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Genetics

Amélioration de la Polymerase Chain Reaction restriction Fragment Length Polymorphism génotypage de Pufferfish Toxique par chromatographie liquide / spectrométrie de masse

Published: September 20, 2016
doi:
10.3791/54402
1National Research Institute of Police Science

Summary

Une méthode de longueur des fragments de réaction restriction polymorphisme améliorée en chaîne par polymérase pour le génotypage des espèces pufferfish par chromatographie / spectrométrie de masse liquide est décrit. Une colonne de monolithe de silice en phase inverse est utilisée pour la séparation des amplicons digérées. Cette méthode peut élucider les masses monoisotopiques d'oligonucléotides, qui est utile pour identifier la composition de base.

Abstract

Une version améliorée d'une réaction en chaîne par polymérase (PCR) un fragment d'une longueur -restriction (RFLP) Procédé de génotypage d'espèces toxiques pufferfish par chromatographie liquide / spectrométrie de masse à ionisation électrospray (LC / ESI-MS) est décrit. L'extraction d'ADN est effectuée en utilisant un kit d'extraction d'ADN à base de membrane de silice. Après l'amplification par PCR en utilisant un tampon de PCR sans détergent, des enzymes de restriction sont ajoutées à la solution sans purification de la solution réactionnelle. Une colonne de monolithe de silice en phase inverse et une transformée de Fourier à haute résolution spectromètre de masse ayant un analyseur piège Kingdon modifié est utilisé pour la séparation et la détection, respectivement. La phase mobile consistant en mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol 400, 15 mM de triéthylamine (pH 7,9) et de methanol, est délivré à un débit de 0,4 ml / min. Le temps de cycle pour l'analyse LC / ESI-MS est de 8 min, y compris l'équilibration de la colonne. logiciel de déconvolution ayant un modèle de distribution des isotopes of l'oligonucléotide est utilisé pour calculer la masse monoisotopique correspondante du spectre de masse. Pour l' analyse d'oligonucléotides (extrêmes 26-79 nucléotides), précision de la masse était de 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) et une excellente précision et la précision ont été maintenue pendant 180 heures sans utilisation d'un étalon de masse serrure.

Introduction

La spectrométrie de masse (MS) est une technologie acceptée pour l' identification rapide et fiable des acides nucléiques, assistée par matrice désorption / ionisation laser (MALDI) et ionisation par électrospray (ESI) étant utilisé pour l' ionisation 1,2. La technique MALDI est généralement combiné avec un temps de vol (TOF), l'analyseur; Cependant, l'application de MALDI-TOF MS est limitée aux oligonucléotides courts (~ 25 nucléotides (nt)) en raison de la fragmentation subséquente, la formation de produits d'addition et un faible rendement d' ionisation 1,2. En revanche, ESI est applicable aux oligonucléotides plus longs (> 100 nt), mais de nombreux états de charge de multiples ions chargés ([M-NH] n-) sont produites simultanément à partir biomacromolécules et, par conséquent, la masse de l'analyte peut être supérieure à la partie supérieure limite de la plage m / z du spectromètre. Cela nécessite l'interprétation des spectres alambiqué, à savoir, la transformation d'une série d'état de charge dans la masse correspondantevia déconvolution.

Dans le cas de mesure de la masse d'une petite molécule, le pic de la masse monoisotopique, à savoir, la masse de la molécule ne contenant que l'isotope le plus commun de chaque élément est le plus abondant et observé naturellement 3. Comme le poids moléculaire augmente, les changements de distribution des isotopes à m supérieur / z et le pic monoisotopique devient obscurci par le bruit de référence 3-5. Une fois le pic monoisotopique est plus détectable pour des masses supérieures à 10 kDa 3, la masse moléculaire moyenne est utilisée pour la mesure plutôt que la masse monoisotopique 5. Dans de tels cas, la répartition isotopique dans laquelle chacun des pics individuels sont séparés par 1 Da ne peut être observée lorsqu'un analyseur de masse à haute résolution tel qu'un TOF, une résonance cyclotronique ionique à transformée de Fourier modifiée Kingdon piège analyseur 6, ou une transformée de Fourier l'analyseur est utilisé pour l'analyse. Cependant, le pic le plus abondant est sarfois ne correspond pas à la masse moléculaire moyenne 5. Ces problèmes peuvent conduire à des difficultés pour déterminer avec précision analytes.

Compte tenu de la variation de l'abondance naturelle des isotopes stables et les difficultés dans la détermination de la masse moléculaire moyenne, la mesure de la masse monoisotopique est idéal pour la caractérisation de masse de biomolécules 3,4. Dans la pratique, si un pic monoisotopique peut être observé ou non, la masse monoisotopique peut être estimée en comparant le motif de la distribution isotopique observée à celle théorique calculée à partir d' un modèle analyte 4,7-10. L'algorithme d' ajustement 8 est maintenant incorporée dans des logiciels propriétaires.

Dans le contexte de l' ESI-MS, la dissociation d'un duplex d' ADN, la purification et dessalage sont nécessaires pour une mesure directe pour éviter l'échec de l' ionisation due à la suppression d'ions et la formation d' addition 2,10-14. Ces procédures sont Troublesome, cependant, les systèmes analytiques entièrement automatisés ont été développés commercialement impliquant une réaction en chaîne par polymérase (PCR), la préparation des échantillons et ESI-MS pour la détection d'agents pathogènes 15-20. Une autre approche est l'introduction de chromatographie liquide (LC) pour la séparation. LC fournit une séparation en ligne des analytes de substances coexistant et ne nécessite pas une préparation d'échantillon laborieuse avant ionisation 21,22. Cependant, la séparation des acides nucléiques en utilisant une phase mobile MS compatible est plus difficile que pour la plupart des autres composés tels que des médicaments, des peptides et des protéines en raison de la nature polyanionique des nucléotides. Les exemples les plus réussis de LC / ESI-MS impliquent l'utilisation de la paire d'ions en phase inverse LC. Une phase mobile de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) -triéthylamine (TEA) -méthanol a été d' abord proposé par Apffel et al. , Pour la séparation et la détection d' oligonucléotides courts 23. Application de la LC / ESI-MS génotypage pour differentiation des espèces de pathogènes, les polymorphismes nucléotidiques simples et répétitions courtes en tandem a été rapporté en utilisant une colonne de polymère monolithe capillaire qui peut séparer plus oligonucléotides 1,21,24-33.

Au Japon et aux États-Unis, une intoxication alimentaire grave a eu lieu en raison de misidentification et la préparation inadéquate de pufferfish, et ​​cela en dépit du fait que la distribution et la préparation de pufferfish est strictement contrôlé par la législation sur la sécurité alimentaire 34,35. En outre, un homicide volontaire en utilisant l' extrait de pufferfish ne se produit au Japon 36. Par conséquent, la différenciation des espèces pufferfish est nécessaire à la fois de la santé publique et des points de vue d'enquête médico-légale. En outre, parce que rubripes Takifugu est beaucoup plus cher que d' autres types de pufferfish, une capacité de différenciation est également nécessaire dans le cadre des enquêtes sur la fraude alimentaire.

Ici, une méthode détaillée pour déterminer la monoisotopic masse d'un produit de PCR par CL / ESI-MS en utilisant une colonne monolithique de silice en phase inverse et un spectromètre de masse à haute résolution est décrite. Plus précisément, la méthode a été mise au point pour permettre la différenciation des espèces toxiques pufferfish basées sur l'utilisation de la longueur des fragments de restriction par PCR (RFLP) Méthode 37, qui est le premier exemple de la différenciation des espèces d'animaux à l' aide de la SEP.

Protocol

1. Extraction de l'ADN Remarque: Utilisez une pièce séparée pour l'extraction de l'ADN et post-PCR examens tels que l'électrophorèse sur gel et LC / ESI-MS. Ajouter de l'éthanol au tampon de lavage 1 (contenant du chlorhydrate de guanidine) et un tampon de lavage 2 (ne contenant pas de chlorhydrate de guanidine) selon le protocole du kit d'extraction d'ADN. Des échantillons de poissons ont été obtenus auprès des grossistes de poissons et marchés de détail au Japon. Placez 30-50 mg de tissu de poisson dans un tube de 0,5 ml ou 1,5 ml microcentrifugeuse. Squash tissu à l'aide d'une micro-spatule (sauf pour les nageoires et de la peau). Remarque: Dans le cas de la nageoire, utiliser un tube de 0,5 ml pour le trempage. Ajouter 180 ul de tampon de lyse et 40 ul de proteinase K et vortexer brièvement. Incuber à 56 ° C sur un bloc chauffant pendant 2 heures ou toute la nuit. Mélanger par vortex brièvement toutes les 15 minutes pendant l'incubation. Remarque: la lyse complète est pas nécessaire. Centrifuger pendant 5 min à 13 000 x g. Après centrifugation, si un petit amount de l'huile présente à la surface dans le cas d'un échantillon gras tels que le foie, le jeter. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. Ajouter 200 ul du tampon chaotrope contenant du chlorhydrate de guanidine et mélanger par tourbillonnement. Ajouter 200 ul d'éthanol (99,5%) et vortexer à nouveau. Transférer le mélange dans la colonne de centrifugation dans un tube collecteur de 2 ml. Centrifugeuse pendant 1 min à 13 000 x g. Jeter l'écoulement. Attention: Ne pas ajouter de l'eau de Javel aux déchets parce guanidine peut former des composés hautement réactifs avec l'eau de Javel. Ajouter 500 pi de tampon de lavage 1 (contenant du chlorhydrate de guanidine) et centrifuger pendant 1 min à 13 000 x g. Jeter l'écoulement à travers et le tube de collecte. Placez la colonne de spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml fourni avec le kit. Ajouter 500 pi de tampon de lavage 2 et centrifuger pendant 3 min à 20 000 x g. Jeter l'écoulement et le tube de collecte. Transférer la colonne spin à une nouvelle1,5 ml de tube de microcentrifugeuse. Pipeter 200 ul de tampon d'élution au centre de la membrane de la colonne. Au bout de 1 minute, centrifuger pendant 1 min à 6000 x g. La pipette 50 ul de l'éluat dans une cuvette jetable UV et mesurer le spectre UV de l'éluat à 220 à 300 nm et l'absorbance à 260 nm en utilisant un spectrophotomètre. Vérifier le spectre UV de l'ADN avec un pic à 260 nm. Calculer la concentration approximative d'ADN en utilisant l'équation simple "concentration d'ADN (ng / ul) = absorbance à 260 nm x 50". Remarque: la concentration d'ADN typique extraite des ailettes de poisson – globe est de 63 ± 30 ng / pl (n = 20). Si la concentration en ADN est supérieure à 10 ng / ul, on dilue les échantillons d'ADN avec du Tris-EDTA (TE) (pH 8) à 5 ng / pl. Conserver l'échantillon à -20 ° C ou de procéder à une amplification par PCR (section 2). 2. PCR Mettre en place 25 pl PCR pour chaque extragi échantillon d'ADN, le contrôle positif (0,2 uM oligonucléotide synthétisé ayant la séquence cible dans TE tampon à pH 8,0) et un contrôle négatif (eau ultra – purifiée au lieu de l' échantillon d'ADN) sur la glace selon les tableaux 1 et 2 sur un banc propre pour éviter toute contamination. Remarque: Pour une utilisation facile, faire une quantité suffisante de cocktail contenant tous les réactifs sans ADN matrice et le distribuer. Utiliser la polymérase ayant une activité de correction d'épreuves d'ADN afin d'éviter l'ajout de 3 'A surplombs au produit de PCR. Effectuer une amplification par PCR sur un thermocycleur en utilisant le programme de cycle montré dans le tableau 3. 3. Digestion enzymatique Ajouter 2 ul de la solution contenant 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de MgCl2, 10 mM de dithiothréitol et 500 mM de NaCl à la solution de PCR. Ajouter 1 pi de chaque enzyme de restriction (Dra I et Msp I) et mélanger doucement. Incuber pendant 30 min à 37 ° C sur l'ecycleur ermal. Incuber pendant 5 min à 72 ° C pour activer la polymérase d'ADN restant, qui remplit l'extrémité cohésive produite par Msp I. Facultatif: analyser chacun 2,5 pi de la solution de réaction par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en utilisant un birapport de liaison (% C, le pourcentage de bisacrylamide) de 3,33 (% en poids) et une concentration en gel de polyacrylamide (% T) 15 (% p / v) 38. Colorer le gel en utilisant la tache d'ADN fluorescent et d'observer l'ADN double brin sur un transilluminateur lumière bleue en utilisant un écran d'ambre. On filtre la solution réactionnelle avec un dispositif de filtre centrifuge 0,2-0,5 um pour éviter le colmatage, ce qui nuirait à la colonne analytique. Transférer le filtrat dans une fiole conique de polypropylène et conserver à -20 ° C jusqu'à l'analyse. 4. LC / ESI-MS Analysis Peser 67,2 g (environ 42 ml) de HFIP et 1,52 g (environ 2,0 ml) de TEA dans une bouteille de 1 L. Ajouter 955 ml d'eau ultrapure (LC / MS grade) et mélanger à l'aide d'un agitateur magnétique jusqu'à ce que les réactifs sont complètement dissous. Prélever une partie aliquote de la solution et vérifier le pH (entre 7,85 et 7,95, idéalement pH = 7,9) en utilisant un pH-mètre. Note: Ne pas retourner l'aliquote à la bouteille pour éviter toute contamination par des ions métalliques. Si le pH est pas 7.9, ajouter une petite quantité de HFIP soit ou TEA pour ajuster le pH et mesurer à nouveau le pH. Branchez la bouteille à la ligne A du chromatographe liquide avec refroidissement de la bouteille à l'aide d'un réfrigérateur portable de refroidissement direct (à usage domestique) pour empêcher la vaporisation. Branchez un autre flacon rempli avec du méthanol à la ligne B. Connectez la colonne de garde et la colonne analytique (2,0 x 50 mm, mésopores size = 30 nm) dans le chromatographe liquide. Commencez coule la phase initiale mobiles (95% A et 5% B) pour équilibrer les colonnes. Préparer 0,5 mg / ml de sodium , trifluoroacétate (pH 3,5) comme étalon 39. Peser 50 mg (environ 34 pi) d'ac trifluoroacétiqueid dans un bécher. Ajouter 30 ml d'eau ultra-purifiée et titrer à pH 3,5 avec de l'hydroxyde de sodium à 10 mM à l'aide d'un pH-mètre. Remplir jusqu'à 50 ml avec de l'eau ultra-purifiée. Ajouter 50 ml d'acétonitrile (LC / MS de qualité) et mélanger. Prendre une partie de la solution de travail et de le stocker à température ambiante. Conserver le reste de la solution à 4 ° C. Réduire la pression d'azote de l'extrémité C-piège comme suit. Remarque: transform de Fourier récente spectromètres de masse, qui sont appropriés pour l'analyse des protéines intactes, un logiciel de contrôle pour contrôler la pression. Retirez le couvercle en haut à gauche du spectromètre de masse. La vanne C-trap est au coin de premier plan à gauche. Vérifier la valeur de la haute pression à vide dans la fenêtre du logiciel de contrôle de l'état de l'appareil. Remarque: La valeur est typiquement, 3 x 10 -8 bar. Tirez sur le bouton pour déverrouiller et tourner dans le sens antihoraire bouton très lentement pour réduire la presse à vide élevéure à 1/3 (typiquement, 1 x 10 -8 bar). La pression indiquée devrait changer progressivement d'une manière retardée. Ignorez le message d'avertissement de basse pression. Appuyez sur le bouton pour verrouiller. Restaurer le capot supérieur pour la sécurité. Calibrer le spectromètre de masse à l' aide de trifluoroacétate de sodium 39. Remarque: l'étalonnage de masse quotidien peut être remplacé par ce protocole, cependant, l'étalonnage recommandée suggéré par le fabricant aurait dû être achevé avant cette calibration. Régler les paramètres de numérisation et chauffés paramètres de source ESI dans la zone de contrôle de l'instrument du logiciel de réglage comme suit: type de scan complet MS; plage de balayage m / z 500-4,000; la fragmentation (en source dissociation induite par collision (CID) Tension 60 eV; polarité négative; contrôle automatique de gain (AGC) cible 1 x 10 6, le temps d'injection maximale msec 50; débit de gaz gaine 5; débit de gaz aux 0; gaz de balayage taux 0 débit; vaporisez tension 3 kV, température capillaire 320 ° C; S-lens radiofréquence (RF) niveau 100; la température de chauffage de 30 ° C. Entrer la liste des ions négatifs à surveiller comme m / z 792,85908, 1064,80870, 1336,75832, 1608,70794, 1880,65755, 2152,60717, 2424,55679, 2696,50640, 2968,45602, 3376,38045. Déplacer la sonde ESI chauffée proche de l'interface du spectromètre de masse (position B). Connecter la sonde et une seringue avec un tube. Infuser le calibrant constamment à une vitesse de 10 pi / min en utilisant la pompe à seringue intégré. Vérifiez que les 6 ions de masse inférieure (m / z 792,85908-2152,60717) dans la table d'étalonnage personnalisé. Procéder à l'étalonnage après l'intensité des signaux sont stabilisés. Après la calibration, vérifier que les six ions de masse plus élevées (m / z 1880,65755 à 3.376,38045) et procéder à l' étalonnage. Évitez l'étalonnage en utilisant tous les ions à la fois pour éviter l'échec. Déplacer la sonde au appropriée.Boîtela position te pour un débit de 0,4 ml / min (position D) et du débit se connecter au chromatographe en phase liquide avec un tube en métal inerte. Définissez les paramètres de la source ESI chauffés dans la zone de contrôle de l'instrument du logiciel de réglage comme suit: débit de gaz de la gaine 50; taux aux d'écoulement de gaz 15; balayer le débit de gaz 1; vaporisez tension 2,5 kV; température capillaire 350 ° C; S-lens RF niveau 100; la température de chauffage à 350 ° C. Régler les paramètres d'acquisition du spectromètre de masse dans la fenêtre de configuration instrumentale comme suit: Méthode durée 8 min; détourner valve, 3,5-6 min à spectromètre de masse, 0-3,5 et 6-8 min à perdre; exécution 3,5 à 6 mn; polarité négative; dans la source de tension CID 15,0 eV; microscans 3; pouvoir de résolution nominale (à m / z 200) 140.000; Cible AGC 1 x 10 6; temps d'ions maximale 50 msec; nombre de balayages 1; plage de balayage m / z 700-3,500; Spectre profil de type de données. Définissez les paramètres de chromatographe en phase liquide comme suit: four colonne température 20 ° C; sample plateau température de 10 ° C; programme gradient 0-0,5 min 5% de B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5-5 min 40-98% B, 5-6 min 98% B, 6- 6,05 min 98-5% B, 6,05 à 8 min 5% B; débit 0,4 ml / min. Purge des bulles en tapant le fond des flacons. Set flacons d'échantillon sur le porte-échantillon et injecter 1,0 ul d'un échantillon en utilisant l'échantillonneur automatique pour commencer l'analyse. Ouvrez les fichiers de données brutes avec le logiciel de navigation et confirmer que toutes les acquisitions sont terminées avec succès, y compris les contrôles positifs et négatifs. Remarque: En règle générale, deux ou trois pics seraient observés dans le chromatogramme ionique total actuel à un temps de rétention de 4 à 5,5 min lorsque l'ADN est amplifié avec succès pufferfish et digérée. 5. Déconvolution et interprétation Démarrez le logiciel de déconvolution. Sélectionnez le type d'expérience "extrait de l'automobile (isotopiquement résolu)". Modifier une méthode utilisant les paramètres suivants: la masse de sortie M; S / N SEUILSd 3, seuil d'abondance relative 0; charge négative oui; calculent extrait ion chromatogramme courant (XIC) oui; m / z gamme 700-3,500; porteurs de charge H +; nombre minimal de charge détecté 3; rapport isotopique nucléotide; facteur d'ajustement à 80%; seuil de reste à 0%; examiner les chevauchements oui; charger gamme 3-50; intensité minimale 1; attendu erreur d'intensité 3. Enregistrer comme nouvelle méthode et le sélectionner. Sélectionnez le répertoire dans lequel les fichiers de données brutes existent. Sélectionnez les fichiers de données brutes à analyser et cliquez sur "Ajouter à la liste 'bouton. Cliquez sur le bouton «Exécuter» à l'onglet «Run Queue» pour démarrer déconvolution. Après la file d'attente est terminée, sélectionnez une ligne et cliquez sur «Ouvrir Résultat» dans la légende supérieure pour obtenir les résultats de déconvolution. Interpréter les résultats des masses monoisotopiques dérivées des pics à un temps de rétention de 4-5,5 min en utilisant le tableau 4.

Representative Results

Trois colonnes disponibles dans le commerce ont été évaluées pour la séparation d'oligonucléotides longs à des taux de 1-400 ul / min de débit. La chaîne carbonée d'un à larges pores (C18) colonne de silice particulaire -bonded (a), d' un poly disponible dans le commerce (styrène-divinylbenzène) (PS-DVB) sur une colonne de monolithe (b) et une colonne monolithique C 18 de silice -bonded ( c) ont été comparées (Figure 1). Trois paires de duplexes d'ADN (26, 37 et 53 pb) ont été séparés en utilisant toutes les colonnes et la colonne C du monolithe de silice 18 -bonded a été utilisé dans des études ultérieures. Les résultats représentatifs pour l'analyse d'un échantillon d'ADN extrait du muscle de T. rubripes est représenté sur la figure 2. pics isotopiquement résolus, comme le montre la figure 2a, sont nécessaires pour le calcul avec succès la masse monoisotopique. Le théorique et measured monoisotopique masse de T. rubripes sont représentés sur la figure 2b. Étant donné que la digestion avec les endonucléases est exécutée juste après l'amplification par PCR sans purification, l'extrémité 3 'collante générée par l'endonucléase Msp I est rempli avec l'ADN polymérase restante. D' après l'analyse des amplicons dérivés des matrices d'ADN synthétiques, la précision de masse varie de -2,48 à 2,40 ppm (0,62 ± 0,74 ppm , en moyenne, n = 280). Par conséquent, une tolérance de masse de 3 ppm a été utilisée pour différencier les espèces (tableau 4). Utilisation de la table, tous les échantillons de pufferfish obtenus sur les marchés et les magasins ont été bien différenciés comme des espèces spécifiques 37. D' après l'analyse périodique de l'échantillon obtenu à partir de la matrice d'ADN synthétique de T. chrysops, toutes les masses monoisotopiques des analytes ont été déterminées avec succès à ± 3 ppm pour le auast 180 h sans aucune calibration de masse (Figure 3). Cela signifie que l'étalonnage de masse serait nécessaire sur une base hebdomadaire. Figure 1: Total des ions chromatogrammes courant du produit de PCR-RFLP dérivée de la matrice d'ADN synthétisé de T. pardalis en utilisant une colonne C 18 -bonded de silice particulaire (a, 3 x 250 mm, taille de particule 3 pm), un poly (styrène-divinylbenzène) (PS-DVB) sur une colonne monolithique (b, 1,0 x 250 mm) et un rapport C 18 colonne -bonded monolithe de silice (c, présent procédé) Conditions pour (a):. débit de 0,2 ml / min; rapport du méthanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-20 min 25% -40%, 20-35 min 40% -98%, 35-50 min 98%, 50- 51 min 98% -5%, 51-65 min 5%. Conditions pour (b):débit 0,1 ml / min; rapport du méthanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-35 min 25% -40%, 35-40 min 40% -98%, 40-55 min 98%, 55- 56 min 98% -5%, 56-70 min 5%. La température pour les deux colonnes est de 20 ° C. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2: Les résultats représentatifs pour l' analyse musculaire brute de T. rubripes. (a) ion totale chromatogrammes courants typiques et spectre de masse. (B) les masses monoisotopiques théoriques et mesurées des produits PCR-RFLP dérivés de la matrice d'ADN synthétisé de T. rubripes. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un grandversion r de ce chiffre. Figure 3:. Test de stabilité sommairisé amplicons issus de l'ADN synthétique de T. chrysops ont été analysées toutes les 10 heures. Calibration de masse n'a pas été effectuée pendant le test. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. prénom Séquence lago86F 5'-3 'CCATGTGGAATGAAAACACC- taki114F 5'-3 'AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA- fugu86-114R 5'-3 'CCCTAGGGTAACTCGGTTCG- <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Tableau 1: PCR amorces. réactif PCR Volume utilisé La concentration finale eau ultra-purifiée 15,75 pi sans détergent 5x tampon 5,0 ul 1 fois dNTP mix (10 mM chacun) 0,5 ul 0,2 mM mélange Primer (10 uM chacun des lago86F, taki114F et fugu86-114R dans TE tampon à pH 8,0) 1,0 ul 0,4 pM de chacun DNA polymerase (2,5 unité / pl) 0,25 pi 0,1 unité / pl ADN modèle dans TE tampon à pH 8,0 (5,0-10 ng / pl pour l'échantillon extrait, 0,2 pM pour l'ADN synthétique comme témoin positif) 2,5 ul 0,5-1,0 ng / ul pour l'ADN extrait et 20 nM pour l'ADN synthétique Total: 25 pi Tableau 2: Composants d'une échelle de 25 pi de PCR. Cycle Condition Fonction 1 2 min à 95 ° C, dénaturation initiale 2 30 s à 95 ° C, Dénaturation 3 30 s à 56 ° C, recuit 4 30 s à 72 ° C Élongation 5 Répéter 2-4 (totalement 30 cycles) 6 7 min à 72 ° C Allongement final 7 Maintenir à 12 ° C jusqu'à l'élimination de l'échantillon Tableau 3: programme de PCR. Numéro haute à temps de rétention de 4,0-5,5 min masse mono isotopique du troisième pic dans la plage (Da) masse mono isotopique du second pic dans la gamme (Da) espèces Pufferfish Plus petit brin Agrandir brin Plus petit brin Agrandir brin 2 → → 15.890,707 à 15.890,803 16.177,531 à 16.177,629 L. inermis 15.921,702 à 15.921,797 16.146,537 à 16.146,634 L. gloveri 15.930,713 à 15.930,809 16.137,525 à 16.137,622 L. lunaris 15.937,697 à 15937,792 16.131,537 à 16.131,634 L. wheeleri 24.173,034 à 24.173,179 24.566,905 à 24567,053 T. chrysops 3 16295,706 à 16.295,804 16.467,610 à 16467,709 11.341,851 à 11.341,919 11466,875 à 11.466,944 T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus 11.654,908 à 11654,978 11770,920 à 11.770,991 T. niphobles 16.296,701 à 16.296,799 16.468,605 à 16.468,704 → → T. rubripes 16.311,701 à 16.311,799 16.452,610 à 16.452,709 → → T. poecilonotus T. exascurus 16320,713 à 16.320,811 16.443,599 à 16.443,697 → → T. porphyreus T. obscurus 16.599,751 à 16.599,851 16780,667 à 16.780,767 → → T. vermicularis Tableau 4: Différenciation des pufferfish de masses monoisotopiques dérivées de LC / ESI-MS. Tableau 5: Amplified séquence d'ADN (a) La séquence est identique à.celle des autres espèces de pufferfish comme décrit dans le tableau 4. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

Discussion

Pour extraire l'ADN, une trousse commerciale d'extraction d'ADN à partir de sang et les tissus sont utilisés conformément au protocole du fabricant, avec des modifications mineures (quantité de protéinase K et la centrifugation de la solution de lyse). Cependant, n'importe quel kit d'extraction peut être utilisé aussi longtemps que l'ADN cellulaire peut être extrait avec une récupération et une pureté adéquate pour la PCR. Cette méthode a été testée en utilisant le muscle, nageoire, foie, de l' ovaire et de la peau 37. Fin est particulièrement approprié en raison de la grande surface, ce qui permet la lyse rapide avec protéinase K. frais, congelés, séchés, cuits et des échantillons de pufferfish cuits ont été testés avec succès 37.

Le jeu d'amorces PCR (Tableau 1) est conçu pour pufferfish et amplifie le 16S mitochondrial ribosomal gène de l' ARN de pufferfish. L'ADN cible à amplifier est de 114 à 115 pb ( du genre Takifugu) et 86 pb (genre Lagocephalus) (tableau 5). Pour faciliter la méthode development, des oligonucléotides synthétisés ayant les séquences cibles ont été utilisés pour la référence au lieu de recueillir des échantillons authentiques de pufferfish. Le jeu d'amorces peut être remplacé par un autre ensemble d'amorces en réponse à la fin, cependant, la longueur finale de l'ADN après digestion enzymatique doit être inférieure à 100 nt en termes de maintien de la qualité du spectre de masse nécessaire pour déconvolution réussie. En outre, la pression d'azote dans le piège C doit être réduite lorsque l'oligonucléotide cible est supérieure à environ 75 nt et de la qualité du spectre de masse est insuffisante pour déconvolution réussie. De telles limitations peuvent être contrôlés par les récents développements dans le logiciel de l'appareil, faute de quoi la vanne à l'extrémité C-siphon à l'intérieur du châssis doit être réglé de la manière décrite dans la section de protocole. En ce qui concerne la préparation des échantillons, l' utilisation de réactifs sans détergent est critique pour la LC ultérieure en termes de forme de pic appropriée, l' intensité de crête suffisante et le temps de rétention stable 31.

<p class = "jove_content"> Une colonne capillaire PS-DVB monolithe 21,24-33, une colonne de silice particulaire C18 en phase inverse 23,40,41 et une chromatographie d'interaction hydrophobe (HILIC) de la colonne 42 ont été utilisées pour la LC / analyse ESI-MS d'oligonucléotides. Parmi ceux-ci, la colonne capillaire de monolithe est supérieur aux autres en termes de capacité de séparation, cependant, la colonne capillaire monolithique utilisé dans des études antérieures a été faite en interne et fonctionnant à un débit faible (2 ul / min), ce qui nécessite une instrumentation dédié à la micro LC. Afin de faciliter la facilité d'utilisation, les colonnes disponibles dans le commerce ont été évaluées pour la séparation d'oligonucléotides longs à des débits plus élevés (1-400 ul / min). Trois paires de duplexes d' ADN (26, 37 et 53 pb) ont été séparés en utilisant des colonnes mentionnées ci-dessus, cependant, les temps de cycle de la colonne de silice particulaire C 18 -bonded et la colonne PS-DVB monolithe était de 65 et 70 min, respectivement alors que celle de l'extrémité C <sub> 18 colonne de silice monolithe -bonded était de 8 minutes (figure 1). En prenant en considération l' analyse rapide, la colonne monolithe de silice C 18 -bonded a été choisi pour nos besoins en dépit de la capacité de séparation limitée; cependant, les deux colonnes restantes peuvent être utilisées lorsque l'amélioration de la séparation est nécessaire. En théorie, dans le cas d'une colonne de monolithe, il n'y a pas de volume interstitiel et la phase mobile serait contraint de circuler à travers les pores de la phase solide tout en conservant une longueur de chemin constante, ce qui permet une séparation efficace 27. De tels procédés pourraient se manifester, en particulier dans l'analyse de macromolécules biologiques, tel qu'un oligonucléotide, comme la lente diffusion des grosses molécules. L' un des avantages pratiques d'une colonne monolithique est que la pression est inférieure à celle d'une colonne de silice particulaire 27. En dépit du taux élevé d'écoulement (400 ul / min) et la basse température de la colonne (20 ° C), pression maximale dusystème était de 12,5 MPa 37. Ceci est la première démonstration de l'avantage d'une colonne monolithique de silice C 18 -bonded pour l'analyse rapide d'un long oligonucleotide. En raison du débit élevé, un instrument dédié aux micro LC et un alignement précis à l'interface ne sont pas nécessaires. Au lieu de cela, une sonde ESI chauffée est nécessaire de dissocier le duplex d'ADN et d'aider l'ionisation de l'ADN comme décrit plus loin.

Chromatographie de paires d'ions est couramment utilisée pour la séparation MS compatible avec des oligonucléotides. Cependant, un réactif à paire d'ions interfère généralement avec le processus ESI et diminue la sensibilité de l'ESI-MS. Par conséquent, le HFIP est fréquemment utilisé pour la phase mobile pour améliorer la sensibilité de l'oligonucléotide. Cependant, HFIP (point d' ébullition 59 ° C) se vaporise rapidement à l'interface avant (point d'ébullition 65 ° C) de méthanol et, par conséquent, cette perte de solvant augmente le pH et favorise la dissociation du réactif de paires d' ions (ie, TEA)de l'oligonucléotide. Parce que le présent procédé utilise une sonde ESI chauffée, qui nébulise l'éluat avec de l'azote gazeux chaud à 350 ° C, cet effet peut être surestimée. Au lieu de tampon TEA-HFIP, Erb et Oberacher recommandé acétate d'cyclohexyldimethylammonium (CycHDMAA; pH 8,4) pour l' analyse de génotypage en raison d'une réduction de la formation d'adduits avec des ions de métaux traces 33. Les auteurs en ont déduit que CycHDMAA lui-même supprimé la formation du produit d'addition de métal. En dépit de la littérature, de la formation d'adduits significative n'a été observée dans le présent procédé. En outre, l'avantage remarquable du système de HFIP-TEA-méthanol est que la surface du pic obtenu avec le système HFIP-TEA-méthanol était 17 fois supérieure à celle obtenue à partir du système CycHDMAA-acétonitrile lors de l' analyse d' un amplicon de 86 pb de T. poecilonotus (données non présentées). Un inconvénient du système de HFIP-TEA-méthanol, cependant, est le coût plus élevé par rapport au système de CycHDMAA-acétonitrile.

Calcul de la masse monoisotopique exige la séparation des pics isotopiques des ions à charge multiple. Par conséquent, la résolution est critique pour la présente analyse. Bien que la puissance de résolution requise est fonction de la longueur de l'analyte paires de bases, analyseurs TOF conventionnels, qui ont un pouvoir de résolution de quelques dizaines de milliers, peut être limitée pour l'analyse d'oligonucléotides courts.

Les masses monoisotopiques théoriques indiquées dans le tableau 4 ont été calculées à partir des compositions de base correspondantes des analytes. Alternativement, Muddiman et al. A développé une application logicielle pour calculer la composition de base de la masse exacte 43. Un programme similaire a été intégré dans le système ESI-MS automatisé 16-18. L'utilisation de ces algorithmes peut améliorer la robustesse de la présente méthode, car une masse monoisotopique mesurée ne correspond pas toujours à une composition unique base oaile à la tolérance de masse de 3 ppm résultant de l'erreur de mesure inévitable. Malheureusement, nous ne pouvions pas obtenir ces produits logiciels pour la présente étude.

La monoisotopique détermination présente des espèces basée sur la masse peut convenir non seulement pour la différenciation des pufferfish mais aussi pour la détection d'autres polymorphismes d'ADN parce que la présente méthode est basée sur l'analyse de la composition de base et ne comporte pas une procédure spécialement conçue pour pufferfish. En ce qui concerne la détection du polymorphisme de l' ADN, le système ESI-MS dédié est entièrement automatisé et facile à utiliser, qui peut être adapté à une utilisation diagnostique telles que la détection d'agents pathogènes 15,17,18,20,30. A l'inverse, le présent procédé est réalisable avec des instruments ordinaires de recherche et des appareils et, par conséquent, approprié à des fins de recherche. ESI-MS a déjà été appliquée à un polymorphisme de l' ADN humain, comme seule 13,28,32 de polymorphisme nucléotidique, courte tandem répétition 26, Et l' ADN mitochondrial analsis 16,19. Micro ARN a également été analysé par l' intermédiaire capillaire LC / ESI-MS 44. Ces applications publiées peuvent également être réalisés par le présent procédé. En outre, ce procédé peut convenir pour la surveillance de l'interaction entre l' oligonucléotide et de faible poids moléculaire, tels que les composés de l'interaction des antibiotiques et de l' ARN ribosomique 45 en raison de la séparation à basse température. Dans de tels cas, des oligonucléotides et des composés de bas poids moléculaire doit être détecté simultanément, ce qui est un avantage d'utiliser LC / ESI-MS.

Il existe une limite que l'instrumentation ne convient pas pour effectuer une analyse en parallèle comme dans les techniques classiques telles que le séquençage Sanger et PCR en temps réel. En outre, le présent procédé identifie uniquement la composition de base ainsi que toute substitution de base dans la même molécule ne peuvent pas être distingués. Cependant, l'analyse de l'ADN à base de MS décrit ici peut encore avoir le mérite en termes de précision par rapport à la technique à base de colorant, tels que l'électrophorèse sur gel et la PCR en temps réel de liaison d'ADN.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).

Materials

DNeasy Blood & Tissue Kit (50) Qiagen 69504 DNA extraction kit
Proteinase K Qiagen 19131
Ethanol (99.5+ vol%) Wako 054-07225 For dilution of wash buffers
TE buffer (pH 8.0) Wako 310-90023 For dilution of DNA sample
PCR primer Fasmac NA Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier
Template DNA Eurofins Genomics NA Purified by HPLC by the supplier
Ultrapurified water NA NA Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation
Detergent Free 5X Phusion HF Buffer Thermo Fisher F-520L Use instead of the provided buffer of DNA polymerase
Pfu-X DNA polymerase Jena Bioscience PCR-207S
dNTP mix (20 mM each) Jena Bioscience NA Supplied with the DNA polymerase
10× Universal buffer M Takara Bio NA Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl
Dra I Thermo Fisher FD0224 Restriction enzyme
Msp I Thermo Fisher FD0544 Restriction enzyme
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) Fluka 42060-50ML Eluent additive for LC-MS grade.
Triethylamine (TEA) Fluka 65897-50ML Eluent additive for LC-MS grade.
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508 For preparation of calibrant.
Sodium hydroxide (1.0 M) Fluka 72082 Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid.
Acetonitrile Fluka 34967 For preparation of calibrant, LC/MS grade.
Methanol Kanto 25185-76 For mobile phase, LC/MS grade.
Water Thermo Fisher W6-1 For mobile phase, LC/MS grade.
Microcentrifuge tube (0.5 ml) Eppendorf 0030123301 PCR clean grade
Microcentrifuge tube (1.5 ml) Eppendorf 0030123328 PCR clean grade
UVette Eppendorf 0030106300 Disposable UV cuvette.
Gel Green Biotium 41004 Fluorescent DNA stain
Cosmospin filter G (0.2 μm) Nakalai Tesque 06549-44 Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable.
300-μl PP screw vial American Chromatography Supplies V0309P-1232
Preassembled screw cap and septa Finneran 5395-09R
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) Kyoto Monotech 2050H30ODS Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/)
Monobis C18 guard column Kyoto Monotech GCSET-ODS3210 Holder included.
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) Imtakt CW036 C18-bonded particulate silica column
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) Thermo Fisher 066640 Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column
Themo Mixer C Eppendorf 5382 000.023 For digestion of fish tissues.
Spectrophotometer Shimadzu UV-3150 Quantification of DNA concentration.
Thermal cycler Bio-Rad T100
Portable refrigerator Twinbird D-CUBE For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box.
Ultimate 3000 liquid chromatograph Thermo Fisher NA
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher NA Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer.
Protein deconvolution 3.0 Thermo Fisher NA Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide.
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Puffer Fish GenotypingToxic Puffer FishPCR-RFLPLiquid Chromatography/mass SpectrometryDNA ExtractionUV SpectrophotometryAnalytical ColumnReagent Contamination

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Miyaguchi, H. Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (115), e54402, doi:10.3791/54402 (2016).
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