste Beispiel ist MS für Arten Differenzierung von Tieren.

Protocol

1. DNA-Extraktion Hinweis: Verwenden Sie einen separaten Raum für die DNA-Extraktion und Post-PCR-Untersuchungen wie Gelelektrophorese und LC / ESI-MS. Hinzufügen Ethanol-Waschpuffer 1 (mit Guanidin-Hydrochlorid) und Waschpuffer 2 (nicht Guanidinhydrochlorid enthält) nach der DNA Extraction Kit Protokoll. Fischproben wurden aus Fischgroßhändler und Einzelhandelsmärkte in Japan erhalten. Setzen Sie 30-50 mg Fischgewebe in einem 0,5 ml oder 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Squash das Gewebe mit einem Mikro-Spatel (mit Ausnahme der Finne und Haut). Hinweis: Im Fall der Finne, mit einem 0,5-ml-Röhrchen zum Einweichen. In 180 & mgr; l des Lysepuffers und 40 ul Proteinase K und Wirbel kurz. bei 56 ° C inkubieren für 2 Stunden auf einem Blockheizung oder über Nacht. Mix von kurz alle 15 Minuten während der Inkubation verwirbelt. Hinweis: Vollständige Lyse nicht notwendig ist. Zentrifuge für 5 min bei 13.000 x g. Nach Zentrifugation, wenn eine kleine amount von Öl an der Oberfläche in dem Fall einer Fettprobe wie Leber vorhanden ist, verwerfen. Überstand in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. In 200 ul des chaotropen Puffer, der Guanidinhydrochlorid und mischen durch Vortexen. In 200 ul Ethanol (99,5%) und Mischung wieder durch Vortexen. Übertragen der Mischung in die Spin-Säule in ein Sammelröhrchen ml 2 platziert. Zentrifuge für 1 min bei 13.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch. Achtung: Fügen Sie keine Bleichmittel auf den Abfall, da Guanidin hochreaktive Verbindungen mit Bleichmittel bilden können. Hinzufügen 500 ul Waschpuffer 1 (mit Guanidin-Hydrochlorid) und zentrifugieren für 1 min bei 13.000 x g. Entsorgen Sie die Strömung durch und das Sammelrohr. Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen mit dem Kit zur Verfügung gestellt. Hinzufügen, 500 & mgr; l des Waschpuffers 2 und Zentrifuge für 3 Minuten bei 20.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr. Übertragen Sie die Spin-Säule in ein neues1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Jeweils 200 ul des Elutionspuffers in die Mitte der Spinsäule Membran. Nach 1 min zentrifugieren für 1 min bei 6.000 x g. Pipette 50 ul des Eluats auf einem wegwerfbaren UV Küvette und das UV-Spektrum des Eluats bei 220-300 nm und die Extinktion bei 260 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers. Überprüfen, das UV-Spektrum von DNA mit dem Peak bei 260 nm. die ungefähre DNA-Konzentration Berechnen Sie die einfache Gleichung "DNA-Konzentration (ng / ul) = Absorption bei 260 nm x 50" mit. Anmerkung: Typische DNA – Konzentration aus den Rippen der Kugelfisch extrahiert beträgt 63 ± 30 ng / & mgr; l (n = 20). Wenn die DNA-Konzentration höher ist als 10 ng / & mgr; l, verdünnt die DNA-Proben mit Tris-EDTA (TE) -Puffer (pH 8) mit 5 ng / & mgr; l. Lagern Sie die Probe bei -20 ° C oder fahren Sie mit der PCR-Amplifikation (Abschnitt 2). 2. PCR Richten Sie 25 ul PCR für jeden Extrhandelten DNA – Probe, Positivkontrolle (0,2 uM synthetisierte Oligonucleotid mit der Zielsequenz in TE – Puffer , pH 8,0) gemäß Tabellen 1 und 2 auf eine saubere Bank Kontamination zu vermeiden und die negative Kontrolle (ultragereinigte Wasser anstelle von DNA – Probe) auf Eis. Hinweis: Für die einfache Bedienung, stellen ausreichende Menge an Cocktail alle Reagenzien ohne Template-DNA enthält, und verzichten sie. Verwenden DNA-Polymerase mit Korrekturleseaktivität Zugabe von 3 'A-Überhang an dem PCR-Produkt zu vermeiden. Durchführung der PCR – Amplifikation an einem Thermozykler den Zyklus – Programm in Tabelle 3 gezeigt. 3. Die enzymatische Verdauung Fügen Sie 2 ul der Lösung , enthaltend 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl 2, 10 mM Dithiothreitol und 500 mM NaCl zu der PCR – Lösung. 1 ul jedes Restriktionsenzym (Dra I und Msp I) und vorsichtig mischen. bei 37 ° C für 30 min inkubieren auf der thermal Cycler. Inkubieren Sie für 5 min bei 72 ° C die restliche DNA-Polymerase zu aktivieren, die das klebrige Ende von Msp I. erzeugt füllt Optional: Analysieren jeweils 2,5 & mgr; l der Reaktionslösung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese ein Vernetzungsverhältnis (% C, Prozentsatz der Bisacrylamid) von 3,33 (wt%) und eine Polyacrylamidgel-Konzentration (% T) von 15 unter Verwendung von (% w / v) 38. Stain das Gel die fluoreszierenden DNA-Farbstoff verwendet und beobachten Doppelstrang-DNA auf einem blauen Licht Transilluminator mit einem Bernstein-Bildschirm. Filtern der Reaktionslösung mit einem 0,2-0,5 & mgr; m Zentrifugalfilter Vorrichtung Verstopfen zu verhindern, die die analytische Säule beschädigen würde. Das Filtrat zu einem konischen Polypropylen-Fläschchen und bei -20 ° C bis zur Analyse. 4. LC / ESI-MS-Analyse Wiegen 67,2 g (ca. 42 ml) von HFIP und 1,52 g (ca. 2,0 ml) von TEA in einer 1 L – Flasche. In 955 ml Wasser ultragereinigte (LC / MS grade) und unter Rühren mit einem Magnetrührer, bis die Reagenzien vollständig gelöst sind. Nehmen Sie einen aliquoten Teil der Lösung und den pH-Wert (zwischen 7,85 und 7,95; idealerweise pH = 7,9) unter Verwendung eines pH-Meter. Hinweis: Die Menge dieses Gemisches in die Flasche nicht wieder Verunreinigung durch Metallionen zu vermeiden. Wenn der pH-Wert nicht 7,9 ist, fügen Sie eine kleine Menge von entweder HFIP oder TEA den pH-Wert einzustellen und den pH-Wert wieder messen. Schließen Sie die Flasche A des Flüssigkeitschromatographen mit Abkühlung der Flasche Linie eine direkte Kühlung tragbaren Kühlschrank mit (für den Haushalt) der Verdampfung zu verhindern. Schließen Sie eine weitere Flasche mit Methanol gefüllt B. der Leitung Schließen Sie die Vorsäule und der analytischen Säule (2,0 x 50 mm, Mesoporengröße = 30 nm) mit dem Flüssigkeitschromatographen. Starten Sie den anfänglichen mobilen Phase (95% A und 5% B) fließt, um die Spalten zu äquilibrieren. Bereiten 0,5 mg / ml Natrium trifluoracetat (pH 3,5) als Kalibriermittel 39. Man wiegt 50 mg (ca. 34 & mgr; l) Trifluoressigsäure acID in einem Becher. In 30 ml Wasser ultragereinigte und titriert auf pH 3,5 mit 10 mM Natriumhydroxid mit Hilfe eines pH-Meter. Füllen Sie bis zu 50 ml mit ultragereinigte Wasser. In 50 ml Acetonitril (LC / MS-Klasse) und mischen. Nehmen Sie einen Teil der Arbeitslösung und lagern Sie es bei Raumtemperatur. Lagern Sie den Rest der Lösung bei 4 ° C. Reduzieren Sie den Stickstoffdruck der C-Falle wie folgt. Hinweis: Bei neueren Fourier-Massenspektrometer-Transformation, die für intakte Proteinanalyse geeignet sind, haben Steuersoftware Druck zu steuern. Entfernen Sie die linke obere Abdeckung des Massenspektrometers. Die C-Trap Ventil ist an der Ecke von links im Vordergrund. Überprüfen Hochvakuumdruckwert im Instrumentenstatusfenster der Steuerungssoftware. Anmerkung: Der Wert in der Regel ist, 3 x 10 -8 bar. Ziehen Sie den Knopf, um den Knopf gegen den Uhrzeigersinn zu entriegeln und drehen sich sehr langsam die hohe Vakuumpresse zu reduzierenure bis 1/3 ( in der Regel 1 x 10 -8 bar). Der angezeigte Druck sollte nach und nach in einer verzögerten Art und Weise verändern. Ignorieren Sie die Warnmeldung über niedrigem Druck. Drücken Sie den Knopf zu sperren. Stellen Sie die obere Abdeckung für die Sicherheit. Kalibrieren des Massenspektrometers Natriumtrifluoracetat 39. Hinweis: Tägliche Massenkalibrierung kann durch dieses Protokoll ersetzt werden jedoch die empfohlene Kalibrierung vom Hersteller vorgeschlagen sollte vor dieser Kalibrierung abgeschlossen sind. Stellen Sie Scan-Parameter und beheizte ESI-Quelle Parameter in der Instrumentensteuerkasten der Tuning-Software wie folgt: Scan-Typ voll MS; Scan – Bereich m / z 500-4000; Fragmentierung (in-Source – Kollision induzierte Dissoziation (CID) Spannung 60 eV; Polarität negativ, automatische Verstärkungsregelung (AGC) Ziel 1 x 10 6, maximal Inject Zeit 50 ms; Mantelgasflussrate 5; aux Gasflussrate 0; Spülgases Strömungsgeschwindigkeit 0; besprühen Spannung 3 kV; Kapillare Temperatur 320 ° C; S-Objektiv Radiofrequenz (RF) Ebene 100; Heizungstemperatur 30 ° C. Geben Sie die Liste der negativen Ionen überwacht werden als m / z 792,85908, 1064,80870, 1336,75832, 1608,70794, 1880,65755, 2152,60717, 2424,55679, 2696,50640, 2968,45602, 3376,38045. Bewegen der erwärmten ESI Sonde näher an der Grenzfläche des Massenspektrometers (Position B). Schließen Sie die Sonde und eine Spritze mit einem Rohr. die Kalibriermittel konstant bei einer Flussrate von 10 ul / min unter Verwendung der eingebetteten Spritzenpumpe infundieren. Prüfen Sie nur die 6 geringere Masse Ionen (m / z 792,85908-2.152,60717) in der angepassten Kalibrierungstabelle. Fahren Sie mit der Kalibrierung nach der Intensität der Signale stabilisiert werden. Nach der Kalibrierung prüfen nur die sechs höheren Massenionen (m / z 1880,65755 bis 3376,38045) und mit der Kalibrierung fortzufahren. Vermeiden Sie alle Ionen die Kalibrierung mit auf einmal Ausfall zu vermeiden. Bewegen Sie die Sonde mit dem? Fallte Position für eine Strömungsgeschwindigkeit von 0,4 ml / min (Position D) und mit einem inerten Metallrohr mit dem Flüssigkeitschromatographen verbinden. Stellen Sie die beheizten ESI-Quelle Parameter in der Instrumentensteuerkasten der Tuning-Software wie folgt: Mantelgasflussrate 50; aux Gasflussrate 15; fegen Gasflussrate 1; besprühen Spannung 2,5 kV; Kapillar-Temperatur 350 ° C; S-Objektiv HF-Pegel 100; Heizertemperatur 350 ° C. Stellen Sie Erfassungsparameter des Massenspektrometers im instrumentalen Fenster Setup wie folgt: Verfahrensdauer 8 min; umleiten Ventil, 3.5-6 min Massenspektrometer, 0-3,5 und 6-8 min zu verschwenden; Laufzeit 3,5 bis 6 min; Polarität negativ; in Quelle CID Spannung 15,0 eV; microscans 3; Nennauflösung Leistung (bei ​​m / z 200) 140000; AGC Ziel 1 x 10 & sup6; maximale Ionenzeit 50 ms; Anzahl der Abtastungen 1; Scan – Bereich m / z 700-3,500; Spektrum-Datentyp-Profil. Stellen Sie die Parameter des Flüssigkeitschromatographen wie folgt: Säule Ofentemperatur 20 ° C; sample Tablett Temperatur 10 ° C; Gradient Programm 0-0,5 min 5% B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5-5 min 40-98% B, 5-6 min 98% B, 6- 6.05 min 98-5% B, 6,05 bis 8 min 5% B; Fließgeschwindigkeit 0,4 ml / min. Purge Blasen durch die Böden der Fläschchen klopfen. Stellen Sie Probenfläschchen auf dem Probenrack und injizieren 1,0 ul einer Probe, die die Autosampler-Analyse zu starten. Öffnen Sie Rohdaten-Dateien mit der Browser-Software und bestätigen Sie, dass alle Akquisitionen erfolgreich abgeschlossen sind, einschließlich der positiven und negativen Kontrollen. Anmerkung: In der Regel werden zwei oder drei Peaks würden im Gesamtionenstrom-Chromatogramm bei einer Retentionszeit von 4-5,5 min beobachtet werden, wenn Kugelfisch DNA erfolgreich amplifiziert und verdaut. 5. Dekonvolution und Interpretation Starten Sie die Entfaltungs Software. Wählen Sie Experiment Typ "auto-Extrakt (isotopisch aufgelöst)". Bearbeiten einer Methode unter Verwendung der folgenden Parameter: Ausgangsmasse M; S / N threshold 3, relative Häufigkeit Schwelle 0; negative Ladung ja; Ionenstrom – Chromatogramm (XIC) ja extrahiert berechnen; m / z – Bereich 700-3,500; Ladungsträger H +; Mindestzahl der erfassten Ladung 3; Isotopenverhältnis-Nukleotid; Fit-Faktor 80%; Rest Schwelle 0%; betrachten Überschneidungen ja; aufladen Bereich 3-50; Mindestintensität 1; erwartete Intensitätsfehler 3. Speichern Sie als eine neue Methode und wählen Sie es. Wählen Sie das Verzeichnis, in dem die Rohdaten-Dateien vorhanden sind. Wählen Sie die Rohdatendateien werden analysiert und klicken Sie auf "Add to Queue 'Button. Klicken Sie auf "Ausführen" Button "Run Queue" Tab Entfaltungs zu starten. Nachdem der Warteschlange abgeschlossen ist, eine Zeile auswählen und 'Open Ergebnis' in der oberen Beschriftung klicken, um die Ergebnisse von Entfaltungs erhalten. Interpretieren der Ergebnisse der monoisotopischen Massen aus den Peaks bei einer Retentionszeit abgeleitet von 4-5,5 min unter Verwendung von Tabelle 4.

Representative Results

Drei im Handel erhältlichen Säulen wurden für die Trennung von langen Oligonukleotiden mit Strömungsgeschwindigkeiten von 100-400 & mgr; l / min bewertet. Ein weitporigem Octadecyl Kohlenstoffkette (C 18) -gebundene partikulären Silica – Säule (a), ein im Handel erhältliches Poly (Styrol-Divinylbenzol) (PS-DVB) Monolith – Säule (b) und ein 18 C -gebundene Silica – Monolith – Säule ( c) verglichen wurden (Abbildung 1). Drei Paare von DNA – Duplexen (26, 37 und 53 bp) wurden alle Säulen getrennt verwendet, und die C 18 -gebundene Silica – Monolith – Säule wurde in nachfolgenden Studien verwendet. Repräsentative Ergebnisse für die Analyse einer DNA – Probe aus dem Muskel von T. extrahierte rubripes ist in Fig . 2 Isotopisch aufgelöste Peaks gezeigt wird , wie in 2a gezeigt ist , um die monoisotopische Masse erfolgreich Berechnung erforderlich sind. Die theoretische und Messfiguriert monoisotopisch Masse von T. rubripes sind in 2b gezeigt. Weil der Verdau mit den Endonukleasen unmittelbar nach der PCR-Amplifikation ohne Reinigung durchgeführt wird, das 3'-klebriges Ende durch die Endonuklease Msp I erzeugt wird, mit der verbleibenden DNA-Polymerase aufgefüllt. Nach der Analyse von Amplicons von den synthetischen DNA – Matrizen abgeleitet sind , Distanzmassengenauigkeit von -2,48 bis 2,40 ppm (0,62 ± 0,74 ppm im Durchschnitt, n = 280). So wurde zum Differenzieren Spezies (Tabelle 4) eine Massentoleranz von 3 ppm verwendet. Mit Hilfe der Tabelle alle der Kugelfisch Proben erhalten von den Märkten und Geschäften wurden als spezifische Arten richtig unterschieden 37. Gemäß der periodischen Analyse der aus dem synthetischen DNA – Matrize von T. erhaltenen Probe chrysops alle monoisotopisch Massen der Analyten wurden erfolgreich bei le innerhalb von ± 3 ppm bestimmtast 180 Stunden ohne Massenkalibrierung (Abbildung 3). Dies bedeutet, dass Massenkalibrierung würde auf einer wöchentlichen Basis erforderlich. Figur 1: Gesamtionenstrom – Chromatogramm des PCR-RFLP Produkt aus dem synthetisierten DNA – Template , abgeleitet von T. pardalis unter Verwendung eines C 18 -gebundene partikuläre Silicasäule (a, 3 x 250 mm, Partikelgröße 3 & mgr; m), ein Poly (styrol-divinylbenzol) (PS-DVB) Monolithsäule (b, 1,0 × 250 mm) und eine C 18 -gebundene Monolith Silica – Säule (c, vorliegende Verfahren) Bedingungen für die (a):. Fließgeschwindigkeit 0,2 ml / min; Verhältnis von Methanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-20 min 25% -40%, 20-35 min 40% -98%, 35-50 min 98%, 50- 51 min 98% -5%, 51-65 min 5%. Bedingungen für die (b):Fließgeschwindigkeit 0,1 ml / min; Verhältnis von Methanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-35 min 25% -40%, 35-40 min 40% -98%, 40-55 min 98%, 55- 56 min 98% -5%, 56-70 min 5%. Die Temperatur für beide Säulen betrug 20 ° C. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse für rohe Muskel von T. Analyse rubripes. (a) Typische Gesamtionenstrom Chromatogramme und Massenspektrum. (B) Theoretische und gemessen monoisotopisch Massen der PCR-RFLP Produkte aus der synthetisierten DNA – Vorlage von T. abgeleitet rubripes. Bitte klicken Sie hier um ein großes zu sehenr Version dieser Figur. Fig . 3: Stabilitätstest Verdaute Amplikons von der synthetischen DNA von T. abgeleiteten chrysops wurden alle 10 Stunden analysiert. Massenkalibrierung während des Tests nicht durchgeführt wurde. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Name Sequenz lago86F 5'-3'-CCATGTGGAATGAAAACACC taki114F 5'-3'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA fugu86-114R 5'-3'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Tabelle 1: PCR – Primer. PCR-Reagens Volume verwendet Die Endkonzentration Wasser ultragereinigte 15.75 ul Waschmittel frei 5x Puffer 5,0 ul 1x dNTP-Mix (10 mM jeweils) 0,5 ul 0,2 mM Primer-Mix (10 & mgr; M jeweils von lago86F, taki114F und fugu86-114R in TE-Puffer pH 8.0) 1,0 ul 0,4 uM jeweils DNA-Polymerase (2,5 Einheiten / ul) 0,25 ul 0,1 Einheiten / ul Template-DNA in TE-Puffer pH 8.0 (5,0-10 ng / pl für extrahierten Probe, 0,2 uM für synthetische DNA als positive Kontrolle) 2,5 ul 0,5-1,0 ng / für extrahierten DNA und 20 nM für synthetische DNA & mgr; l Insgesamt wurden 25 & mgr; l Tabelle 2: Komponenten einer 25 & mgr; l Maßstab PCR. Zyklus Bedingung Funktion 1 2 min bei 95 ° C anfängliche Denaturierung 2 30 s bei 95 ° C Denaturierung 3 30 s bei 56 ° C Glühen 4 30 s bei 72 ° C Verlängerung 5 Wiederholen Sie 2-4 (total 30 Zyklen) 6 7 min bei 72 ° C Finale Elongation 7 Halten bei 12 ° C bis zur Entfernung der Probe Tabelle 3: PCR – Programm. Peak-Zahl bei einer Retentionszeit von 4,0 bis 5,5 min Monoisotopische Masse des dritten Peaks in den Bereich (Da) Monoisotopisch Masse des zweiten Peak im Bereich (Da) Kugelfisch-Spezies Kleinere Strang Größere Strang Kleinere Strang Größere Strang 2 → → 15.890,707 bis 15.890,803 16.177,531 bis 16.177,629 L. inermis 15.921,702 bis 15.921,797 16.146,537 bis 16.146,634 L. gloveri 15.930,713 bis 15.930,809 16.137,525 bis 16.137,622 L. lunaris 15.937,697 bis 15.937,792 16.131,537 bis 16.131,634 L. wheeleri 24.173,034 bis 24.173,179 24.566,905 bis 24.567,053 T. chrysops 3 16.295,706 bis 16.295,804 16.467,610 bis 16.467,709 11.341,851 bis 11.341,919 11.466,875 bis 11.466,944 T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus 11.654,908 bis 11.654,978 11.770,920 bis 11.770,991 T. niphobles 16.296,701 bis 16.296,799 16.468,605 bis 16.468,704 → → T. rubripes 16.311,701 bis 16.311,799 16.452,610 bis 16.452,709 → → T. poecilonotus T. exascurus 16.320,713 bis 16.320,811 16.443,599 bis 16.443,697 → → T. porphyreus T. obscurus 16.599,751 bis 16.599,851 16.780,667 bis 16.780,767 → → T. vermicularis Tabelle 4: Differenzierung von Kugelfisch aus monoisotopisch Massen abgeleitet von LC / ESI-MS. Tabelle 5: amplifizierte DNA – Sequenz (a) Die Sequenz ist identisch.die der anderen Spezies Kugelfisch , wie in Tabelle 4 beschrieben. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.

Discussion

DNA, einem kommerziellen Kit zur Extraktion von DNA aus Blut und Gewebe zu extrahieren, wird in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers mit geringfügigen Modifikation (Menge der Proteinase K und Zentrifugation der Lyse-Lösung) verwendet. Es kann jedoch jede Extraktions-Kits verwendet werden, solange die zelluläre DNA mit geeigneten Rückgewinnung und Reinheit für die PCR gewonnen werden kann. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung von Muskel getestet, Flosse, Leber, Eierstock-, und die Haut 37. Fin ist besonders geeignet wegen der großen Oberfläche, die mit Proteinase K. frisch, tiefgefroren, getrocknet, gekocht und gebacken Kugelfisch Proben wurden erfolgreich schnelle Lyse ermöglicht 37 getestet.

Die PCR – Primer – Set (Tabelle 1) für Kugelfisch entwickelt und verstärkt das mitochondriale ribosomale 16S – RNA – Gen von Kugelfisch. Die Ziel – DNA zu amplifizieren , ist 114-115 bp (genus Takifugu) und 86 bp (genus Lagocephalus) (Tabelle 5). Zur Erleichterung der Verfahren development, synthetisierte Oligonukleotide, die Zielsequenzen wurden für die Referenz anstelle des Sammelns authentische Kugelfisch Proben verwendet. Die Primer-Set kann durch einen anderen Primer in Reaktion auf den Zweck eingestellt ersetzt werden, jedoch sollte endgültige DNA-Länge nach dem enzymatischen Abbau weniger als 100 nt in Bezug auf die Qualität des Massenspektrums die für eine erfolgreiche Entfaltungs beibehalten wird. Zusätzlich sollte Stickstoffdruck in der C-Falle reduziert werden, wenn das Ziel-Oligonukleotid mehr als etwa 75 nt und die Qualität des Massenspektrums ist unzureichend für eine erfolgreiche Dekonvolution. Solche Beschränkungen können durch die jüngsten Entwicklungen in der Geräte-Software, da sonst das Ventil für die C-trap innerhalb des Chassis, wie in dem Protokoll beschrieben eingestellt werden muß gesteuert werden. Wie für die Probenvorbereitung, die Verwendung von Detergens-freien Reagenzien ist kritisch für die nachfolgende LC in Bezug auf die entsprechenden Peakform, eine ausreichende Spitzenintensität und stabile Haltezeit 31.

<p class = "jove_content"> Ein PS-DVB – Kapillar – Monolith – Säule 21,24-33, eine C 18 Umkehrphasen – partikulären Silica – Säule 23,40,41 und eine hydrophobe Wechselwirkung – Chromatographie (HILIC) Spalte 42 sind für den LC eingesetzt / ESI-MS-Analyse von Oligonukleotiden. Unter ihnen ist die Spalte kapillaren Monolithen zu den anderen in Bezug auf die Trennleistung überlegen ist, jedoch ist die kapillare Monolith Säule in früheren Studien verwendet wurde, in-house und betrieben bei einer niedrigen Strömungsrate (2 & mgr; l / min), die Instrumentierung erfordert gemacht Mikro LC gewidmet ist. Um eine einfache Bedienung zu erleichtern, im Handel erhältlichen Säulen wurden für die Trennung von langen Oligonukleotiden bei höheren Strömungsraten ausgewertet (100-400 & mgr; l / min). Drei Paare von DNA – Duplexen (26, 37 und 53 bp) wurden die oben erwähnten Spalten getrennt unter Verwendung werden jedoch die Zykluszeiten des C 18 -gebundene partikuläre Silicasäule und der PS-DVB – Monolith – Säule wurden 65 und 70 min, jeweils , während die der C <sub> 18 -gebundene Silica – Monolith Kolonne betrug 8 min (Abbildung 1). Unter schnelle Analyse berücksichtigt wurde die C 18 -gebundene Silica – Monolith – Säule für unsere Zwecke trotz des begrenzten Abscheideleistung gewählt; jedoch die verbleibenden zwei Spalten verwendet werden kann, wenn verbesserte Trennung erforderlich ist. Theoretisch im Fall eines Monolithen Spalte gibt es keine Zwischenraumvolumen und die mobile Phase gezwungen wäre, die Poren der festen Phase zu durchströmen , während eine konsistente Weglänge aufrechterhalten wird , wodurch eine effiziente Trennung 27 ermöglicht. Solche Prozesse würden, insbesondere bei der Analyse von Biomakromolekülen, wie beispielsweise ein Oligonukleotid, wie die langsame Diffusion der großen Moleküle werden manifestiert. Eine der praktischen Vorteile einer Monolithsäule ist , dass der Gegendruck geringer ist als diejenige eines partikulären Silicasäule 27. Trotz der hohen Strömungsgeschwindigkeit (400 & mgr; l / min) und niedriger Säulentemperatur (20 ° C), maximale Gegendruck desSystem betrug 12,5 MPa 37. Dies ist die erste Demonstration der Vorteile eines -gebundene 18 C Silica – Monolith Spalte für die schnelle Analyse eines langen Oligonucleotids. Aufgrund der hohen Strömungsgeschwindigkeit, ein dediziertes Gerät für die Mikro LC und präzise Ausrichtung an der Schnittstelle nicht erforderlich. Stattdessen wird ein beheizbarer ESI Sonde erforderlich, um die DNA-Duplex und unterstützen Ionisierung von DNA zu dissoziieren, wie später beschrieben.

Ionenpaar-Chromatographie ist für die MS-kompatiblen Trennung von Oligonukleotiden verwendet. Stört jedoch ein Ionenpaar-Reagens im Allgemeinen mit dem ESI-Prozess und die Empfindlichkeit verringert ESI-MS. Daher wird HFIP häufig für die mobile Phase verwendet, um die Empfindlichkeit des Oligonukleotids zu verbessern. Jedoch verdampft HFIP (Siedepunkt 59 ° C) schnell an der Grenzfläche , bevor Methanol (Siedepunkt 65 ° C) , und deshalb dieser Verlust an Lösungsmittel erhöht pH und fördert die Dissoziation des Ionenpaar – Reagenz (dh TEA)von dem Oligonucleotid. Da das vorliegende Verfahren einen beheizten ESI-Sonde verwendet, die das Eluat mit heißem Stickstoffgas bei 350 ° C vernebelt, kann dieser Effekt überbetont werden. Anstelle von HFIP-TEA – Puffer, Erb und Oberacher empfohlen cyclohexyldimethylammonium acetat (CycHDMAA; pH 8,4) für die Genotypisierung Analyse aufgrund einer Reduktion in Adduktbildung mit Spurenmetallionen 33. Die Autoren schließen, dass CycHDMAA selbst die Bildung des Metall Addukts unterdrückt. Trotz der Literatur hat signifikante Adduktbildung nicht in dem vorliegenden Verfahren beobachtet. Darüber hinaus ist die bemerkenswert Vorteil der HFIP-TEA-Methanol – System , daß der Spitzenbereich mit dem erhaltenen HFIP-TEA-Methanol – System 17 Mal als die aus dem CycHDMAA-Acetonitril – System erhalten größer war , als ein 86 bp Amplikon von T. Analyse poecilonotus (Daten nicht gezeigt). Ein Nachteil der HFIP-TEA-Methanol-System ist jedoch die erhöhten Kosten relativ zum CycHDMAA-Acetonitril-System.

Die Berechnung der monoisotopisch Masse erfordert die Trennung von Isotopen-Peaks von mehrfach geladenen Ionen. Daher ist die Auflösung von entscheidender Bedeutung für die vorliegende Analyse. Obwohl erforderliche Auflösungsvermögen auf der Basenpaarlänge des Analyten, konventionellen TOF-Analysatoren abhängig ist, die eine Auflösungsvermögen von mehreren Zehntausend haben, können für die Analyse von kurzen Oligonukleotiden beschränkt werden.

Die theoretischen monoisotopischen Massen in Tabelle 4 gezeigt , wurden aus den entsprechenden Basiszusammensetzungen der Analyten berechnet. Alternativ Muddiman et al. Entwickelt eine Software – Anwendung der Grundzusammensetzung von der genauen Masse 43 zu berechnen. Ein ähnliches Programm wurde in das automatisierte ESI-MS – System integriert 16-18. Die Verwendung dieser Algorithmen kann die Robustheit des erfindungsgemßen Verfahrens verbessern, da eine gemessene monoisotopische Masse nicht immer zu einer einzigartigen Basiszusammensetzung o entsprechenFlügel auf die Massentoleranz von 3 ppm aus der unvermeidlichen Messfehler zur Folge hat. Leider konnten wir diese Software-Produkte für die vorliegende Studie nicht erhalten.

Die vorliegende monoisotopischen Massenbasis Spezies Bestimmung kann geeignet sein, nicht nur für die Differenzierung von Kugelfisch, sondern auch zum Nachweis von anderen DNA-Polymorphismen, da das vorliegende Verfahren auf die Analyse der Basenzusammensetzung basiert und beinhaltet nicht die entsprechende Verfahrensweise für Kugelfisch gestaltet. Wie für den Nachweis von DNA – Polymorphismus, der dedizierte ESI-MS – System voll automatisiert und einfach zu bedienen, die für diagnostische Zwecke , wie beispielsweise Nachweis von Pathogenen 15,17,18,20,30 geeignet sein können. Im Gegensatz dazu ist das vorliegende Verfahren möglich mit gemeinsamen Forschungsinstrumente und -geräte und deshalb geeignet für die Forschung Anwendungen. ESI-MS wurde bereits für die menschliche DNA – Polymorphismus wie Einzel – Nukleotid – Polymorphismus 13,28,32, short tandem Wiederholung 26 angewendet wordenUnd der mitochondrialen DNA analsis 16,19. Micro – RNA wurde auch über Kapillar LC / ESI-MS 44 analysiert. Diese veröffentlichten Anwendungen können auch durch das vorliegende Verfahren realisiert werden. Darüber hinaus kann dieses Verfahren zur Überwachung der Wechselwirkung zwischen Oligonukleotid und niedermolekulare Verbindungen, wie die Wechselwirkung von Antibiotika und ribosomale RNA 45 aufgrund der Tieftemperaturtrennung geeignet sein. In solchen Fällen, Oligonucleotide und niedermolekulare Verbindungen sollten gleichzeitig erfasst werden, was ein Vorteil der LC / ESI-MS verwendet wird.

Es gibt eine Einschränkung, dass die Instrumentierung zur Durchführung einer parallelen Analyse wie bei herkömmlichen Techniken, wie Sanger-Sequenzierung und Echtzeit-PCR nicht geeignet ist. Zusätzlich identifiziert das vorliegende Verfahren nur Basenzusammensetzung und jede Basensubstitution innerhalb desselben Moleküls kann nicht unterschieden werden. Allerdings haben die MS-basierte DNA-Analyse hier beschrieben ist, kann immer noch Verdienst in Ausdrucks Genauigkeit im Vergleich mit der DNA-bindenden Farbstoff-basierte Techniken wie Gelelektrophorese und Echtzeit-PCR.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).

Materials

DNeasy Blood & Tissue Kit (50) Qiagen 69504 DNA extraction kit
Proteinase K Qiagen 19131
Ethanol (99.5+ vol%) Wako 054-07225 For dilution of wash buffers
TE buffer (pH 8.0) Wako 310-90023 For dilution of DNA sample
PCR primer Fasmac NA Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier
Template DNA Eurofins Genomics NA Purified by HPLC by the supplier
Ultrapurified water NA NA Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation
Detergent Free 5X Phusion HF Buffer Thermo Fisher F-520L Use instead of the provided buffer of DNA polymerase
Pfu-X DNA polymerase Jena Bioscience PCR-207S
dNTP mix (20 mM each) Jena Bioscience NA Supplied with the DNA polymerase
10× Universal buffer M Takara Bio NA Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl
Dra I Thermo Fisher FD0224 Restriction enzyme
Msp I Thermo Fisher FD0544 Restriction enzyme
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) Fluka 42060-50ML Eluent additive for LC-MS grade.
Triethylamine (TEA) Fluka 65897-50ML Eluent additive for LC-MS grade.
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508 For preparation of calibrant.
Sodium hydroxide (1.0 M) Fluka 72082 Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid.
Acetonitrile Fluka 34967 For preparation of calibrant, LC/MS grade.
Methanol Kanto 25185-76 For mobile phase, LC/MS grade.
Water Thermo Fisher W6-1 For mobile phase, LC/MS grade.
Microcentrifuge tube (0.5 ml) Eppendorf 0030123301 PCR clean grade
Microcentrifuge tube (1.5 ml) Eppendorf 0030123328 PCR clean grade
UVette Eppendorf 0030106300 Disposable UV cuvette.
Gel Green Biotium 41004 Fluorescent DNA stain
Cosmospin filter G (0.2 μm) Nakalai Tesque 06549-44 Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable.
300-μl PP screw vial American Chromatography Supplies V0309P-1232
Preassembled screw cap and septa Finneran 5395-09R
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) Kyoto Monotech 2050H30ODS Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/)
Monobis C18 guard column Kyoto Monotech GCSET-ODS3210 Holder included.
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) Imtakt CW036 C18-bonded particulate silica column
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) Thermo Fisher 066640 Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column
Themo Mixer C Eppendorf 5382 000.023 For digestion of fish tissues.
Spectrophotometer Shimadzu UV-3150 Quantification of DNA concentration.
Thermal cycler Bio-Rad T100
Portable refrigerator Twinbird D-CUBE For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box.
Ultimate 3000 liquid chromatograph Thermo Fisher NA
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher NA Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer.
Protein deconvolution 3.0 Thermo Fisher NA Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide.
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Puffer Fish GenotypingToxic Puffer FishPCR-RFLPLiquid Chromatography/mass SpectrometryDNA ExtractionUV SpectrophotometryAnalytical ColumnReagent Contamination

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Miyaguchi, H. Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (115), e54402, doi:10.3791/54402 (2016).
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