שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה
Summary
שרשרת פולימראז משופר שיטת פולימורפיזם תגובת הגבלה שבר אורך עבור genotyping מיני נפוחיתיים ידי ספקטרומטריית נוזלי כרומטוגרפיה / מסה מתוארת. טור מונולית סיליקה הפוכה פאזיים מועסק להפרדת amplicons מתעכל. שיטה זו יכולה להבהיר את המוני monoisotopic של oligonucleotides, אשר הוא כלי שימושי לזיהוי רכב בסיס.
Abstract
גרסה משופרת של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) -restriction פולימורפיזם אורך קטע (RFLP) שיטה genotyping מינים נפוחיתיים רעילים ידי / כרומטוגרפיה נוזלית יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (LC / ESI-MS) מתואר. מיצוי DNA מתבצע באמצעות סיליקה קרום מבוססת ערכת חילוץ DNA. לאחר הגברת PCR באמצעות חיץ PCR חומר ניקוי ללא, אנזימי הגבלה מתווספים הפתרון ללא טיהור פתרון התגובה. טור הפוך פאזיים סיליקה מונולית ו התמרת ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה שיש מנתח מלכודת קינגדון שונה מועסקים להפרדה וזיהוי, בהתאמה. השלב הנייד, מורכב 400 מ"מ 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, 15 המ"מ triethylamine (pH 7.9), מתנול, מועבר בקצב זרימה של 0.4 mL / min. זמן המחזור לניתוח LC / ESI-MS הוא 8 דקות כולל איזון של הטור. תוכנת Deconvolution שיש o מודל הפצת איזוטופ.ו oligonucleotide משמש לחישוב מסת monoisotopic התואמים מתוך הספקטרום ההמוני. באשר לניתוח oligonucleotides (טווח 26-79 נוקלאוטידים), דיוק המונית היה 0.62 ± 0.74 ppm (n = 280) ודיוק מעולה ודיוק נגרמו עבור 180 שעות ללא שימוש בסטנדרט המוני המנעול.
Introduction
ספקטרומטריית מסה (MS) היא טכנולוגיה המקובלת לזיהוי מהיר ואמין של חומצות גרעין, / desorption לייזר בסיוע מטריקס יינון (MALDI) ו יינון electrospray (ESI) בשימוש עבור יינון 1,2. טכניקת MALDI בדרך כלל בשילוב עם זמן של טיסת מנתח (TOF); עם זאת, היישום של MALDI-TOF MS מוגבל oligonucleotides קצר (~ 25 נוקלאוטידים (NT)) בשל פיצול עוקב היווצרות adduct ו יינון נמוך היעיל 1,2. לעומת זאת, ESI ישימה oligonucleotides יותר (> 100 NT), אך מדינות תשלום רבות מרובה טעונות יונים ([M-NH] n-) מופקים בו זמנית Biomacromolecules, ולכן המסה של אנליטי יכולה לחרוג העליונה קצה טווח m / z של ספקטרומטר. זה מחייב את הפרשנות של הספקטרום המפותל, כלומר, הטרנספורמציה של סדרת מדינה לגבות לתוך המונית המקבילבאמצעות deconvolution.
במקרה של מדידת מסה של מולקולה קטנה, השיא של מסת monoisotopic, כלומר, המסה של המולקולה המכילה רק האיזוטופ הנפוץ ביותר של כל אלמנט הוא הנפוץ ביותר וצופה 3 טבעי. ככל שעולה משקל המולקולרי, משמרות חלוקת איזוטופי כדי גבוהה מ '/ z ופסגת monoisotopic הופכת מוסתרות על ידי רעש בסיס 3-5. ברגע שיא monoisotopic כבר לא ניתן לגילוי עבור המונים יותר מ -10 kDa 3, המסה המולקולרית הממוצע משמשת למדידה ולא מסת monoisotopic 5. במקרים כאלה, חלוקת איזוטופי שבו כל אחד הפסגות הפרט מופרד על ידי 1 Da ניתן לקיים רק כאשר מסת Analyzer ברזולוציה גבוהה כגון TOF, התמרת מנתח מלכודת קינגדון שונה 6, או התמרת תהודה הציקלוטרון יון מנתח משמש לניתוח. עם זאת, השיא הנפוץ ביותר הוא שלהראשון לפעמים לא עולה בקנה אחד עם המסה המולקולרית הממוצעת 5. בעיות אלה יכולים לגרום למצוקה עבור analytes לקביעה מדויקת.
בהתחשב וריאצית השפע הטבעי של איזוטופים יציבים הקשיים בקביעת המסה המולקולרית הממוצעת, מדידת מסת monoisotopic היא אידיאלית עבור אפיון המוני של ביומולקולות 3,4. בפועל, אם לשיא monoisotopic ניתן לצפות או לא, מסת monoisotopic יכולה להיות מוערכת על ידי השוואת הדפוס של חלוקת איזוטופי ציינה לזו התיאורטית מחושבת מתוך אנליטי מודל 4,7-10. האלגוריתם ההולם 8 מאוגדת החברה לתחום תוכנת קניינית.
בהקשר של ESI-MS, דיסוציאציה של דופלקס DNA, טיהור desalting נדרשים עבור מדידה ישירה להימנע כישלון יינון עקב היווצרות דיכוי יון adduct 2,10-14. נהלים אלה הם troublesome, לעומת זאת, מערכות אנליטיות אוטומטיות לחלוטין פותחו מסחריות מעורבות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), הכנת מדגם ESI-MS לצורך זיהוי של פתוגנים 15-20. גישה נוספת היא מציגה כרומטוגרפיה נוזלית (LC) להפרדה. LC מספק הפרדת on-line של analytes מחומרים המתקיימות זו בצד זו אינו דורש הכנת מדגם מייגעת לפני יינון 21,22. עם זאת, הפרדה של חומצות גרעין באמצעות שלב נייד MS-תואם הוא קשה יותר מאשר רוב תרכובות אחרות כגון תרופות, פפטידים וחלבונים בשל כך גם polyanionic של נוקלאוטידים. הדוגמאות המוצלחות ביותר של LC / ESI-MS כרוכות בשימוש-זוג יונים הפוכה שלב LC. שלב הנייד של 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -methanol בתחילה הוצע על ידי Apffel et al. להפרדת ואיתור oligonucleotides קצר 23. יישום של LC / ESI-MS genotyping עבור differentiation של מיני הפתוגן, פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד ו חוזר טנדם קצר דווח באמצעות טור הפולימר-מונולית נימים שיכולים להפריד עוד oligonucleotides 1,21,24-33.
ביפן ובארצות הברית, הרעלת מזון רצינית התרחשה עקב זיהוי שגוי והכנת הולם של נפוחיתיים, וזאת למרות העובדה כי החלוקה והכנת נפוחיתיים נשלטות בקפידה על ידי חקיקת בטיחות מזון 34,35. יתר על כן, רצח בכוונה תחילה באמצעות תמצית נפוחיתיים התרחש ביפן 36. לכן, בידול של מינים נפוחיתיים נדרש משני בריאות הציבור ועמדותיו חקירה משפטית. בנוסף, בגלל rubripes Takifugu הוא הרבה יותר יקר מאשר סוגים אחרים של נפוחיתיים, יכולת הבחנה גם יש צורך בהקשר של חקירות הונאה מזון.
כאן, שיטה מפורטת לקביעה מהמוני onoisotopic של מוצר ה- PCR על ידי LC / ESI-MS באמצעות טור סיליקה מונולית הפוכה-פאזה ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה מתואר. באופן ספציפי, הגישה פותחה על מנת לאפשר בידול של מינים נפוחיתיים רעילים המבוססים על השימוש של פולימורפיזם אורך קטע הגבלת PCR (RFLP) השיטה 37, המהווה את הדוגמא הראשונה לבידול מינים של בעלי חיים באמצעות MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לחלץ DNA, ערכה מסחרית לחילוץ דנ"א מדם והרקמות משמשת בהתאם לפרוטוקול של היצרן עם שינויים קלים (כמות proteinase K ו צנטריפוגה של הפתרון תמוגה). עם זאת, כל ערכת חילוץ יכולה לשמש עוד DNA הסלולר ניתן לחלץ עם התאוששות מתאימה וטוהר עבור PCR. שיטה זו נבדקה באמצעות שרירים, סנפיר, כבד, שחלה, ועור 37. Fin מתאים במיוחד בגלל שטח הפנים הגדול, המאפשר תמוגה מהירה עם proteinase ק טרי, קפוא, מיובש, מבושלים ודוגמאות נפוחיתיים אפויות נבדקו 37 בהצלחה.
סט פריימר PCR (לוח 1) מיועד נפוחיתיים ומגביר את גן RNA ריבוזומלי 16S המיטוכונדריה של נפוחיתיים. ה- DNA היעד כדי להגביר הוא 114-115 נ"ב (סוג Takifugu) ו -86 נ"ב (סוג Lagocephalus) (לוח 5). כדי להקל developme השיטה NT, oligonucleotides המסונתז שיש את רצפי היעד שמש עבור ההפניה במקום איסוף דגימות נפוחיתיים אותנטיים. סט פריימר יכול להיות מוחלף על ידי פריימר אחר להגדיר בתגובת לצורך, אולם אורך DNA סופי לאחר עיכול אנזימטי צריך להיות פחות מ 100 nt במונחים של שמירה על איכות ספקטרום המסות הנדרש לקיומו deconvolution המוצלח. בנוסף, לחץ חנקן מלכודת C צריך להיות מופחת כאשר oligonucleotide היעד ארוך יותר כ -75 NT ואת איכות הספקטרום ההמוני אינה מספיקה עבור פישוט מוצלח. ניתן לשלוט מגבלות אלו באמצעות ההתפתחויות האחרונות תוכנת המכשיר, אחרת השסתום עבור מלכודת C בתוך המארז חייב להיות מכוון כמתואר בסעיף בפרוטוקול. באשר הכנת מדגם, שימוש ריאגנטים אבקת כביסה ללא היא קריטי עבור LC עוקבת מבחינת צורת שיא מתאימה, עוצמת שיא מספיק זמן שמירה יציב 31.
<p cילדה = "jove_content"> טור נימי מונולית PS-DVB 21,24-33, טור סיליקה חלקיקי הפוכה פאזיים 18 C 23,40,41 ו כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופובי (HILIC) עמודה 42 שימשו עבור LC / ניתוח oligonucleotides ESI-MS. ביניהם, את טור מונולית הנימים עדיף על אחרים מבחינת יכולת הפרדה, לעומת זאת, בעמודת מונולית נימי שימוש במחקרים בעבר נעשתה בתוך הבית ומופעלת בקצב זרימה נמוך (2 μl / min), מחייב מכשור מוקדש LC מיקרו. כדי להקל על הפעלה קלה, עמודות-זמינות מסחרי הוערכו להפרדת oligonucleotides הארוך ברמות ספיקה גבוהה (100-400 μl / min). שלושה זוגות של דופלקסים DNA (26, 37 ו -53 נ"ב) הופרדו באמצעות העמודות הנ"ל, לעומת זאת, זמני המחזור של טור -bonded סיליקה חלקיקי 18 C וטור מונולית PS-DVB היו 65 ו -70 דקות, בהתאמה , ואילו זה של C <sub> 18 טור מונולית סיליקה -bonded היה 8 דקות (איור 1). אם אקח ניתוח מהיר בחשבון, מונולית סיליקה ג 18 -bonded העמודה נבחרה לענייננו למרות יכולת ההפרדה המוגבלת; עם זאת את שתי עמודות הנותרות יכולות להיות מועסקות כאשר הפרדת שיפור נדרשה. באופן תיאורטי, במקרה של טור מונולית, אין נפח ביניים ואת השלב הנייד ייאלץ לזרום דרך הנקבובית של השלב המוצק תוך שמירה על אורך תוואי עקבי, ובכך לאפשר הפרדה יעילה 27. תהליכים כאלה יבואו לידי ביטוי, במיוחד בניתוח Biomacromolecules כגון oligonucleotide, כמו דיפוזיה האיטי של מולקולות הגדולות. אחד היתרונות המעשיים של טור מונולית הוא שהלחץ בחזרה נמוכה מזו של טור סיליקה חלקיקי 27. למרות קצב הזרימה הגבוהה (400 μl / min) וטמפרטורת עמודה נמוכה (20 מעלות צלזיוס), לחץ חזרה מרבי שלמערכת הייתה 12.5 מגפ"ס 37. זוהי ההפגנה הראשונה של היתרון של טור מונולית סיליקה -bonded 18 C לניתוח מהיר של oligonucleotide ארוך. בשל קצב הזרימה גבוהה, מכשיר ייעודי עבור LC מיקרו תיאום מדויק על הממשק אינם נדרשים. במקום זאת, בדיקה ESI מחוממת נדרש לנתק את דופלקס DNA ולסייע יינון של DNA כמתואר בהמשך.יון-זוג כרומטוגרפיה הוא נפוץ להפרדה MS-התואמת של oligonucleotides. עם זאת, מגיב-זוג יונים מפריע בדרך כלל עם תהליך ESI וירידה ברגישות של ESI-MS. לכן, HFIP משמש לעתים קרובות עבור השלב הנייד כדי לשפר את הרגישות של oligonucleotide. עם זאת, HFIP (נקודת רתיחה 59 ° C) מאדה במהירות בממשק לפני מתנול (נקודת רתיחה 65 מעלות צלזיוס), ולכן, זה הפסד של ממס מגביר pH ומקדם דיסוציאציה של מגיב-זוג יונים (כלומר, TEA)מן oligonucleotide. בגלל השיטה הנהוגה כיום מעסיקה חללית ESI מחוממת, אשר nebulizes eluate עם גז חנקן חם ב 350 מעלות צלזיוס, אפקט זה עשוי להיות מעל-הדגיש. במקום חיץ HFIP-TEA, ארב ו Oberacher מומלץ אצטט cyclohexyldimethylammonium (CycHDMAA; 8.4 pH) לניתוח גנוטיפ בגלל צמצום היווצרות adduct עם יונים של מתכות קורט 33. המחברים הסיקו CycHDMAA עצמו מורחק ההיווצרות של adduct המתכת. למרות הספרות, היווצרות adduct משמעותית לא נצפתה בשיטת ההווה. בנוסף, היתרון לציין של מערכת HFIP-TEA-מתנול הוא כי אזור השיא שהושגו עם מערכת HFIP-TEA-מתנול היה 17 פעמים יותר מאשר זה המתקבל במערכת CycHDMAA-אצטוניטריל כאשר לאחר שניתח amplicon 86 נ"ב של T. poecilonotus (מידע לא מוצג). אחד החסרונות של מערכת HFIP-TEA-מתנול, לעומת זאת, הוא יחסית התייקרות למערכת CycHDMAA-אצטוניטריל.
חישוב מסת monoisotopic דורש הפרדת פסגות איזוטופי של יונים טעונים מתרבה. לכן, ההחלטה היא קריטית עבור הניתוח המובא. למרות כוח ברזולוציה הנדרש הוא תלוי באורך בסיס זוג אנליטי, מנתחי TOF קונבנציונליים, שבה יש כוח ברזולוציה של כמה עשרות אלף, עשויים להיות מוגבלים לניתוח oligonucleotides הקצר.
המוני monoisotopic התיאורטי שניתן לראות בטבלה 4 חושבו מתוך יצירות הבסיס המקבילות analytes. לחלופין, Muddiman et al. פתח יישום תוכנה לחישוב רכב הבסיס מן המסה המדויקת 43. תכנית דומה שולבה במערכת ESI-MS האוטומטית 16-18. השימוש באלגוריתמים אלה עשויים לשפר את חוסנו של השיטה הנוכחית בגלל מסת monoisotopic נמדדה לא תמיד מתאימה על o רכב בסיס ייחודיכנף אל הסובלנות ההמונית של 3 עמודים לדקה הנובעים טעות מדידה בלתי הנמנעת. למרבה הצער, לא יכולנו להשיג מוצרי תוכנה אלה למחקר הנוכחי.
קביעת מין monoisotopic הנוכחית מבוסס המוני עשויה להיות מתאימה לא רק את הבידול של נפוחיתיים אלא גם לצורך זיהוי של פולימורפיזם DNA האחר כי השיטה הנוכחית מבוססת על ניתוח רכב הבסיס ואינה כרוכים בהליכים שתוכננו במיוחד עבור נפוחיתיים. באשר זיהוי של פולימורפיזם DNA, מערכת ESI-MS הייעודי היא אוטומטית לחלוטין וקלה לתפעול, אשר עשוי להיות מתאים לשימוש אבחון כגון זיהוי של פתוגנים 15,17,18,20,30. לעומת זאת, השיטה הנהוגה כיום אינה ריאלית עם כלי מחקר משותפים ומכשירים, ולכן מתאימים לשימושי מחקר. ESI-MS יושם כבר פולימורפיזם DNA האנושי כגון 13,28,32 פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד, חזרה טנדם קצר 26DNA, המיטוכונדריה analsis 16,19. גם מיקרו RNA נותח באמצעות נימי LC / ESI-MS 44. יישומים שפורסמו אלה יכולים להתממש גם על ידי השיטה הנוכחית. בנוסף, שיטה זו עשויה להיות מתאימה ניטור האינטראקציה בין oligonucleotide ותרכובות נמוך משקל מולקולרי, כגון האינטראקציה של אנטיביוטיקה ו- RNA ריבוזומלי 45 בשל ההפרדה בטמפרטורה הנמוכה. במקרים כאלה, oligonucleotides ותרכובות נמוך משקל מולקולרי צריך להתגלות בו זמנית, דבר המהווה יתרון של שימוש LC / ESI-MS.
ישן מגבלה כי המכשור אינו מתאים לביצוע ניתוח מקביל כמו טכניקות קונבנציונליות כגון סנגרתי רצף בזמן אמת PCR. בנוסף, השיטה הנוכחית מזהה רכב בסיס בלבד וכל החלפת בסיס בתוך אותה המולקולה לא ניתן להבחין. עם זאת, בניתוח DNA המבוסס MS המתואר כאן ייתכן שעדיין יש כשרון בקדנציהים של דיוק בהשוואה DNA מחייב טכניקות מבוססות לצבוע כגון ג'ל אלקטרופורזה בזמן אמת PCR.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).
Materials
| DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Qiagen | 69504 | DNA extraction kit |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Ethanol (99.5+ vol%) | Wako | 054-07225 | For dilution of wash buffers |
| TE buffer (pH 8.0) | Wako | 310-90023 | For dilution of DNA sample |
| PCR primer | Fasmac | NA | Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier |
| Template DNA | Eurofins Genomics | NA | Purified by HPLC by the supplier |
| Ultrapurified water | NA | NA | Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation |
| Detergent Free 5X Phusion HF Buffer | Thermo Fisher | F-520L | Use instead of the provided buffer of DNA polymerase |
| Pfu-X DNA polymerase | Jena Bioscience | PCR-207S | |
| dNTP mix (20 mM each) | Jena Bioscience | NA | Supplied with the DNA polymerase |
| 10× Universal buffer M | Takara Bio | NA | Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl |
| Dra I | Thermo Fisher | FD0224 | Restriction enzyme |
| Msp I | Thermo Fisher | FD0544 | Restriction enzyme |
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Fluka | 42060-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Triethylamine (TEA) | Fluka | 65897-50ML | Eluent additive for LC-MS grade. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | For preparation of calibrant. |
| Sodium hydroxide (1.0 M) | Fluka | 72082 | Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid. |
| Acetonitrile | Fluka | 34967 | For preparation of calibrant, LC/MS grade. |
| Methanol | Kanto | 25185-76 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Water | Thermo Fisher | W6-1 | For mobile phase, LC/MS grade. |
| Microcentrifuge tube (0.5 ml) | Eppendorf | 0030123301 | PCR clean grade |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | Eppendorf | 0030123328 | PCR clean grade |
| UVette | Eppendorf | 0030106300 | Disposable UV cuvette. |
| Gel Green | Biotium | 41004 | Fluorescent DNA stain |
| Cosmospin filter G (0.2 μm) | Nakalai Tesque | 06549-44 | Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable. |
| 300-μl PP screw vial | American Chromatography Supplies | V0309P-1232 | |
| Preassembled screw cap and septa | Finneran | 5395-09R | |
| Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) | Kyoto Monotech | 2050H30ODS | Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/) |
| Monobis C18 guard column | Kyoto Monotech | GCSET-ODS3210 | Holder included. |
| Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) | Imtakt | CW036 | C18-bonded particulate silica column |
| ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) | Thermo Fisher | 066640 | Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column |
| Themo Mixer C | Eppendorf | 5382 000.023 | For digestion of fish tissues. |
| Spectrophotometer | Shimadzu | UV-3150 | Quantification of DNA concentration. |
| Thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Portable refrigerator | Twinbird | D-CUBE | For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box. |
| Ultimate 3000 liquid chromatograph | Thermo Fisher | NA | |
| Q Exactive mass spectrometer | Thermo Fisher | NA | Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer. |
| Protein deconvolution 3.0 | Thermo Fisher | NA | Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide. |
References
- Oberacher, H. On the use of different mass spectrometric techniques for characterization of sequence variability in genomic DNA. Anal. Bioanal. Chem. 391, 135-149 (2008).
- Banoub, J. H., Miller-Banoub, J., Jahouh, F., Joly, N., Martin, P., Banoub, J. H., Limbach, P. A. Chapter 1, Overview of recent developments in the mass spectrometry of nucleic acid and constituents. Mass spectrometry of nucleosides and nucleic acids. 1, 1-90 (2010).
- Yergey, J., Heller, D., Hansen, G., Cotter, R. J., Fenselau, C. Isotopic distributions in mass spectra of large molecules. Anal. Chem. 55, 353-356 (1983).
- Zubarev, R. A., Demirev, P. A. Isotope depletion of large biomolecules: Implications for molecular mass measurements. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 149-156 (1998).
- Null, A. P., Muddiman, D. C. Determination of a correction to improve mass measurement accuracy of isotopically unresolved polymerase chain reaction amplicons by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 1714-1722 (2003).
- Hu, Q., Noll, R. J., Li, H., Makarov, A., Hardman, M., Cooks, R. G. The Orbitrap: a new mass spectrometer. J Mass Spectrom. 40, 430-443 (2005).
- Senko, M. W., Beu, S. C., McLaffertycor, F. W. Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 6, 229-233 (1995).
- Horn, D. M., Zubarev, R. A., McLafferty, F. W. Automated reduction and interpretation of high resolution electrospray mass spectra of large molecules. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, 320-332 (2000).
- Frahm, J. L., Mason, C. J., Muddiman, D. C. Utility of accurate monoisotopic mass measurements to confidently identify lambda exonuclease generated single-stranded amplicons containing 7-deaza analogs by electrospray ionization FT-ICR mass spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 234, 79-87 (2004).
- Frahm, J. L., Muddiman, D. C. Nucleic Acid analysis by fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry at the beginning of the twenty-first century. Curr. Pharm. Des. 11, 2593-2613 (2005).
- Null, A. P., George, L. T., Muddiman, D. C. Evaluation of sample preparation techniques for mass measurements of PCR products using ESI-FT-ICR mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13, 338-344 (2002).
- Null, A. P., Benson, L. M., Muddiman, D. C. Enzymatic strategies for the characterization of nucleic acids by electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 2699-2706 (2003).
- Manduzio, H., Ezan, E., Fenaille, F. Evaluation of the LTQ-Orbitrap mass spectrometer for the analysis of polymerase chain reaction products. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 3501-3509 (2010).
- Manduzio, H., Martelet, A., Ezan, E., Fenaille, F. Comparison of approaches for purifying and desalting polymerase chain reaction products prior to electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Biochem. 398, 272-274 (2010).
- Hofstadler, S. A., et al. TIGER: the universal biosensor. Int. J. Mass Spectrom. 242, 23-41 (2005).
- Eduardoff, M., et al. Mass spectrometric base composition profiling: Implications for forensic mtDNA databasing. Forensic Sci. Int. Genet. 7, 587-592 (2013).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J. Clin. Microbiol. 51, 40-45 (2013).
- Legoff, J., et al. Broad-range PCR-electrospray ionization mass spectrometry for detection and typing of adenovirus and other opportunistic viruses in stem cell transplant patients. J. Clin. Microbiol. 51, 4186-4192 (2013).
- Kiesler, K. M., Coble, M. D., Hall, T. A., Vallone, P. M. Comparison of base composition analysis and Sanger sequencing of mitochondrial DNA for four U.S. population groups. Forensic Sci. Int. Genet. 8, 226-232 (2014).
- Bacconi, A., et al. Improved sensitivity for molecular detection of bacterial and Candida infections in blood. J. Clin. Microbiol. 52, 3164-3174 (2014).
- Huber, C. G., Oberacher, H. Analysis of nucleic acids by on-line liquid chromatography-mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 20, 310-343 (2001).
- Pourshahian, S., McCarthy, S. M., Bonilla, J. V., Srivatsa, G. S. Chapter 4, Analysis of oligonucleotides by liquid chromatography and mass spectrometry. Handbook of Analysis of Oligonucleotides and Related Products. , 137-166 (2011).
- Apffel, A., Chakel, J. A., Fischer, S., Lichtenwalter, K., Hancock, W. S. Analysis of Oligonucleotides by HPLC-Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 69, 1320-1325 (1997).
- Premstaller, A., Oberacher, H., Huber, C. G. High-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry of single- and double-stranded nucleic acids using monolithic capillary columns. Anal. Chem. 72, 4386-4393 (2000).
- Oberacher, H., Oefner, P. J., Parson, W., Huber, C. G. On-Line Liquid Chromatography Mass Spectrometry: A Useful Tool for the Detection of DNA Sequence Variation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 3828-3830 (2001).
- Oberacher, H., Parson, W., Muhlmann, R., Huber, C. G. Analysis of polymerase chain reaction products by on-line liquid chromatography-mass spectrometry for genotyping of polymorphic short tandem repeat loci. Anal. Chem. 73, 5109-5115 (2001).
- Oberacher, H., Huber, C. G. Capillary monoliths for the analysis of nucleic acids by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Trends Anal. Chem. 21, 166-174 (2002).
- Oberacher, H., et al. Re-sequencing of multiple single nucleotide polymorphisms by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 30, e67 (2002).
- Oberacher, H., Parson, W., Holzl, G., Oefner, P. J., Huber, C. G. Optimized suppression of adducts in polymerase chain reaction products for semi-quantitative SNP genotyping by liquid chromatography-mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 15, 1897-1906 (2004).
- Mayr, B. M., et al. Identification of bacteria by polymerase chain reaction followed by liquid chromatography-mass spectrometry. Anal. Chem. 77, 4563-4570 (2005).
- Oberacher, H., Niederstatter, H., Casetta, B., Parson, W. Some guidelines for the analysis of genomic DNA by PCR-LC-ESI-MS. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 124-129 (2006).
- Beer, B., et al. CYP2D6 genotyping by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 400, 2361-2370 (2011).
- Erb, R., Oberacher, H. Comparison of mobile-phase systems commonly applied in liquid chromatography-mass spectrometry of nucleic acids. Electrophoresis. 35, 1226-1235 (2014).
- Cohen, N. J., et al. Public health response to puffer fish (Tetrodotoxin) poisoning from mislabeled product. J. Food Prot. 72, 810-817 (2009).
- Cole, J. B., et al. Tetrodotoxin poisoning outbreak from imported dried puffer fish–Minneapolis, Minnesota 2014. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 63, 1222-1225 (2015).
- Ohno, Y., et al. The influence of tetrodotoxin on the toxic effects of aconitine in vivo. Tohoku J. Exp. Med. 167, 155-158 (1992).
- Miyaguchi, H., Yamamuro, T., Ohta, H., Nakahara, H., Suzuki, S. Genotyping of Toxic Pufferfish Based on Specific PCR-RFLP Products As Determined by Liquid Chromatography/Quadrupole-Orbitrap Hybrid Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem. 63, 9363-9371 (2015).
- Sambrook, J. F., Russell, D. W. . Neutral polyacrylamide gel electrophoresis. in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, 40-46 (2001).
- Moini, M., Jones, B. L., Rogers, R. M., Jiang, L. Sodium trifluoroacetate as a tune/calibration compound for positive- and negative-ion electrospray ionization mass spectrometry in the mass range of 100-4000 Da. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 9, 977-980 (1998).
- Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 17, 646-653 (2003).
- Chen, B., Bartlett, M. G. Evaluation of mobile phase composition for enhancing sensitivity of targeted quantification of oligonucleotides using ultra-high performance liquid chromatography and mass spectrometry: application to phosphorothioate deoxyribonucleic acid. J. Chromatogr. A. 1288, 73-81 (2013).
- Gong, L., McCullagh, J. S. Analysis of oligonucleotides by hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to negative ion electrospray ionization mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1218, 5480-5486 (2011).
- Muddiman, D. C., Anderson, G. A., Hofstadler, S. A., Smith, R. D. Length and base composition of PCR-amplified nucleic acids using mass measurements from electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 69, 1543-1549 (1997).
- Kullolli, M., Knorf, E., Arampatzidou, M., Tewari, M., Pitteri, S. J. Intact MicroRNA analysis using high resolution mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25, 80-87 (2013).
- Cummins, L. L., Chen, S., Blyn, L. B., Sannes-Lowery, K. A., Drader, J. J., Griffey, R. H., Hofstadler, S. A. Multitarget affinity/specificity screening of natural products: finding and characterizing high-affinity ligands from complex mixtures by using high-performance mass spectrometry. J. Nat. Prod. 66, 1186-1190 (2003).
