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Biochemistry

High-throughput screening degli enzimi carboidrati di degradazione Utilizzando Novel insolubile Chromogenic Substrate Assay Kit

Published: September 20, 2016
doi:
10.3791/54286
, ,
1Department for Plant and Environmental Sciences,University of Copenhagen, 2School of Agriculture, Food and Rural Development,Newcastle University

Summary

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Abstract

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme’s biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

Introduction

Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.

We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.

One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8.

The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).

CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.

Protocol

1. Cromogenico Assay con CPH substrati in una zolla formato a 96 pozzetti L'attivazione della piastra kit di analisi Attivare il filtro a 96 pozzetti (contenente blu CPH-xilano) kit di analisi piastra (elenco dei materiali) con l'aggiunta di una soluzione 200 ml di attivazione (ottenuti con il kit) in ciascun pozzetto, seguita da 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente senza agitazione. Applicare vuoto usando un collettore di vuoto (con il blocco distanziale dentro e qualsiasi standard, trasparente piastra a 96 pozzetti come piastra di raccolta) per rimuovere soluzione di attivazione esistente. È anche possibile utilizzare una centrifuga a 2.700 xg per 10 min per questa fase invece del collettore del vuoto. Lavare i substrati CPH aggiungendo 100 microlitri di acqua sterile e applicare il vuoto (o la forza centrifuga) per rimuovere lo stabilizzatore. Ripetere questa operazione altre due volte e le piastre sono ora pronti per l'uso. reazione enzimatica NOTA: includere sempre il tamponesolo come controllo negativo e, se possibile enzimi precedentemente caratterizzati come controlli positivi. Utilizzare un numero statisticamente adeguato di repliche. I substrati CPH sono stabili tra pH 3,0 al 10.0 e il volume totale di soluzione enzimatica fine buffer in ciascun pozzetto non dovrebbe superare 180 microlitri. estratto vegetale o brodo di coltura possono anche essere utilizzati al posto della soluzione enzima purificato. Aggiungere 150 microlitri 100 mM tampone di acetato di sodio, pH 4,5 e 5 microlitri endo soluzione -cellulase (ad una concentrazione finale di 1 U / ml) a ciascun pozzetto della piastra kit di analisi. Mettere la piastra di prodotto (una piastra chiara ben compatibile con il lettore di micropiastre-plate) sotto la piastra kit di analisi per raccogliere qualsiasi potenziale perdita dalla piastra di reazione durante l'agitazione. Incubare la piastra kit di test a 25 ° C per 30 minuti in un agitatore orizzontale a 150 rpm. NOTA: Miscelazione reazione nella piastra kit di analisi durante l'incubazione è essenziale per ottenere una costante e reprorisultato riducibile. substrati CPH sono stabili fino a 90 ° C. Il tempo di incubazione dovrebbe essere aumentata fino a 24 ore durante il test brodi di coltura contenente concentrazioni enzimatiche sconosciuti con substrati CPH. Si noti che appropriati tempi di incubazione dipendono dall'attività dell'enzima (s), ma in generale se non c'è attività rilevabile entro 24 ore, è probabile che l'enzima non si degradano il substrato testato. Un enzima attivo è degradante polisaccaridi cromogeni insolubili del substrato CPH in oligosaccaridi cromogenici solubili, che sono visibili come supernatante colorato. Posizionare la piastra prodotto pulito all'interno del collettore del vuoto con il blocco distanziale all'interno. Posizionare il kit piastra di analisi sulla parte superiore e applicare il vuoto (pressione negativa massima di -60 kPa). È anche possibile utilizzare una centrifuga a 2.700 xg per 10 min. NOTA: Il filtrato contenente oligosaccaridi colorati come prodotto di reazione è ora nella piastra prodotto per ulteriori analisi 8 </sup>. Individuazione e la quantificazione Verificare che il volume di liquido in ciascun pozzetto della piastra prodotto è circa la stessa mediante ispezione visiva. Leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 595 nm per il blu CPH-xilano utilizzando un lettore di piastre. Quando si effettua l'analisi dei dati, sottrarre il buffer-unici valori di controllo negativo dai valori dai pozzetti in cui è stato aggiunto un enzima. Calcolare il valore medio e l'errore standard di mezzi (SEM) dai pozzetti replicati 8. 2. Cromogenico Assay con ICB substrati in un formato a 96 pozzetti reazione enzimatica Aggiungere 150 microlitri 100 mM tampone di acetato di sodio, pH 4,5 e 5 microlitri 31 U / ml endo -xylanase soluzione a ciascun pozzetto della piastra kit di analisi contenente paglia rosso ICB grano (concentrazione dell'enzima finale nel pozzetto: 1 U / ml) . NOTA: Le piastre kit di analisi (filtro a 96 pozzetti plAtes contenenti substrati ICB) sono realizzati come descritto in letteratura (vedi elenco dei materiali). I substrati ICB sono stabili nel buffer con un intervallo di pH compreso tra pH 3,0 e 10,0. Sempre includere tampone da solo come un controllo negativo, enzimi commerciali come controllo positivo e utilizzare un numero statisticamente adeguato di repliche. Non attivare i substrati ICB come la piastra di supporto CPH, ma rimuovere lo stabilizzatore lavando tre volte con 100 ml di acqua seguita da filtrazione sotto vuoto o centrifugazione. Mettere la piastra di prodotto sotto la piastra di supporto per raccogliere qualsiasi potenziale perdita dalla piastra di supporto durante l'agitazione. Incubare la reazione a 25 ° C agitando a 150 rpm per 2 ore. NOTA: Un enzima attivo è degradante i polisaccaridi insolubili cromogeniche nel substrato ICB in oligosaccaridi solubili, che sono visibili come surnatante colorato. substrati ICB sono stabili fino a 90 ° C. L'incubazione time dovrebbe essere aumentato fino a 24 ore se si utilizzano gli enzimi non purificato, come brodi di coltura. Posizionare la piastra prodotto all'interno del collettore del vuoto con il blocco distanziale all'interno. Posizionare il kit piastra di test sopra, applicare il vuoto (pressione negativa massima di -60 kPa) o utilizzare una centrifuga per filtrare il prodotto dalla piastra kit di analisi nel pozzo della piastra prodotto. NOTA: Il filtrato contenente oligosaccaridi colorati come prodotto di reazione è ora nella piastra di raccolta per ulteriori analisi 8. Rilevamento e la quantificazione Verificare che il volume di liquido in ciascun pozzetto della piastra di raccolta è circa la stessa mediante ispezione visiva. Leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 517 nm per il rosso paglia ICB-grano utilizzando un lettore di piastre. Quando si effettua l'analisi dei dati – sottrarre il tampone – solo i valori di controllo negativo dai valori dai pozzetti in cui un enzimaè stato aggiunto. Calcolare il valore medio e l'errore standard di mezzi (SEM) dai pozzetti replicati 8. NOTA: Nel caso di screening di enzimi sconosciuti, si consiglia di effettuare una serie di diluizioni al fine di ottenere dati più dettagliati circa la gamma dinamica dell'attività dell'enzima.

Representative Results

L'alta produttività e la capacità di multiplexing di questo test si basa su insolubile polimero cromogenico (o proteine) idrogel (CPH) substrati disposti in piastre filtranti da 96 pozzetti. Enzimi così come controlli negativi vengono aggiunti alla piastra kit di analisi (Figura 1A) e gli enzimi degradano corrispondente substrato producendo un surnatante colorata (Figura 1B). Dopo che la reazione è terminata, il supernatante viene trasferito in una piastra prodotto chiaro pozzetti e l'assorbanza può essere misurata direttamente mediante uno spettrofotometro adatto per piastre a 96 pozzetti (Figura 1C). Un esempio di risposta dose di CPH-arabinoxilano per xilanasi a diverse concentrazioni di enzima (0.00 – 0.75 U / ml) è mostrato in figura 1D in cui la concentrazione dell'enzima discendente può essere osservato visivamente. Una più dettagliata quant spettrofotometricaification può essere usato per tracciare l'assorbanza rispetto alla concentrazione di enzima (Figura 1E). L'intensità del segnale corrisponde all'attività enzimatica. La riproducibilità del test è indicato dalle barre di errore (errore standard della media, SEM, di tre repliche). Esperimenti più dettagliate sulla riproducibilità di questo test sono pubblicati altrove 8. Figura 1. trattamento Xylanase di CPH-arabinoxilano. A) Uno schema della piastra kit di analisi con il substrato CPH (ad esempio, CPH-arabinoxilano) caricato in pozzetti della piastra filtrante a 96 pozzetti appena prima l'aggiunta di enzimi 1 e 2 e il buffer controllo -solo (enzima 1 aveva attività -xylanase endo); B) degradazione di CPH-arabinoxilano da enzima 1 ha prodotto un surnatante di colore; c) su filtrat vuoto-assistitaione dei supernatanti in alla piastra di prodotto, l'assorbanza viene misurata spettrofotometricamente; D) piastra prodotto contenente i prodotti di reazione dopo il trattamento di CPH-arabinoxilano in 4 colori differenti con differenti concentrazioni di endo -β-1,4-xilanasi a 100 mM tampone acetato di sodio, pH 4,5 per 60 minuti a temperatura ambiente;. E) Quantificazione dei prodotti di reazione da D utilizzando spettrofotometria cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Ci sono diverse opzioni per l'utilizzo di questo test nello screening degli enzimi. Una possibilità è quella di utilizzare una piastra a 96 pozzetti contenente polisaccaridi diversi per lo screening, ad esempio, un piccolo numero di (purificata) endo enzimi con attività di sconosciuto. In questo caso il risultato mostrerà quali polisaccaridi sono DEGRADgrado dall'enzima destinazione. Per dimostrare questo principio, un -cellulase endo è stato testato contro diversi substrati CPH a 25 ° C. Tre diverse concentrazioni enzimatiche (0,5 U / ml, 1,0 U / ml e 5 U / ml) sono state incubate per 30 min. Il risultato è chiaramente visibile nella piastra prodotto (Figura 2A). La scheda prodotto per questo endo -cellulase a disposizione dal fornitore specifica laterale di attività per xyloglucan (Tamarind), orzo β-glucano, glucomannano, xilano legno di betulla e bassa laterale di attività per galattomannano. Coerentemente con questo, l'attività aggiuntiva per cellulasi è stata trovata contro CPH-β-glucano (orzo), CPH-xyloglucan (tamarindo), CPH-xilano (faggio) e bassa attività contro CPH-galattomannano (Figura 2B). Glucomannano non è stato testato. Gli stessi substrati CPH sono stati digeriti con gli enzimi disponibili commerciali (tre differenti concentrazioni enzimatiche: 0.1 U / ml, 0,5 U / ml e 1,0 U / ml) utilizzati come controlli positivi nelle stesse condizioni del precedentesperimentare. Tutti i substrati sono stati degradati dall'enzima controllo positivo e l'intensità del segnale aumentato corrispondente ad elevata concentrazione dell'enzima (Figura 2C). Figura 2. Otto differenti substrati CPH state incubate sotto agitazione a 25 ° C per 30 minuti. A) La piastra prodotto diversi substrati CPH digerito con endo -cellulase, a diverse concentrazioni. B) Determinazione dell'attività e in varie attività lato l'endo -cellulase. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media di tre repliche C) Attività di diversi enzimi commerciali al corrispondente substrato CPH (endo-cellulasi e 2-HE-cellulosa. E-LAMSE e CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-glucano (orzo); e-XYAN4 e CPH-xylan, e-XEGP e CPH-xyloglucan, E-BLAAM e CPH-amilosio, E-BMACJ e CPH-galattomannano; tutti gli enzimi da Megazyme). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media di due repliche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. La biomassa cromogenico (ICB) substrati insolubili sono un'utile aggiunta al repertorio substrato cromogenico perché conservano in parte la disposizione naturale di polisaccaridi a pareti cellulari delle piante, che sono il principale costituente delle biomasse. CPH e ICB supporti sono utilizzati nel nostro esempio per analizzare i enzimi secreti di Phanerochaete chrysosporium quando coltivato in mezzo liquido. Il setup piatto della piastra kit di analisi è mostrato in Figura 3A, con 19 CPH substrati e 5 substrati ICB (4 pozzetti per ciascun substrato, Figura 3B). P. chrysosporium era cultivatDE per tre giorni e poi il supernatante della coltura analizzato. Pertanto, 125 microlitri 200 mM tampone è stato trasferito a ciascun supernatante di coltura bene e 25 microlitri aggiunto. Tre differenti condizioni di pH sono stati testati utilizzando tampone di acetato di sodio pH 4,0, tampone sodio fosfato pH 6,0 o pH 8,0 (Figura 3C). La piastra è stata incubata agitando (150 rpm) a 25 ° C per 2 ore. I prodotti di reazione sono stati trasferiti alla piastra prodotto (Figura 3D) e analizzati. P. chrysosporium prodotta enzimi per la degradazione di vari glucani, amido e xilani (Figura 3E). segnali inferiori potrebbero essere rilevati per il arabinan emicellulose (barbabietole da zucchero) e galattano pectic nonché per RGI (soia). Gli enzimi prodotti erano più attivi in ​​condizioni acide (pH 4,0) che in condizioni neutre o leggermente basici (pH 8,0). Attività inferiore verso substrati ICB (Figura 3F)dimostra che quando i polisaccaridi sono in un contesto più naturale, l'efficienza dell'enzima non è la stessa con un polisaccaride puro ed è per questo substrati ICB dimostrano una visione più realistica sull'efficienza enzima, se è stato applicato a crudo o pre materiale vegetale trattata. Figura 3. Proiezione di un surnatante cultura da una vecchia coltura liquida di 3 giorni di Phanerochaete chrysosporium utilizzando una piastra a più substrato contenente 19 CPH e 5 substrati ICB. A) un programma di setup piastra con 4 pozzi per ogni singolo substrato (sfondo grigio = substrati CPH, sfondo arancione = substrati ICB). B) Immagine della piastra saggio contenente il substrato. C) Schema che mostra le condizioni di buffer utilizzati in tale esperimento (200 mM acetato di sodio pH 4,0, fosfato pH sodio 6,0 e sodio fosfato pH 8,0). D) immagine della piastra prodotto dopo 2 ore a 25 ° C. E) Assorbanze stati rilevati a 517 nm e tracciati per ogni singolo substrato CPH e F ) risultati substrato ICB per i rispettivi enzimi. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. I substrati cromogeni possono anche essere utilizzati per studiare gli effetti sinergici utilizzando una miscela di diversi substrati CPH colorate in un pozzetto e analizzare il supernatante reazione dopo trattamento con enzimi singoli o enzima cocktail. Nel seguente esempio mostrato in Figura 4, rosso CPH-cellulosa e substrati CPH-xilano giallo sono state mescolate insieme in un approssimativamente equal rapporto in 96 pozzetti pozzetti della piastra filtrante. La figura 4A mostra i prodotti di reazione di colore dopo il trattamento di 1 ora a temperatura ambiente senza enzima (controllo), cel cellulosa (2 U / ml), xilanasi xyl (1 U / ml) e miscela di entrambi gli enzimi (3 repliche per ogni approccio) in 100 mM sodio acetato tampone pH 4.5. Per l'analisi, il prodotto di reazione viene quantificato spettrofotometricamente scansione spettro di assorbimento da 350 nm a 700 nm (Figura 4B). Spesso ispezione visiva da sola può dare un'indicazione del fatto che l'enzima agisce su uno o più supporti, tuttavia registrato assorbanza spettri derivanti da diversi coloranti possono anche essere risolto utilizzando semplice regressione lineare 8 per dare un'indicazione più precisa della portata di degrado di ogni substrato dalla miscela. Usando substrati CPH come miscele sostanzialmente aggiunge il throughput del test, consentendo screening contro un massimo di 4 supporti differenti in un esperimento (un bene). Nell'esempio illustrato sono quattro diversi substrati utilizzati: blu CPH-β-glucano (orzo), giallo CPH-xilano (legno di faggio), verde CPH-amilosio e galattano CPH-pectic rosso (lupino). Il layout della piastra substrato è mostrato in figura 4C e un'immagine della piastra di test in figura 4D. La reazione è stata eseguita in 100 mM sodio acetato tampone pH 4,5 per 30 minuti a 25 ° C e 150 rpm. Primi enzimi singoli con l'aumentare della concentrazione dell'enzima sono stati testati con il corrispondente substrato CPH (Figura 4E) e il supernatante è stato ricevuto colorata come previsto nella piastra prodotto (Figura 4F, fila 1A – 12D). Riga E conteneva i due diversi substrati CPH giallo CPH-xylan e blu CPH-β-glucano, che sono stati degradato con diversi rapporti di enzimi corrispondenti endo -xylanase e di endo -glucanase. Dopo la reazione, il risultato è visible nella piastra di prodotto: il colore del prodotto di reazione era più scuro verde-blu, quando più endo -glucanase era presente (Figura 4F, 4E-6E) e trasformato in un accendino giallo-verde, quando l'endo -xylanase concentrazione aumentata ( Figura 4F, 10-12E). Lo stesso è visto in fila F, dove i due substrati rosso CPH-pectic galattano e giallo CPH-Xylan sono stati degradati con endo -galactanase e di endo -xylanase. Tutti e quattro differenti substrato CPH colorato erano presenti (Figura 4F, 1G-12F) e enzimi singoli degradato substrato CPH appropriato e aggiungendo ulteriori enzimi una combinazione dei prodotti di reazione di colore è stato ricevuto. Figura 4. Una combinazione di due differenti substrati CPH, rosso CPH-cellulosa e giallo CPH-xilano, trattata con diversi enzimi. UN) Surnatanti reazione dopo il trattamento di due substrati con endo -cellulase (CEL) o endo -xylanase (Xyl) o entrambi gli enzimi. B) spettri di assorbimento dei surnatanti di reazione. Una combinazione di quattro diversi substrati CPH trattati con differenti enzimi C) Schema della piastra substrato contenente substrati CPH:. Blue CPH-β-glucano (orzo), giallo CPH-xilano (faggio), verde CPH-amilosio e CPH- rossa galattano pectic (lupino) D) Immagine della piastra di test contenente i diversi substrati CPH E) Schema della piastra di prodotto che mostra il rapporto degli enzimi aggiunti (concentrazioni nominali (NC):.. glu = 1 U / ml endo -glucanase, Xyl = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo -amylase e gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Immagine della piastra prodotto dopo 30 minuti di incubazione a 25 ° C. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Substrato fonte CPH-2-idrossietilcellulosa N / A (CPH-2-HE-cellulosa) CPH-amilopectina Patata CPH-amilosio Patata CPH-arabinan barbabietola CPH-arabinoxilano Grano CPH-caseina latte bovino CPH-chitosano origine animale CPH-curdlan Alcaligenes faecalis CPH-destrano Leuconostoc spp. </em> CPH-galattomannano carruba CPH-laminarin Laminaria digitata CPH-lichenan muschio islandese CPH-metilcellulosa N / A CPH-pachyman Poria cocos galattano CPH-pectic Patata CPH-pullulan pullulans CPH-rhamnogalacturonan I (RG I) Patata CPH-rhamnogalacturonan I (-Gal) * Patata CPH-rhamnogalacturonan seme di soia CPH-xylan legno di faggio CPH-xyloglucan tamarindo CPH-β-glucano di orzo orzo CPH-β-glucano da oat avena </td> CPH-β-glucano del lievito lievito ICB-Arabidopsis Rosetta parte da Arabidopsis thaliana Col-0 (pianta adulta) semi ICB-Arabidopsis Arabidopsis thaliana ICB-bagassa Saccharum officinarum (pianta adulta essiccata, fusto e foglie) cellulosa ICB-cristallino (carta da filtro) commercial paper Whatman 3MM Chr cromatografia semi di fieno greco-ICB Trigonella spp. Semi ICB-canapa Cannabis spp. (Pianta adulta essiccata, fusto e foglie) semi ICB-lupino Lupinus angustifolius semi ICB-polline P. pratense Phleum pratense polline ICB-abete Picea spp. (Mialbero LLED tronco) ICB-tabacco foglie di Nicotiana benthamiana (giovane pianta) paglia ICB-grano Triticum spp. (Pianta adulta essiccata, fusto e foglie) ICB-salice Salix spp. (Pianta adulta secca, albero fresato tronco) ICB-Sorgo Sorghum spp. (Parte da pianta adulta) (catene laterali β-1,4-D-galattano rimossi con endo -β-1,4-D-galattanasi) * Tabella 1. Elenco delle disponibile Chromogenic polimeri idrogel (CPH) e substrati insolubile cromogenico biomassa (ICB).

Discussion

Stiamo usando una nuova generazione di multi-colored CPH e ICB substrati che sono basati su coloranti clorotriazina (elenco completo di substrati in tabella 1) disposti in un kit di analisi commerciale progettato su misura. Digestione enzimatica dei substrati produce piccoli, prodotti solubili, tinti che sono rilevabili nella soluzione di test e possono essere quantificati tramite un lettore di piastre 9. Questo saggio è progettato per la valutazione degli enzimi endo -acting e la sensibilità del saggio è simile quella che utilizza azzurrino reticolato (AZCL) substrati 10, mentre altri metodi sono disponibili per exo -acting enzimi 11,12. Il limite di questo kit di analisi consiste nella rilevazione di attività endo -enzyme, come CPH così come i substrati ICB non sono degradabili da exo enzimi molto probabilmente a causa sterico derivante dai coloranti e reticolante molecole 8.

Il test viene eseguito in un 96-WELl formato e reazioni individuali si svolgono nei pozzetti. La reazione deve essere miscelato nella piastra per ricevere dati riproducibili. I surnatanti risultanti vengono filtrati in una piastra di prodotto in cui l'assorbanza di ogni pozzetto può essere quantificato utilizzando la spettrometria di assorbanza. I principi di base e il layout del test sono mostrati in Figura 1. Il dosaggio è costituito da una piastra di dosaggio (una piastra filtrante a 96 pozzetti) con i substrati, e dopo incubazione con gli enzimi, il supernatante viene filtrato attraverso in un piatto ben chiaro e le assorbanze vengono lette fornendo una misura semiquantitativa di specificità e l'attività enzimatica. E 'stato dimostrato che questo test di screening utilizzando substrati CPH può essere utilizzato anche in un formato di piastra di agar, in cui i prodotti di reazione solubili creano un alone colorato dopo incubazione per una notte. 8

I kit di analisi possono essere usati per lo screening enzimi purificati e loro potenziali attività collaterali come dimostratoFigura 2. Collaterali attività possono derivare da un singolo enzima e la sua specificità promiscua, ma anche dal fatto che il campione analizzato è una miscela di enzimi diversi e il loro effetto sinergico deve essere studiato. Inoltre, come è stato dimostrato in studi precedenti, che cocktail di enzimi, flora intestinale 13 e cultura brodi da funghi 8 nonché endogena enzima pianta e batteri (dati non pubblicati) possono essere utilizzati come fonte di enzima.

substrati ICB affrontano miscele complesse di componenti della parete cellulare spesso si incontrano nei processi industriali di ripartizione biomassa. Questi substrati sono progettati per valutare la disponibilità polisaccaride e fornire informazioni su come ottimizzare in modo efficace cocktail di degrado per l'uscita di degrado più efficiente. Come illustrato nella figura 3 CPH e ICB substrati possono essere utilizzati in enzima lato di screening a fianco – rivelando una ricchezza di informazioni su una specificità dell'enzimaattività d sia nel contesto del substrato preferito (CPH) e un complesso più naturale contenente altri componenti oltre al substrato preferito mimando più strettamente un complesso macromolecolare presente in natura (ICB). L'utilizzo di più colori permette per la rilevazione simultanea di diverse attività enzimatiche nei confronti di diversi substrati che aumenta il-throughput elevato e multiplexity del test. Spettri di diversi coloranti può essere risolto con una semplice regressione lineare e nella maggior parte dei casi l'attività multi-substrato può essere osservato mediante ispezione visiva da solo. Un esempio simulato di un tale esperimento ei risultati sono illustrati nella figura 4.

Questo toolbox test e la versatilità della sua applicazione sono molto adatti per lo screening di primo livello di enzimi e brodi di coltura con attività sconosciute. Gli aspetti più importanti di questo test sono il suo carattere high-throughput, personalizzazione, facilità d'uso e flessibilità. Con questo in mente, we crediamo che questo romanzo insieme di strumenti migliorerà notevolmente e accelerare i processi enzimatici di screening in industriale così come le applicazioni accademiche.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare il Prof. J. Paul Knox (Università di Leeds, Regno Unito), che ha fornito l'accesso ai suoi laboratori per le riprese, e Susan E. Marcus per un'eccellente assistenza tecnica. JS riconosce il progetto WallTraC (European Settimo Programma Quadro della Commissione (convenzione di sovvenzione. No: 263.916) e la biomassa progetto di 21 ° secolo (Innovation Foundation Danimarca; caso n .: 103.408) SKK ringrazia il progetto SET4Future (danese Strategic Research Council), Bio-valore strategico fondato dal Consiglio danese per la ricerca strategica, il Consiglio danese per la tecnologia e l'innovazione (Grant caso n .: 0603-00522B), e un approccio di biologia-driven per la comprensione degradazione enzimatica di polisaccaride sistemi complessi (Concessione caso no .:. 107.279) per il finanziamento Questo documento riflette le opinioni degli autori solo l'Unione europea non è responsabile per qualsiasi uso che possa essere fatto delle informazioni qui contenere..

Materials

assay kit plates Glycospot customized assay kit plates
activation solution Glycospot for activating CPH substrates
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold Pall Corporation 5015 spacer block
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile Millipore MSHVN4510 assay plate
96-Well Microplates, Polypropylene Greiner Bio-One 651201 collection plate after washing the substrates
Nunc™ MicroWell™ 96-Well Microplates Thermo Scientific 269620 product plate
Diaphragm pump MZ 2 NT Vacuubrand 732000 vacuum pump used with the vacuum manifold
Infors HT Ecotron Infors HT 4950132 (Buch & Holm) horizontal shaker
SpectraMax M5 Molecular Devices 10067-750 (VWR) 96-well plate absorbance reader
Vacuum manifold Pall Corporation 5017 vacuum manifold
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) Megazyme E-CELTR cellulase [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus)  Megazyme E-BMACJ mannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) Megazyme E-LAMSE β-glucanase [glu]
endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger)  Megazyme E-EGALN galactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger)  Megazyme E-XYAN4 xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)  Megazyme E-XEGP xyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis)  Megazyme E-BLAAM amylase [amy]
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References

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High-throughput ScreeningCarbohydrate-degrading EnzymesNovel Insoluble Chromogenic Substrate Assay KitsEnzyme DiscoveryBiomass DegradationChromogenic SubstratesEndo-cellulaseICB-wheat StrawAbsorbancePlate Reader

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Schückel, J., Kračun, S. K., Willats, W. G. T. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. Vis. Exp. (115), e54286, doi:10.3791/54286 (2016).
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