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Genetics

Melhoria Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Genotipagem de Pufferfish Tóxico por Cromatografia Líquida / Espectrometria de Massa

Published: September 20, 2016
doi:
10.3791/54402
1National Research Institute of Police Science

Summary

Um método de polimorfismo de fragmentos de reacção em cadeia da polimerase restrição melhorado para genotipagem espécies pufferfish por cromatografia / espectrometria de massa líquida é descrito. Uma coluna de sílica de fase inversa monólito é empregue para a separação de fragmentos amplificados digeridos. Este método pode elucidar as massas monoisotópico de oligonucleótidos, que é útil para identificar a composição de base.

Abstract

Uma versão melhorada de um método para a genotipagem de espécies tóxicas pufferfish por espectrometria de massa de cromatografia / ionização por electrospray líquida (LC / ESI-MS) de reacção em cadeia da polimerase (PCR) fragmento -restriction polimorfismo de comprimento (RFLP), está descrito. a extracção do ADN é realizada utilizando um estojo de extracção de ADN à base de membrana de sílica. Após a amplificação por PCR utilizando um tampão de PCR livre de detergente, as enzimas de restrição são adicionados à solução sem purificar a solução da reacção. Uma coluna de sílica monólito de fase inversa e uma transformação de Fourier espectrómetro de massa de alta resolução com um analisador de armadilha Kingdon modificada são utilizados para a separação e detecção, respectivamente. A fase móvel, que consiste em mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol 400, trietilamina 15 mM (pH 7,9) e metanol, é entregue a um caudal de 0,4 ml / min. O tempo de ciclo para a análise / ESI-MS LC é de 8 min incluindo equilíbrio da coluna. software Deconvolution ter um isótopo modelo de distribuição of o oligonucleótido é utilizado para calcular a massa monoisotópica correspondente do espectro de massa. Para a análise de oligonucleotídeos (variação de 26-79 nucleótidos), precisão de massa foi de 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280) e excelente exatidão e precisão foram mantidas por 180 horas sem o uso de um padrão de massa de bloqueio.

Introduction

Espectrometria de massa (MS) é uma tecnologia aceite para identificação rápida e fiável de ácidos nucleicos, de laser assistida por matriz dessorção / ionização (MALDI) e ionização por electrospray (ESI) a ser utilizado para ionização 1,2. A técnica MALDI é tipicamente combinado com um tempo de voo com analisador (TOF); No entanto, a aplicação de MALDI-TOF MS está limitada a oligonucleótidos curtos (~ 25 nucleótidos (nt)) devido à fragmentação posterior, formação do aduto e baixa eficiência de ionização de 1,2. Em contraste, a ESI é aplicável a oligonucleótidos mais longos (> 100 nt), mas muitos estados de carga múltipla de iões carregados ([M-NH] n-) são produzidos simultaneamente de biomacromoléculas e, por conseguinte, a massa do analito pode exceder o máximo limite da gama m / z do espectrômetro. Isto requer a interpretação dos espectros convoluta, ou seja, a transformação de uma série estado de carga na massa correspondendovia deconvolução.

No caso da medição de massa de uma molécula pequena, o pico da massa monoisotópica, ou seja, a massa da molécula contendo apenas o isótopo mais comum de cada elemento é o mais abundante e observada naturalmente 3. Como o peso molecular aumenta, os deslocamentos de distribuição isotópica para maior m / z e o pico monoisotópico é obscurecida pelo ruído de linha de base 3-5. Uma vez que o pico monoisotópico não é mais detectável por massas superiores a 10 kDa 3, a massa molecular média é utilizado para a medição em vez do que a massa monoisotópica 5. Em tais casos, a distribuição isotópica em que cada um dos picos individuais são separados por uma Da só pode ser observado quando um analisador de massa de alta resolução tal como um TOF, uma ressonância de ciclotrão ião transformada de Fourier modificado Kingdon analisador armadilha 6, ou uma transformada de Fourier analisador é utilizado para análise. No entanto, o pico mais abundante é a sometimes não é consistente com a massa molecular média de 5. Estes problemas podem levar a dificuldades para a determinação exacta analitos.

Dada a variação na abundância natural dos isótopos estáveis ​​e as dificuldades na determinação da massa molecular média, a medição da massa monoisotópica é ideal para a caracterização de massa de biomoléculas 3,4. Na prática, se um pico monoisotópico podem ser observadas ou não, a massa monoisotópica pode ser estimado por comparação do padrão de distribuição isotópica observada para a teórica calculada a partir de um modelo de analito 4,7-10. O algoritmo de ajuste 8 está agora incorporado no software proprietário.

No contexto de ESI-MS, a dissociação de um duplex de DNA, purificação e dessalinização são necessárias para a medição directa para evitar a falha de ionização devido à supressão de iões e formação de aduto 2,10-14. Estes procedimentos são troublesome, no entanto, sistemas analíticos totalmente automatizados foram desenvolvidos comercialmente envolvendo reacção em cadeia da polimerase (PCR), a preparação da amostra e ESI-MS para a detecção de agentes patogénicos 15-20. Outra abordagem é a introdução de cromatografia líquida (LC) para a separação. LC proporciona uma separação em linha dos analitos a partir de substâncias que coexistem e não requer uma preparação da amostra trabalhoso antes da ionização 21,22. No entanto, a separação de ácidos nucleicos utilizando uma fase móvel MS-compatível é mais difícil do que para a maioria dos outros compostos tais como fármacos, péptidos e proteínas, devido à natureza polianiónica dos nucleótidos. Os exemplos mais bem sucedidos de LC / ESI-MS envolvem o uso de par-ião de LC de fase reversa. Uma fase móvel de 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) -triethylamine (TEA) -metanol foi inicialmente proposto por Apffel et al., Para separar e detectar os oligonucleótidos curtos 23. Aplicação de LC / genotipagem ESI-MS para differentiation de espécies de agentes patogénicos, polimorfismos de nucleotídeo único e repetições curtas em tandem foi relatado usando uma coluna de polímero monólito capilar que pode separar oligonucleotídeos mais 1,21,24-33.

No Japão e nos Estados Unidos, intoxicação alimentar grave ocorreu devido a erros de identificação e preparação inadequado de baiacu, e isso apesar do fato de que a distribuição e preparação de baiacu é rigorosamente controlada por legislação de segurança alimentar 34,35. Além disso, um homicídio intencional utilizando extrato de baiacu aconteceu no Japão 36. Portanto, a diferenciação de espécies pufferfish é necessária tanto a saúde pública e pontos de vista de investigação forense. Além disso, porque Takifugu Rubripes é muito mais caro do que outros tipos de baiacu, uma capacidade de diferenciação é também necessária no contexto de investigações de fraude alimentar.

Aqui, um método detalhado para a determinação do monoisotopic massa de um produto de PCR por LC / ESI-MS, utilizando uma coluna de sílica monólito de fase reversa e um espectrómetro de massa de alta resolução é descrito. Especificamente, a abordagem foi desenvolvida para permitir a diferenciação de espécies tóxicas pufferfish baseadas na utilização da PCR, comprimento de polimorfismo dos fragmentos de restrição (RFLP) Método 37, o qual é o primeiro exemplo para a diferenciação de espécies de animais, utilizando MS.

Protocol

1. Extração de DNA Nota: Use uma sala separada para exames de extração de DNA e pós-PCR, tais como eletroforese em gel e LC / ESI-MS. Adicionar etanol ao tampão de lavagem 1 (contendo cloridrato de guanidina) e tampão de lavagem 2 (não contendo cloridrato de guanidina) de acordo com o protocolo do kit de extracção de ADN. As amostras de peixes foram obtidos a partir de peixe grossistas e mercados retalhistas no Japão. Coloque 30-50 mg de tecido de peixe num tubo de 0,5 ml ou 1,5 ml de microcentrífuga. Esmagar o tecido usando um micro-espátula (exceto para fin e pele). Nota: No caso de aleta, utilizar um tubo de 0,5 ml de imersão. Adicionar 180 ul de tampão de lise e 40 ul de proteinase K e vortex brevemente. Incubar a 56 ° C num bloco de aquecimento durante 2 horas ou durante a noite. Misturar em vortex brevemente a cada 15 minutos durante a incubação. Nota: lise completa não é necessária. Centrifugar durante 5 min a 13.000 x g. Após centrifugação, se uma pequena amount de óleo existe sobre a superfície, no caso de uma amostra gordos tais como o fígado, descartá-lo. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 200 ul de tampão de caotrópico contendo cloridrato de guanidina e misturar por vortex. Adicionar 200 uL de etanol (99,5%) e mistura por turbilhonamento novamente. Transferir a mistura para a coluna de rotação colocados num tubo de recolha de 2 ml. Centrifugar durante 1 min a 13.000 x g. Descartar o fluxo de passagem. Cuidado: Não adicione água sanitária para o lixo porque guanidina pode formar compostos altamente reativos com lixívia. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem 1 (contendo cloridrato de guanidina) e centrifugação durante 1 min a 13.000 x g. Elimine o escoamento eo tubo de coleta. Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml fornecido com o kit. Adicionar 500 ul de tampão de lavagem 2 e centrifuga-se durante 3 min a 20.000 x g. Descartar o escoamento e o tubo de recolha. Transferir a coluna de centrifugação para uma nova1,5 ml tubo de microcentrífuga. Pipete 200 pi de tampão de eluição para o centro da membrana por coluna de centrifugação. Após 1 min, centrifugar durante 1 min a 6000 x g. Pipetar 50 ul do eluato a uma cuvete descartável de UV e medir o espectro de UV do eluato a 220-300 nm e a absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro. Verificar o espectro de UV do DNA com o pico a 260 nm. Calcula-se a concentração de DNA aproximado utilizando a equação simples "concentração de ADN (ng / mL) = absorvância a 260 nm x 50". Nota: concentração de DNA típica extraído das aletas de pufferfish é de 63 ± 30 ng / mL (n = 20). Se a concentração de ADN é maior do que 10 ng / mL, diluir as amostras de ADN com tampão Tris-EDTA (TE) (pH 8) a 5 ng / mL. Armazenar a amostra a -20 ° C ou prosseguir para a amplificação por PCR (Secção 2). 2. PCR Configurar 25 mL PCR para cada extragiu amostra de ADN, de controlo positivo (0,2 uM de oligonucleótidos sintetizados possuindo a sequência alvo em tampão TE a pH 8,0) e controlo negativo (água ultra-purificada em vez da amostra de DNA) em gelo de acordo com as Tabelas 1 e 2 numa bancada limpa para evitar a contaminação. Nota: Para a operação fácil, fazer uma quantidade suficiente de cocktail contendo todos os reagentes sem DNA modelo e dispensá-la. Use polimerase com actividade correctora de ADN para evitar a adição de 3 'salientes para o produto de PCR. Levar a cabo uma amplificação por PCR na termociclador utilizando o programa do ciclo mostrado na Tabela 3. 3. Digestão Enzimática Adicionar 2 ml da solução contendo Tris-HCl 100 (pH 7,5), MgCl2 100 mM, ditiotreitol 10 mM e NaCl 500 mM à solução de PCR. Adicionar 1 ml de cada enzima de restrição (Dra I e Msp I) e misture delicadamente. Incubar durante 30 min a 37 ° C no thcycler ermal. Incubar durante 5 min a 72 ° C para activar a polimerase de ADN remanescente, que enche a extremidade coesiva gerado por Msp I. Opcional: Analisar cada uma com 2,5 ul da solução da reacção por electroforese em gel de poliacrilamida usando uma razão transversal de ligação (% C, percentagem de bisacrilamida) de 3,33 (% em peso) e uma concentração do gel de poliacrilamida (% T) de 15 (% w / v) 38. Manchar o gel usando o corante de ADN fluorescente e observar DNA dupla vertente num transiluminador de luz azul usando uma tela de âmbar. Filtra-se a solução de reacção com um dispositivo de filtro centrífugo 0,2-0,5 uM para evitar o entupimento, o que iria danificar a coluna analítica. Transferir o filtrado para um frasco de polipropileno afunilada e armazenar a -20 ° C até à análise. 4. LC / ESI-MS Análise Pesar 67,2 g (ca. 42 ml) de HFIP e 1,52 g (cerca de 2,0 ml) de TEA em uma garrafa de 1 L. Adicione 955 ml de água ultrapura (LC / MS graDE) e agita-se com um agitador magnético até que os reagentes estão completamente dissolvidos. Tome-se uma alíquota da solução e verificar o pH (entre 7,85 e 7,95; idealmente pH = 7,9) utilizando um medidor de pH. Nota: Não envie a alíquota para a garrafa para evitar a contaminação por íons metálicos. Se o pH não é 7,9, adicionar uma pequena quantidade de HFIP ou qualquer TEA para ajustar o pH e medir novamente o pH. Ligue o frasco com a linha A do cromatógrafo líquido com arrefecimento da garrafa utilizando um refrigerador portátil arrefecimento directo (para uso doméstico) para evitar a vaporização. Conectar uma outra garrafa cheia com metanol a linha B. Ligar a coluna de guarda e a coluna analítica (2,0 x 50 mm, tamanho de mesoporos = 30 nm) para o cromatógrafo líquido. Começar a fluir a fase móvel inicial (95% de A e 5% de B) para equilibrar as colunas. Prepare a 0,5 mg / ml de sódio trifluoroacetato (pH 3,5) como um calibrador 39. Pesar 50 mg (ca. 34 uL) de ac trifluoroacéticoID numa proveta. Adicionar 30 ml de água ultra-purificada e titula-se a pH 3,5 com hidróxido de sódio a 10 mM, com o auxílio de um medidor de pH. Encha até 50 ml com água ultrapura. Adicionar 50 ml de acetonitrilo (LC / MS grau) e misturar. Pegue uma porção da solução de trabalho e armazená-lo à temperatura ambiente. Armazenar o resto da solução a 4 ° C. Reduzir a pressão de azoto de C-armadilha como se segue. Nota: Fourier recentes transformar espectrómetros de massa, que são adequados para a análise de proteínas intactas, tem software de controlo para controlar a pressão. Remova a tampa superior esquerda do espectrômetro de massa. A válvula C-armadilha está no canto do primeiro plano esquerdo. Verifique o valor da pressão de alto vácuo na janela de estado instrumento de software de controle. Nota: O valor é tipicamente, 3 x 10 -8 bar. Puxe o botão para desbloquear e transformar o sentido anti-horário o botão de forma muito lenta para reduzir a imprensa alto vácuoure a 1/3 (tipicamente, de 1 x 10 -8 bar). A pressão indicada deve mudar gradualmente de uma forma retardada. Ignorar a mensagem de aviso sobre baixa pressão. Pressione o botão para bloquear. Restaurar a tampa superior para a segurança. Calibrar o espectrômetro de massa usando trifluoroacetato de sódio 39. Nota: A calibração de massa diária pode ser substituído pelo presente protocolo, no entanto, a calibração recomendado sugerido pelo fabricante deveria ter sido concluído antes desta calibração. Definir parâmetros de digitalização e aquecidos parâmetros da fonte ESI na caixa de controle do instrumento do software de ajuste da seguinte forma: tipo de digitalização MS completo; varredura de intervalo m / z 500-4,000; fragmentação (in-fonte de dissociação (CID) Tensão 60 eV colisão induzida; polaridade negativa; auto controle de ganho (AGC) alvo 1 x 10 6, tempo máximo de injetar 50 ms; caudal de gás 5 bainha; aux caudal de gás 0; gás de varrimento taxa de 0 fluir; spray de tensão de 3 kV; temperatura capilar 320 ° C; S-lente de radiofrequência (RF) nível 100; temperatura do aquecedor 30 ° C. Entrada da lista de íons negativos para ser monitorado como m / z 792,85908, 1.064,80870, 1.336,75832, 1.608,70794, 1.880,65755, 2.152,60717, 2.424,55679, 2.696,50640, 2.968,45602, 3.376,38045. Mover a sonda ESI aquecida para mais perto da interface do espectrómetro de massa (posição B). Ligar a sonda e uma seringa com um tubo. Infundir a calibração constantemente a uma taxa de fluxo de 10 mL / min usando a bomba de seringa encaixado. Verificar apenas a 6 inferiores iões de massa (m / z) 792,85908-2.152,60717 na tabela de calibração personalizado. Continuar com a calibração depois de a intensidade dos sinais são estabilizados. Após a calibração, verificar apenas os seis íons de maior massa (m / z 1.880,65755-3.376,38045) e prossiga com a calibração. Evite calibrar usando todos os íons de uma vez para evitar o fracasso. Mova a sonda para o appropriaposição TE para uma taxa de fluxo de 0,4 ml / min (posição D) e conectar-se o cromatógrafo de fase líquida com um tubo de metal inerte. Defina os parâmetros aquecidos fonte ESI na caixa de controle do instrumento do software de ajuste como segue: taxa de fluxo de gás bainha 50; taxa de fluxo de gás aux 15; varrer caudal de gás 1; pulverizar tensão de 2,5 kV; temperatura capilar de 350 ° C; S-lente nível de RF 100; temperatura de aquecimento 350 ° C. Definir parâmetros de aquisição do espectrômetro de massa na janela de configuração instrumental da seguinte forma: método de duração 8 min; desviar a válvula, 3.5-6 min para espectrômetro de massa, 0-3,5 e 6-8 min para o lixo; tempo de execução 3,5 a 6 min; polaridade negativa; em tensão CID fonte de 15,0 eV; microscans 3; poder de resolução nominal (em m / z 200) 140.000; -Alvo AGC 1 x 10 6; tempo ion máximo 50 ms; número de scans 1; varredura de intervalo m / z 700-3,500; espectro de perfil tipo de dados. Definir parâmetros de cromatógrafo líquido as seguintes: Coluna de temperatura do forno 20 ° C; sample temperatura de tabuleiro de 10 ° C; programa de gradiente de 0-0,5 min 5% B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5-5 min 40-98% de B, 5-6 min 98% B, 6- 6,05 min 98-5% de B, 6,05-8 min 5% de B; taxa de fluxo 0,4 ml / min. Purge bolhas tocando o fundo dos frascos. Definir frascos de amostra no suporte de amostras e injetar 1,0 ul de uma amostra usando o amostrador automático para iniciar a análise. Abrir arquivos de dados brutos com o software navegador e confirmar que todas as aquisições são concluída com êxito, incluindo os controlos positivos e negativos. Nota: Normalmente, dois ou três picos seria observado no cromatograma corrente iónica total a um tempo de retenção de 4-5,5 minutos quando pufferfish ADN é amplificado e digerido com sucesso. 5. Deconvolution e Interpretação Inicie o software de deconvolução. Selecione o tipo de experiência "extrato de auto (isotopicamente resolvido)". Editar um método utilizando os seguintes parâmetros: a produção de massa M; S / N threshold 3 limiar abundância relativa 0; carga negativa yes; calcular extraído ion cromatograma corrente (XIC) sim; gama m / z 700-3,500; cobrar transportadora H +; número mínimo de carga detectada 3; isótopo rácio de nucleotídeos; fator de ajuste de 80%; limiar restante 0%; Considere sobreposições yes; cobrar faixa de 3-50; intensidade mínima 1; Espera erro intensidade 3. Salvar como um novo método e selecione-o. Selecione o diretório onde os arquivos existem dados brutos. Selecione os arquivos de dados brutos a serem analisados ​​e clique em "Adicionar para a Fila" botão. Clique no botão "Run" no separador 'Run Queue' para iniciar deconvolução. Depois que a fila é completada, selecione uma linha e clique em 'Resultado Open' na legenda superior para obter os resultados da deconvolução. Interpretar os resultados a partir das massas monoisotópico derivados dos picos a um tempo de retenção de 4-5,5 minutos utilizando a tabela 4.

Representative Results

Três colunas comercialmente disponíveis foram avaliados para a separação de oligonucleótidos longos a taxas de fluxo de 100-400 mL / min. Uma grande poro de octadecilo de cadeia de carbono (C 18) da coluna de partículas de sílica -bonded (a), um poli comercialmente disponível (estireno-divinilbenzeno) (PS-DVB) monólito coluna (b) e uma coluna de sílica monólito -bonded C 18 ( C) foram comparadas (Figura 1). Três pares de cadeias duplas de ADN (26, 37 e 53 pb) foram separados utilizando todas as colunas, e a sílica -bonded monólito coluna C 18 foi utilizado em estudos subsequentes. Os resultados representativos para a análise de uma amostra de ADN extraído a partir do músculo do T. rubripes é mostrado na Figura 2. isotopicamente picos resolvidos, como mostrado na figura 2a, são necessários para o cálculo com êxito a massa monoisotópica. O teórico e measured massa monoisotópico de T. rubripes são mostradas na Figura 2b. Uma vez que a digestão com as endonucleases é realizada apenas após amplificação por PCR, sem purificação, a extremidade 3'-pegajoso gerado pelo Msp I endonuclease é preenchido com a polimerase de ADN restante. De acordo com a análise de produtos de amplificação derivados de moldes de ADN sintéticos, precisão de massa variou entre -2,48 a 2,40 ppm (0,62 ± 0,74 ppm em média, n = 280). Assim, uma tolerância de massa de 3 ppm foi utilizado para a diferenciação de espécies (Tabela 4). Usando a tabela, todas as amostras pufferfish obtidos de mercados e lojas foram devidamente diferenciados como espécies específicas 37. De acordo com a análise periódica da amostra obtida a partir do modelo de ADN sintético de T. chrysops, todas as massas monoisotópico dos analitos foram determinados com sucesso dentro de ± 3 ppm por pelo leAST 180 HR, sem qualquer calibração de massa (Figura 3). Isto significa que a calibração de massa seria necessário numa base semanal. Figura 1: Total de iões cromatogramas correntes do produto de PCR-RFLP derivado a partir do modelo de ADN sintetizada de T. pardalis utilizando uma coluna C 18 -bonded de partículas de sílica (a, 3 x 250 mm, dimensão das partículas 3 micrómetros), um poli (estireno-divinilbenzeno) (PS-DVB) coluna monólito (b, 1,0 × 250 mm) e um C 18 -bonded monólito coluna de sílica (C, presente método) Condições de (a):. velocidade de fluxo de 0,2 ml / min; proporção de metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-20 min 25% -40%, 20-35 min 40% -98%, 35-50 min 98%, 50- 51 min 98% -5%, 51-65 min 5%. Condições para (b):taxa de fluxo 0,1 ml / min; proporção de metanol, 0-2 min 5%, 2-5 min 5% -25%, 5-35 min 25% -40%, 35-40 min 40% -98%, 40-55 min 98%, 55- 56 min 98% -5%, 56-70 min 5%. A temperatura para ambas as colunas foi de 20 ° C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Os resultados representativos para a análise de músculo cru de T. rubripes. (a) íon total de cromatogramas atuais típicos e espectro de massa. (B) massas monoisotópico teóricas e medidas dos produtos de PCR-RFLP derivados a partir do modelo de ADN sintetizada de T. rubripes. Por favor clique aqui para ver um grander Versão desta figura. Figura 3:. Teste de estabilidade digerido amplicões obtidos a partir do ADN sintético de T. Chrysops foram analisados ​​a cada 10 h. Calibração de massa não foi realizada durante o teste. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Nome Seqüência lago86F 5'-3'-CCATGTGGAATGAAAACACC taki114F 5'-3'-AAAAACAAGAGCCACAGCTCTAA fugu86-114R 5'-3'-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Tabela 1: PCR primers. reagentes da RCP volume utilizado A concentração final água ultrapurificada 15,75 mL sem detergente 5x Tampão 5,0 ul 1x de mistura de dNTP (10 mM cada) 0,5 ul 0,2 mM mistura de iniciadores (10 uM cada de lago86F, taki114F e fugu86-114R em tampão TE pH 8,0) 1.0 ul 0,4 uM cada DNA polimerase (2,5 unidades / ul) 0,25 mL 0,1 unidades / ul DNA molde em tampão de TE pH 8,0 (5,0-10 ng / pL de amostra extraída, 0,2 uM de ADN sintético como controlo positivo) 2,5 ul 0,5-1,0 ng / ul de ADN extraído e 20 nM para o ADN sintético Total: 25 ul Tabela 2: Componentes de uma escala de 25 ul de PCR. Ciclo Condição Função 1 2 min a 95 ° C A desnaturação inicial 2 30 s a 95 ° C desnaturação 3 30 s a 56 ° C Recozimento 4 30 s a 72 ° C Alongamento 5 Repetir 2-4 (no total 30 ciclos) 6 7 min a 72 ° C Alongamento final 7 Manter a 12 ° C até à remoção da amostra Tabela 3: programa de PCR. número de pico no tempo de retenção de 4,0-5,5 min massa monoisotópica de o terceiro pico na gama (Da) massa monoisotópica do segundo pico na gama (Da) espécies Pufferfish Strand menor maior cadeia Strand menor maior cadeia 2 → → 15890,707-15890,803 16177,531-16177,629 L. inermis 15921,702-15921,797 16146,537-16146,634 L. gloveri 15930,713-15930,809 16137,525-16137,622 L. lunaris 15937,697-15937,792 16131,537-16131,634 L. wheeleri 24173,034-24173,179 24566,905-24567,053 T. chrysops 3 16295,706-16295,804 16467,610-16467,709 11341,851-11341,919 11466,875-11466,944 T. pardalis T. snyderi T. ocellatus T. xanthopterus T. stictonotus 11654,908-11654,978 11770,920-11770,991 T. niphobles 16296,701-16296,799 16468,605-16468,704 → → T. rubripes 16311,701-16311,799 16452,610-16452,709 → → T. poecilonotus T. exascurus 16320,713-16320,811 16443,599-16443,697 → → T. porphyreus T. obscurus 16599,751-16599,851 16780,667-16780,767 → → T. vermicularis Tabela 4: A diferenciação de massas de pufferfish monoisotópico derivados de LC / ESI-MS. Tabela 5: sequência de ADN amplificado (a) a sequência é idêntica a.a das outras espécies pufferfish, conforme descrito na Tabela 4. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

Discussion

Para extrair ADN, um kit comercial para a extracção de ADN a partir de sangue e de tecidos é utilizado de acordo com o protocolo do fabricante com pequenas modificações (quantidade de proteinase K e centrifugação da solução de lise). No entanto, qualquer kit de extracção pode ser utilizado, desde que o ADN celular pode ser extraída com recuperação e pureza apropriada para PCR. Este método foi testado usando o músculo, aleta, fígado, ovário e pele 37. Barbatana é especialmente apropriado devido à grande área de superfície, o que permite a rápida lise com proteinase K. frescos, congelados, secos, cozidos e amostras pufferfish cozidos foram testados com sucesso 37.

O conjunto de primers PCR (Tabela 1) é projetado para baiacu e amplifica o gene do RNA ribossomal 16S mitocondrial de baiacu. O ADN alvo a amplificar é 114-115 pb (género Takifugu) e 86 pb (género lagocephalus) (Tabela 5). Para facilitar método development, foram utilizados oligonucleotídeos sintetizados com as sequências alvo para a referência em vez de recolher espécimes pufferfish autênticos. O conjunto de iniciadores pode ser substituído por um outro conjunto de iniciadores, em resposta ao efeito, no entanto, o comprimento final de ADN após a digestão enzimática deve ser inferior a 100 nt em termos de manutenção da qualidade do espectro de massa necessária para desconvolução bem sucedida. Além disso, a pressão de azoto no C-armadilha deve ser reduzida quando o oligonucleótido alvo é mais do que cerca de 75 nt e a qualidade do espectro de massa não é suficiente para desconvolução bem sucedida. Estas limitações podem ser controlados por meio de desenvolvimentos recentes no software do instrumento, caso contrário, a válvula para o C-armadilha no interior do chassis deve ser ajustado, como descrito na secção de protocolo. Quanto à preparação da amostra, a utilização de reagentes sem detergente é crítica para a LC subsequente em termos de formato de pico apropriado, a intensidade do pico e suficiente tempo de retenção estável 31.

<p class = "jove_content"> Um PS-DVB coluna capilar 21,24-33 monólito, um C-18 de fase inversa em coluna de sílica em partículas 23,40,41 e uma cromatograf ia de interacção hidrofóbica (HILIC) coluna 42 foram utilizados para a LC / ESI-MS análise de oligonucleótidos. Entre eles, a coluna monólito capilar é superior aos outros em termos de capacidade de separação, no entanto, a coluna monólito capilar utilizado em estudos anteriores foi feita em casa e operado a um caudal baixo (2 ul / min), o que requer instrumentação dedicado a micro LC. Para facilitar a operação fácil, colunas comercialmente disponíveis foram avaliados para a separação de oligonucleótidos longos a taxas de fluxo mais elevadas (100-400 mL / min). Três pares de cadeias duplas de ADN (26, 37 e 53 pb) foram separados usando colunas acima mencionadas, no entanto, os tempos de ciclo da coluna C 18 de partículas de sílica e a coluna -bonded PS-DVB monólito eram 65 e 70 min, respectivamente , enquanto que a da C <sub> 18 -bonded coluna de sílica monólito foi de 8 min (Figura 1). Tomando em consideração a análise rápida, a coluna de sílica monólito C 18 -bonded foi escolhido para os nossos propósitos, apesar da capacidade de separação limitada; No entanto, os restantes duas colunas podem ser empregues quando é necessária a separação melhorada. Teoricamente, no caso de uma coluna monólito, não há o volume intersticial e a fase móvel seria forçado a fluir através dos poros da fase sólida, mantendo um comprimento de percurso consistente, possibilitando assim uma separação eficiente 27. Tais processos seriam manifesta, particularmente na análise de biomacromoléculas, tais como um oligonucleótido, como o lenta difusão das moléculas grandes. Uma das vantagens práticas de uma coluna monólito é que a contra-pressão é mais baixa do que a de uma coluna de sílica em partículas 27. Apesar da elevada taxa de fluxo (400 ul / min) e baixa temperatura da coluna (20 ° C), pressão de retorno máxima dosistema foi de 12,5 MPa 37. Esta é a primeira demonstração da vantagem de uma coluna de sílica -bonded monólito C 18 para a análise rápida de um oligonucleótido de comprimento. Devido à elevada taxa de fluxo, um instrumento dedicado para micro LC e alinhamento preciso na interface não são necessários. Em vez disso, uma sonda de ESI aquecida é necessária para dissociar o duplex de DNA e auxiliar de ionização de ADN, tal como descrito mais tarde.

cromatograf ia de par iónico é comumente utilizado para a separação de MS-compatível de oligonucleótidos. No entanto, um reagente de par iónico geralmente interfere com o processo de ESI e diminui a sensibilidade de ESI-MS. Portanto, o HFIP é frequentemente utilizada para a fase móvel, para melhorar a sensibilidade do oligonucleótido. No entanto, HFIP (ponto de ebulição 59 ° C) vaporiza-se rapidamente na interface antes (ponto de ebulição 65 ° C) de metanol e, por conseguinte, esta perda de solvente aumenta o pH e promove a dissociação do reagente de par iónico (ou seja, TEA)a partir do oligonucleótido. Porque o presente método emprega uma sonda ESI aquecida, que nebuliza o eluato com azoto quente a 350 ° C, este efeito pode ser mais enfatizado. Em vez de tampão de HFIP-TEA, Erb e Oberacher recomendado etilo cyclohexyldimethylammonium (CycHDMAA; pH 8,4) para a análise de genotipagem devido a uma redução na formação de produtos de adição com os iões metálicos vestigiais 33. Os autores deduzido que em si CycHDMAA suprimida a formação do aducto de metal. Apesar da literatura, formação de aduto não significativo foi observado no presente método. Além disso, o benefício notável do sistema HFIP-TEA-metanol é que a área do pico obtido com o sistema de HFIP-TEA-metanol foi 17 vezes maior do que a obtida a partir do sistema CycHDMAA-acetonitrilo ao analisar um amplicon 86 bp de T. poecilonotus (dados não mostrados). Uma desvantagem do sistema de HFIP-TEA-metanol, no entanto, é o aumento do custo em relação ao sistema CycHDMAA-acetonitrilo.

Cálculo da massa monoisotópica requer a separação de picos isotópicos de iões de cargas múltiplas. Portanto, a resolução é crítica para a presente análise. Apesar de poder de resolução requerida é dependente do comprimento de pares de bases do analito, analisadores TOF convencionais, que têm um poder de resolução de várias dezenas de milhares de pessoas, pode ser limitado para a análise de oligonucleótidos curtos.

As massas teóricas monoisotópico mostrados na Tabela 4 foram calculados a partir das composições de base de correspondentes dos analitos. Alternativamente, Muddiman et ai. Desenvolveram uma aplicação de software para calcular a composição da base da massa 43 precisas. Um programa similar foi integrado no sistema automatizado ESI-MS 16-18. A utilização destes algoritmos pode melhorar a robustez do presente método porque uma massa monoisotópica medido nem sempre corresponde a uma base única composição óasa para a tolerância de massa de 3 ppm resultante do erro de medição inevitável. Infelizmente, não foi possível obter esses produtos de software para o presente estudo.

A presente determinação espécies baseado na massa monoisotópica podem ser adequados não só para a diferenciação de pufferfish mas também para a detecção de outros polimorfismos do ADN, porque o presente método baseia-se na análise da composição de base e não envolve um processo especialmente concebido para pufferfish. Tal como para a detecção de polimorfismos de ADN, o sistema de ESI-MS dedicado é totalmente automatizada e fácil de operar, que pode ser adequado para utilização em diagnóstico, tais como a detecção de agentes patogénicos 15,17,18,20,30. Por outro lado, o presente método é viável com instrumentos comuns de investigação e aparelhos e, portanto, adequados para usos de investigação. ESI-MS já foi aplicada ao polimorfismo de ADN humano tal como 13,28,32 single nucleotide polymorphism, repetição tandem curtas 26, E DNA mitocondrial analsis 16,19. Micro RNA também foi analisado via LC capilar / ESI-MS 44. Estas aplicações publicadas também pode ser realizado através do presente método. Além disso, este método pode ser adequado para o controlo da interacção entre os compostos de oligonucleótidos e de baixo peso molecular, tais como a interacção de antibióticos e ARN ribossomal 45 devido à separação de baixa temperatura. Em tais casos, oligonucleótidos e compostos de baixo peso molecular devem ser detectados simultaneamente, o que é uma vantagem da utilização de LC / ESI-MS.

Não há uma limitação de que a instrumentação não é adequado para a realização de análise paralelo como em técnicas convencionais, tais como a sequenciação de Sanger e PCR em tempo real. Além disso, o presente método identifica apenas a composição de base e qualquer substituição de base dentro da mesma molécula não podem ser distinguidos. No entanto, a análise de DNA baseado no MS descrito aqui ainda pode ter mérito no prazoS de precisão em comparação com a ligação técnicas à base de corantes, tais como electroforese em gel e PCR em tempo real de ADN.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research by the Japanese Society for the Promotion of Science (15K08060).

Materials

DNeasy Blood & Tissue Kit (50) Qiagen 69504 DNA extraction kit
Proteinase K Qiagen 19131
Ethanol (99.5+ vol%) Wako 054-07225 For dilution of wash buffers
TE buffer (pH 8.0) Wako 310-90023 For dilution of DNA sample
PCR primer Fasmac NA Purified with reverse-phase cartridge column by the supplier
Template DNA Eurofins Genomics NA Purified by HPLC by the supplier
Ultrapurified water NA NA Generated with a Milli-Q Direct water purification system (Merck Millipore), used for sample preparation
Detergent Free 5X Phusion HF Buffer Thermo Fisher F-520L Use instead of the provided buffer of DNA polymerase
Pfu-X DNA polymerase Jena Bioscience PCR-207S
dNTP mix (20 mM each) Jena Bioscience NA Supplied with the DNA polymerase
10× Universal buffer M Takara Bio NA Containing 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol and 500 mM NaCl
Dra I Thermo Fisher FD0224 Restriction enzyme
Msp I Thermo Fisher FD0544 Restriction enzyme
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) Fluka 42060-50ML Eluent additive for LC-MS grade.
Triethylamine (TEA) Fluka 65897-50ML Eluent additive for LC-MS grade.
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508 For preparation of calibrant.
Sodium hydroxide (1.0 M) Fluka 72082 Dilute to 10 mM with ultrapurified water and use for titration of trifluoroacetic acid.
Acetonitrile Fluka 34967 For preparation of calibrant, LC/MS grade.
Methanol Kanto 25185-76 For mobile phase, LC/MS grade.
Water Thermo Fisher W6-1 For mobile phase, LC/MS grade.
Microcentrifuge tube (0.5 ml) Eppendorf 0030123301 PCR clean grade
Microcentrifuge tube (1.5 ml) Eppendorf 0030123328 PCR clean grade
UVette Eppendorf 0030106300 Disposable UV cuvette.
Gel Green Biotium 41004 Fluorescent DNA stain
Cosmospin filter G (0.2 μm) Nakalai Tesque 06549-44 Made of hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane. Any centrifugal filter unit (pore size, 0.2–0.5 μm) made of hydrophilic PTFE or another low-binding membrane is applicable.
300-μl PP screw vial American Chromatography Supplies V0309P-1232
Preassembled screw cap and septa Finneran 5395-09R
Monobis C18 analytical column (2.0×50 mm, mesopore size = 30 nm) Kyoto Monotech 2050H30ODS Outside Japan, available for purchase from GL Sciences via its distributors. (http://www.glsciences.com/distributors/)
Monobis C18 guard column Kyoto Monotech GCSET-ODS3210 Holder included.
Cadenza CW-C18 (3.0×250 mm) Imtakt CW036 C18-bonded particulate silica column
ProSwift RP-4H (1.0×250 mm) Thermo Fisher 066640 Poly(styrene-divinylbenzene) monolith column
Themo Mixer C Eppendorf 5382 000.023 For digestion of fish tissues.
Spectrophotometer Shimadzu UV-3150 Quantification of DNA concentration.
Thermal cycler Bio-Rad T100
Portable refrigerator Twinbird D-CUBE For aqueous mobile phase to avoid evaporation of HFIP. This can be replaced by an ice box.
Ultimate 3000 liquid chromatograph Thermo Fisher NA
Q Exactive mass spectrometer Thermo Fisher NA Fourier transform mass spectrometer equipped with the modified Kingdon trap analyzer.
Protein deconvolution 3.0 Thermo Fisher NA Use version 3.0 or higher having an isotopic patter model of nucleotide.
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Puffer Fish GenotypingToxic Puffer FishPCR-RFLPLiquid Chromatography/mass SpectrometryDNA ExtractionUV SpectrophotometryAnalytical ColumnReagent Contamination

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Miyaguchi, H. Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (115), e54402, doi:10.3791/54402 (2016).
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