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Biochemistry

La selección de alto rendimiento de los hidratos de carbono-El uso de enzimas que degradan la novela insoluble cromogénico sustrato de ensayo Kits

Published: September 20, 2016
doi:
10.3791/54286
, ,
1Department for Plant and Environmental Sciences,University of Copenhagen, 2School of Agriculture, Food and Rural Development,Newcastle University

Summary

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Abstract

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme’s biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

Introduction

Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.

We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.

One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8.

The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).

CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.

Protocol

1. ensayo cromogénico con CPH sustratos en un formato de placa de 96 pocillos La activación de la placa de kit de ensayo Activar el filtro de 96 pocillos (que contiene azul CPH-xilano) placa kit de ensayo (Lista de Materiales) mediante la adición de solución de 200 l de activación (obtenido con el kit) en cada pocillo, seguido de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente sin agitación. Aplicar vacío usando un colector de vacío (con el bloque espaciador dentro y cualquier estándar, transparente placa de 96 pocillos como una placa de recogida) para eliminar la solución de activación existente. También es posible utilizar una centrífuga a 2700 xg durante 10 min para este paso en lugar del colector de vacío. Lavar los sustratos CPH mediante la adición de 100 l de agua estéril y aplicar vacío (o fuerza centrífuga) para eliminar el estabilizador. Repita este paso dos veces más y las placas están ya listos para su uso. La reacción enzimática NOTA: Siempre incluya amortiguarsolo como control negativo y si es posible enzimas previamente caracterizados como controles positivos. Utilice un número estadísticamente adecuado de recipientes. Los sustratos CPH son estables entre pH 3,0 a 10,0 y el volumen total de solución de enzima final de tampón en cada pocillo no debe exceder de 180 l. extracto vegetal o caldo de cultivo también se pueden utilizar en lugar de solución de enzima purificada. Añadir 150 l 100 mM de tampón de acetato de sodio, pH 4,5 y 5 l solución -cellulase endo (a una concentración final de 1 U / ml) a cada pocillo de la placa de kit de ensayo. Coloque la placa de producto (una placa de pocillos claro compatible con el lector de placa de microtitulación) debajo de la placa kit de ensayo para recoger cualquier fuga potencial de la placa de reacción durante la agitación. Incubar la placa kit de ensayo a 25 ° C durante 30 min en un agitador horizontal a 150 rpm. NOTA: La mezcla de la reacción en la placa kit de ensayo durante la incubación es crucial para lograr un consistente y reproresultado ducible. CPH sustratos son utilizables hasta 90 ° C. El tiempo de incubación debe ser aumentada hasta 24 hr al probar caldos de cultivo que contienen concentraciones de enzima con sustratos desconocidos CPH. Tenga en cuenta que los tiempos de incubación apropiados dependen de la actividad de la enzima (s), pero en general, si no hay ninguna actividad detectable dentro de 24 horas, es probable que la enzima no se degradará el sustrato ensayado. Una enzima activa está degradando los polisacáridos cromogénicos insolubles del sustrato CPH en oligosacáridos cromogénicos solubles, que son visibles como sobrenadante de color. Coloque la placa de producto limpio el interior del colector de vacío con el bloque espaciador interior. Coloque la placa kit de ensayo en la parte superior y aplicar vacío (presión negativa máxima de -60 kPa). También es posible utilizar una centrífuga a 2700 xg durante 10 min. NOTA: El filtrado que contiene los oligosacáridos de color como producto de reacción se encuentra ahora en la placa de producto para su posterior análisis 8 </sarriba>. Detección y cuantificación Compruebe que el volumen de líquido en cada pocillo de la placa de producto es aproximadamente la misma mediante inspección visual. Leer la absorbancia de la placa de recogida a 595 nm para el azul CPH-xilano utilizando un lector de placas. Al hacer el análisis de datos, restar los búfer de sólo los valores de control negativo de los valores de los pozos que se añadió una enzima. Calcular el valor medio y el error estándar de las medias (SEM) de los pocillos replicados 8. 2. Ensayo cromogénico con ICB Sustratos en un formato de 96 pocillos La reacción enzimática Añadir el 150 l 100 mM de tampón de acetato de sodio, pH 4,5 y 5 l 31 U / ml endo -xylanase solución a cada pocillo de la placa de kit de ensayo que contiene paja ICB-trigo rojo (concentración final de enzima en el pozo: 1 U / ml) . NOTA: Las placas kit de ensayo (filtro de 96 pocillos plates que contienen sustratos LPI) están fabricados como se describe en la literatura (ver Lista de Materiales). Los sustratos de LPI son estables en tampones con un rango de pH entre pH 3,0 a 10,0. Siempre incluya tampón solo como control negativo, enzimas comerciales como control positivo y el uso de un número estadísticamente apropiado de réplicas. No activar los sustratos de LPI como la placa de sustrato CPH, pero eliminar el estabilizador por lavado tres veces con 100 l de agua seguido por filtración a vacío o centrifugación. Coloque la placa de producto por debajo de la placa de sustrato para recoger cualquier fuga potencial de la placa de sustrato durante la agitación. Incubar la reacción a 25 ° C con agitación a 150 rpm durante 2 hr. NOTA: Una enzima activa está degradando los polisacáridos insolubles cromogénicos en el sustrato ICB en oligosacáridos solubles, que son visibles en forma de sobrenadante de color. sustratos de LPI son utilizables hasta 90 ° C. La incubación tIME debería incrementarse hasta 24 horas si se utilizan enzimas no purificada como caldos de cultivo. Coloque la placa de producto en el interior del colector de vacío con el bloque espaciador interior. Colocar la placa kit de ensayo en la parte superior y aplicar vacío (presión negativa máxima de -60 kPa) o usar una centrífuga para filtrar el producto de la placa de kit de ensayo en el pocillo de la placa de producto. NOTA: El filtrado que contiene los oligosacáridos de color como producto de reacción se encuentra ahora en la placa de recogida para su posterior análisis 8. Detección y cuantificación Compruebe que el volumen de líquido en cada pocillo de la placa de recogida es aproximadamente la misma mediante inspección visual. Leer la absorbancia de la placa de recogida a 517 nm para la paja de trigo ICB-roja usando un lector de placas. Al hacer el análisis de datos – restar el tampón – sólo los valores de control negativo de los valores de los pocillos en los que una enzimafue añadido. Calcular el valor medio y el error estándar de las medias (SEM) de los pocillos replicados 8. NOTA: En el caso de la detección de enzimas desconocidas, se sugiere hacer una serie de diluciones con el fin de obtener datos más detallados sobre el rango dinámico de la actividad de la enzima.

Representative Results

El alto rendimiento y la capacidad de multiplexación de este ensayo se basa en insoluble polímero cromogénico (o proteína) de hidrogel de sustratos (CPH) dispuestas en placas de filtro de 96 pocillos. Las enzimas, así como controles negativos se añaden a la placa de kit de ensayo (Figura 1A) y las enzimas degradan el correspondiente sustrato producir un sobrenadante de color (Figura 1B). Una vez finalizada la reacción, el sobrenadante se transfiere a una placa de producto bien clara y la absorbancia se puede medir directamente usando un espectrofotómetro adecuado para placas de 96 pocillos (Figura 1C). Un ejemplo de una respuesta a la dosis de CPH-arabinoxilano de xilanasa a diferentes concentraciones de la enzima (0,00-0,75 U / ml) se muestra en la figura 1D donde la concentración de enzima disminución puede observarse visualmente. A quant espectrofotométrico más detalladaficación se puede utilizar para trazar la absorbancia frente a la concentración de enzima (Figura 1E). La intensidad de la señal corresponde a la actividad de la enzima. La reproducibilidad del ensayo se muestra por las barras de error (error estándar de la media, SEM, de tres réplicas). Experimentos más detallados sobre la reproducibilidad de este ensayo se publican en otro lugar 8. Figura 1. tratamiento con xilanasa de CPH-arabinoxilano. A) Un esquema de la placa de kit de ensayo con el sustrato CPH (por ejemplo, CPH-arabinoxilano) cargado en pocillos de placas de filtro de 96 pocillos antes de la adición de enzimas 1 y 2 y el tampón el control -sólo (enzima 1 tuvo una actividad -xylanase endo); B) la degradación de CPH-arabinoxilano por la enzima 1 produce un sobrenadante de color; C) a filtrat asistida por vacíoion de los sobrenadantes en a la placa de producto, la absorbancia se mide espectrofotométricamente; D) la placa de producto que contiene los productos de reacción después del tratamiento de CPH-arabinoxilano en 4 colores diferentes con diferentes concentraciones de endo -β-1,4-xilanasa en 100 mM tampón de acetato de sodio, pH 4,5 durante 60 minutos a temperatura ambiente;. E) la cuantificación de los productos de reacción de D utilizando espectrofotometría Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Hay diferentes opciones para el uso de este ensayo en la detección de la enzima. Una opción es el uso de una placa de 96 pocillos que contiene diferentes polisacáridos para la detección, por ejemplo, un pequeño número de (purificada) endo -enzimas con actividad desconocida. En este caso el resultado se muestra que los polisacáridos son Degradcapaz por la enzima diana. Para mostrar este principio, un -cellulase endo se ensayó frente a diferentes sustratos CPH a 25 ° C. Tres concentraciones diferentes de la enzima (0,5 U / ml, 1,0 U / ml y 5 U / ml) se incubaron durante 30 min. El resultado es claramente visible en la placa de producto (Figura 2A). La hoja de producto para este endo -cellulase proporcionado por el proveedor especifica lado a la actividad de xiloglucano (tamarindo), cebada β-glucano, glucomanano, xilano de abedul y del lado de baja actividad económica de galactomanano. En consonancia con esto, se encontró que la actividad adicional a celulasa contra CPH-β-glucano (cebada), CPH-xiloglucano (tamarindo), CPH-xilano (madera de haya) y baja actividad frente a CPH-galactomanano (Figura 2B). El glucomanano no ha sido probado. Los mismos sustratos CPH fueron digeridos con enzimas disponibles comerciales (tres diferentes concentraciones de enzima: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml y 1,0 U / ml) se utilizaron como controles positivos en las mismas condiciones que la anteriorexperimentar. Todos los sustratos fueron degradados por la enzima de control positivo y la intensidad de la señal aumentaron correspondiente a una mayor concentración de enzima (Figura 2C). Figura 2. Ocho diferentes sustratos CPH se incubaron con agitación a 25 ° C durante 30 min. A) La placa de producto de diferentes sustratos CPH digeridos con una endo -cellulase, a diferentes concentraciones. B) Cuantificación de la actividad y varios actividad lado de la endo -cellulase. Las barras de error representan el error estándar de la media de tres réplicas C) actividad de diferentes enzimas comerciales al sustrato CPH correspondiente (endo-celulasa y 2-HE-celulosa;. E-LAMSE y CPH-paquimano, CPH-curdlano, CPH- β-glucano (cebada); e-XYAN4 y CPH-xilano, e-XEGP y CPH-xiloglucano, E-BLAAM y CPH-amilosa, E-BMACJ y CPH-galactomanano; todas las enzimas de Megazyme). Las barras de error representan el error estándar de la media de las dos réplicas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Los biomasa cromogénico (ICB) sustratos insolubles son una adición útil al repertorio sustrato cromogénico, ya que conservan en parte la disposición natural de polisacáridos de las paredes celulares vegetales que son el componente principal de la biomasa. CPH y LPI sustratos se utilizan en nuestro ejemplo para analizar las enzimas secretadas de Phanerochaete chrysosporium cuando se cultiva en medio líquido. La configuración de la placa de la placa de kit de ensayo se muestra en la Figura 3A, con 19 CPH sustratos y sustratos 5 de LPI (4 pocillos para cada sustrato, la Figura 3B). P. Chrysosporium fue cultivated durante tres días y luego se analizó el sobrenadante del cultivo. Por lo tanto, 125 l de tampón 200 mM se transfirió a cada sobrenadante de cultivo bien y 25 l añadió. Tres condiciones de pH diferentes se han probado usando tampón de acetato de sodio pH 4,0, tampón de fosfato de sodio pH 6,0 o pH 8,0 (Figura 3C). La placa se incubó agitación (150 rpm) a 25 ° C durante 2 hr. Los productos de reacción se transfirieron a la placa de producto (Figura 3D) y se analizaron. P. chrysosporium produce enzimas para la degradación de diversos glucanos, almidón y xilanos (Figura 3E). las señales más bajas podrían ser detectados para el arabinano hemicelulosas (remolacha azucarera) y galactano péctico, así como para RGI (soja). Las enzimas producidas eran más activos en condiciones ácidas (pH 4,0) que en condiciones neutras o ligeramente básica (pH 8,0). La menor actividad hacia sustratos de LPI (Figura 3F)demuestra que cuando los polisacáridos están en un contexto más natural, la eficiencia de la enzima no es la misma que con un polisacárido puro y es por eso sustratos ICB demuestran una visión más realista en la eficiencia de la enzima, si se aplicó a crudo o pre- material de la planta tratada. Figura 3. Proyección de un sobrenadante de cultivo de un cultivo líquido de edad de 3 días de Phanerochaete chrysosporium utilizando una placa de sustrato que contiene múltiples CPH 19 y 5 sustratos de LPI. A) Un esquema de la configuración de la placa con 4 pocillos para cada individuo sustrato (fondo gris = sustratos CPH, fondo naranja = sustratos ICB). B) Imagen de la placa de ensayo que contiene el sustrato. C) Esquema que muestra las condiciones de tampón utilizadas en este experimento (Se detectaron 200 mM acetato de sodio pH 4,0, fosfato de pH de sodio 6,0 y fosfato de sodio pH 8,0). D) la imagen de la placa de producto después de 2 horas a 25 ° C. E) absorbancias a 517 nm y se representó para cada sustrato CPH individual y F resultados ICB) de sustrato para las enzimas respectivas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Los sustratos cromogénicos también se pueden utilizar para estudiar los efectos sinérgicos mediante el uso de una mezcla de diferentes sustratos CPH de color en un pocillo y analizar el sobrenadante de reacción después del tratamiento con enzimas individuales o una enzima cócteles. En el siguiente ejemplo se muestra en la Figura 4, rojo CPH-celulosa y sustratos amarillo CPH-xilano se mezclaron juntos en un aproximadamente equal cociente en 96 pocillos pocillos de la placa de filtro. La figura 4A muestra los productos de reacción de color tras el tratamiento 1 hr a temperatura ambiente sin enzima (control), cel celulosa (2 U / ml), xyl xilanasa (1 U / ml) y una mezcla de ambas enzimas (3 repeticiones para cada enfoque) en tampón de acetato de sodio 100 mM pH 4,5. Para el análisis, el producto de reacción se cuantificó espectrofotométricamente mediante el escaneo del espectro de absorbancia de 350 nm a 700 nm (Figura 4B). A menudo, la inspección visual solo puede dar una indicación de si la enzima está actuando sobre uno o varios sustratos, sin embargo registró espectros de absorbancia derivados de diferentes tintes también se puede resolver utilizando regresión lineal simple 8 para dar una indicación más precisa de la extensión de la degradación de cada sustrato de la mezcla. El uso de sustratos CPH como mezclas sustancialmente añade al caudal de la prueba, lo que permite screening contra un máximo de 4 sustratos diferentes en un experimento (un bien). En el ejemplo mostrado son cuatro sustratos diferentes utilizados: CPH-β-glucano azul (cebada), amarillo CPH-xilano (madera de haya), verde CPH-amilosa y galactan CPH-pectico rojo (altramuz). El diseño de la placa de sustrato se muestra en la Figura 4C y una imagen de la placa de ensayo en la Figura 4D. La reacción se realizó en tampón de acetato de sodio 100 mM pH 4,5 durante 30 min a 25 ° C y 150 rpm. Enzimas individuales en primer lugar con el aumento de la concentración de enzima se probaron con el sustrato correspondiente CPH (Figura 4E) y el sobrenadante de color fue recibido como se esperaba en la placa de producto (Figura 4F, fila 1A – 12D). Fila E contenía las dos diferentes sustratos CPH amarilla CPH-xilano y azul CPH-β-glucano, que se degrada con diferentes proporciones de las correspondientes enzimas endo-glucanasa y endo -xylanase. Después de la reacción, el resultado es visibLe en la placa de producto: el color del producto de reacción era más oscuro, verde y azul, cuando más endo-glucanasa estaba presente (Figura 4F, 4E-6E) y se convirtió en un encendedor de color amarillo-verde, cuando la concentración -xylanase endo aumentó ( Figura 4F, 10-12E). Lo mismo se ve en la fila F, donde los dos sustratos roja galactano CPH-pectico y amarillo CPH-xilano se degradaron con endo -galactanase y endo -xylanase. Los cuatro sustrato CPH color diferente estaban presentes (Figura 4F, 1G-12F) y las enzimas individuales degrada el sustrato CPH apropiado y mediante la adición de enzimas adicionales se recibió una combinación de los productos de reacción de color. Figura 4. Una combinación de dos sustratos diferentes CPH, rojo CPH-celulosa y amarillo CPH-xilano, tratados con diferentes enzimas. UN) Sobrenadantes de reacción después del tratamiento de dos sustratos con endo -cellulase (cel) o endo -xylanase (Xyl) o ambas enzimas. B) espectros de absorbancia de los sobrenadantes de reacción. Una combinación de cuatro sustratos diferentes CPH tratados con diferentes enzimas C) Esquema de la placa de sustrato que contiene los sustratos CPH:. Azul CPH-β-glucano (cebada), amarillo CPH-xilano (madera de haya), verde CPH-amilosa y CPH- roja galactano péctico (altramuz) D) Imagen de la placa de ensayo que contiene los diferentes sustratos CPH E) Esquema de la placa de producto en la que la relación de las enzimas añadidas (concentraciones nominales (NC):.. glu = 1 U / ml endo-glucanasa, Xil = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo-amilasa y gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Imagen de la placa de producto después de 30 minutos de incubación a 25 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. sustrato Fuente CPH-2-hidroxietil N / A (CPH-2-HE-celulosa) CPH-amilopectina patata CPH-amilosa patata CPH-arabinano remolacha azucarera CPH-arabinoxilano trigo CPH-caseína leche bovina CPH-quitosano origen animal CPH-curdlan Alcaligenes faecalis CPH-dextrano Leuconostoc spp. </em> CPH-galactomanano algarroba CPH-laminarina Laminaria digitata CPH-liquenano musgo de Islandia CPH-metilcelulosa N / A CPH-paquimano Poria cocos galactan CPH-pectico patata CPH-pululano Aureobasidium pullulans CPH-ramnogalacturonano I (RG I) patata CPH-ramnogalacturonano I (Gal) * patata CPH-ramnogalacturonano de soja CPH-xilano madera de haya CPH-xiloglucano Tamarindo CPH-β-glucano a partir de cebada cebada CPH-β-glucano de avena avena </td> CPH-β-glucano de levadura levadura ICB-Arabidopsis Hojas en roseta de Arabidopsis thaliana Col-0 (planta adulta) semillas de Arabidopsis-ICB Arabidopsis thaliana ICB-bagazo Saccharum officinarum (planta adulta seca, tallo y hojas) ICB-celulosa cristalina (papel de filtro) papel comercial Whatman 3MM Chr Cromatografía semillas de alholva-ICB Trigonella spp. Semillas ICB-cáñamo Cannabis spp. (Planta adulta seca, tallo y hojas) semillas de altramuz-ICB Lupinus angustifolius semillas ICB-polen de P. pratense Phleum pratense polen ICB-abeto Picea spp. (Mitronco de un árbol LLED) ICB-tabaco hojas de Nicotiana benthamiana de (planta joven) paja de trigo ICB Triticum spp. (Planta adulta seca, tallo y hojas) ICB-sauce Salix spp. (Planta adulta secado, tronco de árbol molida) ICB-Sorgo Sorghum spp. (Hojas de la planta adulta) (cadenas laterales de β-1,4-D-galactano retirados con endo -β-1,4-D-galactanasa) * Tabla 1. Lista de cromogénicos disponibles polímero de hidrogel (CPH) y sustratos cromogénicos insoluble Biomasa (ICB).

Discussion

Estamos utilizando una nueva generación de CPH y ICB sustratos de varios colores que están basadas en colorantes clorotriazina (lista completa de los sustratos de la Tabla 1) dispuesto en un kit de ensayo comercial de diseño personalizado. La digestión enzimática de los sustratos produce productos pequeños, solubles, teñidos que son detectables en la solución de ensayo y se pueden cuantificar usando un lector de placas 9. Este ensayo está diseñado para la evaluación de enzimas endo-actuando y la sensibilidad del ensayo es similar al uso de una azurina reticulado (AZCL) sustratos 10, mientras que otros métodos están disponibles para exo enzimas-actuando 11,12. La limitación de este kit de ensayo se encuentra en la detección de la actividad endo -enzyme, como CPH, así como los sustratos de LPI no son degradables por exo -enzimas muy probablemente debido al impedimento estérico que surge de las moléculas de colorante y el reticulante 8.

El ensayo se realiza en un 96-well formato y las reacciones individuales se llevan a cabo en los pocillos. La reacción tiene que ser mezclado en la placa para recibir datos reproducibles. Los sobrenadantes resultantes se filtran en una placa de producto donde la absorbancia de cada pocillo se puede cuantificar utilizando la espectrometría de absorbancia. Los principios básicos y el diseño del ensayo se muestran en la Figura 1. El ensayo consiste en una placa de ensayo (una placa de filtro de 96 pocillos) con los sustratos, y después de la incubación con las enzimas, el sobrenadante se filtra a través en una placa clara y las absorbancias se leen proporcionar una medición semi-cuantitativa de la especificidad y la actividad de la enzima. Se ha demostrado, que este ensayo de selección utilizando sustratos CPH puede también ser utilizado en un formato de placa de agar, en donde los productos de reacción solubles crean un halo de color después de la incubación durante la noche. 8

Los kits de ensayo se pueden utilizar para detectar enzimas purificadas y sus secundarios potenciales actividades como se demuestra enLa Figura 2. Secundarios actividades pueden surgir de una sola enzima y su especificidad promiscua, sino también de un hecho que la muestra analizada es una mezcla de diferentes enzimas y su efecto sinérgico necesita ser estudiado. Adicionalmente, como se ha demostrado en estudios anteriores, que los cócteles de enzimas, la microbiota intestinal 13 y cultura caldos de hongos 8, así como enzima vegetal endógeno y bacterias (datos no publicados) se pueden utilizar como una fuente de enzima.

sustratos ICB abordan mezclas complejas de componentes de la pared celular se encuentran a menudo en los procesos industriales de la descomposición de la biomasa. Estos sustratos están diseñados para evaluar la disponibilidad de polisacáridos y proporcionar información acerca de cómo optimizar efectivamente cócteles de degradación para la salida de la degradación más eficiente. Como se ilustra en la Figura 3 CPH y LPI sustratos se pueden utilizar en el lado de detección de la enzima a lado – que revela una gran cantidad de información acerca de una especificidad enzimáticaactividad d tanto en el contexto de el sustrato preferido (CPH) y un complejo de más natural que contiene otros componentes además de el sustrato preferido imitando más a un ensamblaje macromolecular encuentra en la naturaleza (ICB). El uso de múltiples colores permite la detección simultánea de diferentes actividades enzimáticas en contra de varios sustratos que aumenta el alto rendimiento y la multiplicidad del ensayo. Spectra de diferentes tintes se puede resolver mediante regresión lineal simple y en la mayoría de los casos la actividad multi-sustrato se puede observar por inspección visual solo. Un ejemplo simulado de un experimento de este tipo y sus resultados se representa en la Figura 4.

Esta caja de herramientas de ensayo y la versatilidad de su aplicación son muy adecuadas para el cribado de primer nivel de las enzimas y los caldos de cultivo con actividades desconocidas. Los aspectos más importantes de este ensayo son su naturaleza de alto rendimiento, de personalización, facilidad de uso y la flexibilidad. Con esto en mente, we cree que este nuevo conjunto de herramientas mejorará en gran medida y acelerar los procesos enzimáticos de detección en aplicaciones industriales, así como aplicaciones académicas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer al Prof. J. Paul Knox (Universidad de Leeds, Reino Unido), que proporciona acceso a sus laboratorios para el rodaje, y Susan E. Marcus por su excelente asistencia técnica. JS reconoce el proyecto WallTraC (VII Programa Marco de la Comisión Europea (acuerdo de subvención. No: 263916) y la biomasa proyecto de siglo 21 (Innovación fundación Dinamarca, y el caso no .: 103408) SKK está agradeciendo el proyecto SET4Future (Consejo Danés de Investigación Estratégica), la estratégica Bio-Valor fundada por el Consejo danés de Investigación estratégica, el Consejo danés para la Tecnología y la Innovación (Grant Caso nº .: 0603-00522B), y un enfoque de Biología impulsada para comprender la degradación enzimática del complejo polisacárido Sistemas (Grant Caso sin .:. 107279) para la financiación de este trabajo se refleja puntos de vista de los autores sólo la Unión Europea no se hace responsable del uso que pueda hacerse de la información contener el presente documento..

Materials

assay kit plates Glycospot customized assay kit plates
activation solution Glycospot for activating CPH substrates
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold Pall Corporation 5015 spacer block
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile Millipore MSHVN4510 assay plate
96-Well Microplates, Polypropylene Greiner Bio-One 651201 collection plate after washing the substrates
Nunc™ MicroWell™ 96-Well Microplates Thermo Scientific 269620 product plate
Diaphragm pump MZ 2 NT Vacuubrand 732000 vacuum pump used with the vacuum manifold
Infors HT Ecotron Infors HT 4950132 (Buch & Holm) horizontal shaker
SpectraMax M5 Molecular Devices 10067-750 (VWR) 96-well plate absorbance reader
Vacuum manifold Pall Corporation 5017 vacuum manifold
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) Megazyme E-CELTR cellulase [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus)  Megazyme E-BMACJ mannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) Megazyme E-LAMSE β-glucanase [glu]
endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger)  Megazyme E-EGALN galactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger)  Megazyme E-XYAN4 xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)  Megazyme E-XEGP xyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis)  Megazyme E-BLAAM amylase [amy]
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References

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High-throughput ScreeningCarbohydrate-degrading EnzymesNovel Insoluble Chromogenic Substrate Assay KitsEnzyme DiscoveryBiomass DegradationChromogenic SubstratesEndo-cellulaseICB-wheat StrawAbsorbancePlate Reader

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Schückel, J., Kračun, S. K., Willats, W. G. T. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. Vis. Exp. (115), e54286, doi:10.3791/54286 (2016).
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