JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Published: September 20, 2016
doi:
10.3791/54286
, ,
1Department for Plant and Environmental Sciences,University of Copenhagen, 2School of Agriculture, Food and Rural Development,Newcastle University

Summary

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Abstract

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme’s biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

Introduction

Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.

We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.

One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8.

The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).

CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.

Protocol

1. chromogeenonderzoek met CPH substraten in een 96-well plaat formaat Activering van de testkit plaat Activeer de 96-well filter (met blauwe CPH xylaan) bepalingskit plaat (List of Materials) door toevoeging van 200 ul activatoroplossing (verkregen bij de kit) aan elk putje, gevolgd door 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur zonder roeren. Toepassen vacuüm met behulp van een vacuüm verdeelstuk (met afstandsblok binnen en elke standaard, transparante 96-well plaat een verzamelplaat) om bestaande activering oplossing te verwijderen. Het is ook mogelijk een centrifuge bij 2700 xg gebruik gedurende 10 min bij deze stap in plaats van het vacuüm spruitstuk. Was de CPH substraten door het toevoegen van 100 pi steriel water en toe te passen vacuüm (of centrifugale kracht) aan de stabilisator te verwijderen. Herhaal deze stap nog twee keer en de borden zijn nu klaar voor gebruik. enzymreactie LET OP: Vermeld altijd bufferalleen als een negatieve controle en indien mogelijk eerder gekarakteriseerde enzymen als positieve controles. Gebruik een statistisch juiste aantal herhalingen. De CPH substraten zijn stabiel tussen pH 3,0-10,0 en de totale bufferuiteinde enzymoplossing in elk putje mag niet meer dan 180 pl. Plantenextract of kweekbouillon kan ook worden gebruikt in plaats van gezuiverde enzymoplossing. Voeg 150 ul 100 mM natriumacetaatbuffer, pH 4,5 en 5 ul endo -cellulase oplossing (tot een uiteindelijke concentratie van 1 U / ml) aan elk putje van de assay kit plaat. Plaats het product plaat (een duidelijke-wells plaat compatibel zijn met de microtiterplaat reader) onder de testkit plaat om eventuele lekkage van de reactie plaat te verzamelen tijdens het schudden. Incubeer de testkit plaat bij 25 ° C gedurende 30 min in een horizontale schudinrichting bij 150 rpm. Opmerking: Het mengen de reactie in de assay kit plaat gedurende de incubatie is cruciaal om een ​​consistente en reproduceerbare resultaat. CPH substraten zijn stabiel tot 90 ° C. De incubatietijd moet worden verhoogd tot 24 uur bij het testen van cultuur bouillon met onbekende enzym concentraties CPH substraten. Merk op dat geschikte incubatietijden afhangen van de activiteit van het enzym (en), maar in het algemeen als er geen detecteerbare activiteit in 24 uur, is het waarschijnlijk dat het enzym de geteste substraat niet zal degraderen. Een actief enzym wordt verslechtering van de onoplosbare Polysacchariden chromogene substraat van de CPH in oplosbare chromogene oligosachariden, die tot gekleurde supernatant zijn. Plaats de schone product plaat in het vacuüm spruitstuk met de afstandhouder blok binnen. Plaats de testkit plaat op de top en toe te passen vacuüm (maximale negatieve druk van -60 kPa). Het is ook mogelijk een centrifuge bij 2700 xg gebruiken gedurende 10 min. OPMERKING: Het filtraat dat de gekleurde oligosacchariden zoals reactieproduct nu uit productgroep dienblad verdere analyse 8 </sup>. Detectie en kwantificering Controleer of de hoeveelheid vloeistof in elk putje van de plaat product ongeveer gelijk door visuele inspectie. Lees de absorptie van de verzamelplaat bij 595 nm voor blauw CPH-xylaan met een plaatlezer. Bij het doen gegevensanalyse, trek de buffergeheugen-negatieve controlewaarden van de waarden uit de putjes waarin een enzym werd toegevoegd. Bereken het gemiddelde en de standaardfout van middelen (SEM) van de herhalingsputjes 8. 2. chromogeenonderzoek met ICB substraten in een 96 putjes format enzymreactie Voeg 150 ul 100 mM natriumacetaatbuffer, pH 4,5 en 5 gl 31 U / ml endo -xylanase oplossing in elk putje van de assay kit plaat met rood ICB-tarwestro (uiteindelijke enzymconcentratie in de put: 1 U / ml) . LET OP: De testkit platen (96-well filter plAtes met ICB-substraten) worden vervaardigd, zoals beschreven in de literatuur (zie lijst van materialen). De ICB substraten zijn stabiel in buffers met een pH-bereik tussen pH 3,0-10,0. Vermeld altijd alleen buffer als een negatieve controle, commerciële enzymen als een positieve controle gebruikt en een statistisch voldoende aantal replica's. Niet activeert de ICB substraten zoals CPH substraatplaat, maar verwijdert de stabilisator door driemaal wassen met 100 pl water, gevolgd door vacuümfiltratie of centrifugatie. Zet het product plaat onder de substraatplaat om eventuele lekkage van de substraatplaat te verzamelen tijdens het schudden. Incubeer de reactie bij 25 ° C onder schudden bij 150 rpm gedurende 2 uur. LET OP: Een actieve enzym wordt verslechtering van de onoplosbare chromogene polysacchariden in de ICB substraat in oplosbare oligosacchariden, die zichtbaar als gekleurde supernatant zijn. ICB substraten zijn stabiel tot 90 ° C. De incubatie time moet worden verhoogd tot 24 uur of niet-gezuiverde enzymen zoals kweekmedia worden gebruikt. Plaats het product plaat in het vacuüm spruitstuk met de afstandhouder blok binnen. Plaats de testkit bovenplaat en toepassen vacuüm (maximale onderdruk van -60 kPa) of een centrifuge om het product uit de testkit plaat filtraat in de put van de plaat product. OPMERKING: Het filtraat dat de gekleurde oligosacchariden zoals reactieproduct is nu in de verzamelplaat 8 voor verdere analyse. Detectie en kwantificering Controleer of de hoeveelheid vloeistof in elk putje van de verzamelplaat ongeveer gelijk door visuele inspectie. Lees de absorptie van de collectie plaat bij 517 nm voor rode ICB-tarwestro behulp van een plaat lezer. Bij het doen gegevensanalyse – aftrekken van de buffer – enige negatieve controlewaarden van de waarden uit de putjes waarin een enzymwas toegevoegd. Bereken het gemiddelde en de standaardfout van middelen (SEM) van de herhalingsputjes 8. LET OP: In het geval van het screenen van onbekende enzymen, raden we het maken van een verdunningsreeks om meer gedetailleerde gegevens over het dynamisch bereik van de activiteit enzym te verkrijgen.

Representative Results

De high-throughput en multiplexing capaciteit van deze test is gebaseerd op de chromogene onoplosbaar polymeer (of eiwit) hydrogel (CPH) substraten die in 96-well filterplaten. Enzymen en negatieve controles worden toegevoegd aan de testkit plaat (figuur 1A) en de enzymen breken het overeenkomstige substraat vervaardigen van een gekleurde supernatant (Figuur 1B). Nadat de reactie is voltooid, wordt de bovenstaande vloeistof overgebracht in een duidelijke putjes plaat product en de absorptie kan direct worden gemeten met een spectrofotometer geschikt voor 96 putjes (Figuur 1C). Een voorbeeld van een dosis respons van CPH-arabinoxylaan te xylanase bij verschillende concentraties van het enzym (0,00-0,75 U / ml) wordt getoond in figuur 1D, waar de afnemende enzymconcentratie visueel kan worden waargenomen. Een meer gedetailleerde spectrofotometrische quantcatie kan worden gebruikt om de absorptie versus enzymconcentratie (figuur 1E) plot. De signaalintensiteit overeen met de enzymactiviteit. De reproduceerbaarheid van de test wordt getoond door de foutbalken (standaardfout van het gemiddelde SEM van drie replica's). Verdere experimenten op de reproduceerbaarheid van deze test worden elders gepubliceerd 8. Figuur 1. xylanasebehandeling van CPH-arabinoxylaan. A) Een schema van de testkit plaat met de CPH substraat (bv, CPH-arabinoxylaan) net vóór de toevoeging van enzymen 1 en 2 en de buffer geladen in 96-well filterplaat putjes -alleen control (enzym 1 had endo -xylanase activiteit); B) Afbraak van CPH-arabinoxylaan door enzym 1 produceerde een gekleurd supernatant; C) bij het ​​vacuüm-assisted filtratie-ion van de supernatanten bij het ​​product plaat wordt de absorptie gemeten spectrofotometrisch D) product plaat waarop de reactieproducten na behandeling van CPH-arabinoxylaan in 4 verschillende kleuren met verschillende concentraties -β endo-1,4-xylanase in 100 mM natriumacetaatbuffer, pH 4,5 gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. E) Kwantificering van de reactie producten van D met behulp van spectrometrie klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Er zijn verschillende mogelijkheden voor het gebruik van deze assay enzym screening. Een optie is om een 96-wells plaat met verschillende polysacchariden voor screening, bijvoorbeeld een klein aantal (gezuiverd) endo -enzymes met onbekende activiteit gebruikt. In dit geval wordt het resultaat tonen die polysachariden zijn Degradkunnen de doelenzym. Dit principe tonen, werd een endo -cellulase getest tegen verschillende CPH substraten bij 25 ° C. Drie verschillende concentraties enzym (0,5 U / ml, 1,0 U / ml en 5 U / ml) werden gedurende 30 min. Het resultaat is duidelijk zichtbaar in de plaat product (Figuur 2A). Het product sheet voor deze endo -cellulase verstrekt door de leverancier specificeert side-activiteit xyloglucan (tamarinde), gerst β-glucaan, glucomannaan, berkenhout xylaan en lage kant-activiteit galactomannan. Consistent hiermee activiteit naast cellulase bleek tegen CPH-β-glucan (gerst), CPH-xyloglucan (tamarinde), CPH-xylaan (beukenhout) en lage activiteit tegen CPH-galactomannan (figuur 2B). Glucomannan werd niet getest. Dezelfde CPH substraten werden gedigereerd met commercieel verkrijgbare enzymen (drie verschillende enzymconcentraties: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml en 1,0 U / ml) als positieve controles onder dezelfde omstandigheden dan de voorgaandeexperiment. Alle substraten werden afgebroken door het enzym positieve controle en de signaalintensiteit verhoogd overeenkomt met hogere enzymconcentratie (figuur 2C). Figuur 2. Acht verschillende CPH substraten werden geïncubeerd onder schudden bij 25 ° C gedurende 30 min. A) Het product plaat van verschillende substraten CPH gedigereerd met endo -cellulase, bij verschillende concentraties. B) Kwantificering van de activiteit en verschillende nevenactiviteit van endo -cellulase. De foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde van drie replica C) activiteit van verschillende commerciële enzymen om de overeenkomstige CPH substraat (endo-cellulase en 2-HE-cellulose. E-Lamse en CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-glucan (gerst); E-XYAN4 en CPH-xylaan, E-XEGP en CPH-xyloglucan, E-blaam en CPH-amylose, E-BMACJ en CPH-galactomannan; Alle enzymen uit Megazyme). De fout balken geven de standaardfout van het gemiddelde van twee replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. De onoplosbare chromogene biomassa (ICB) substraten zijn een nuttige aanvulling op het chromogene substraat repertoire, omdat ze te behouden voor een deel van de natuurlijke inrichting van polysacchariden in celwanden van planten die het hoofdbestanddeel van biomassa zijn. CPH en ICB substraten dat in dit voorbeeld de uitgescheiden enzymen van Phanerochaete chrysosporium analyseren wanneer gekweekt in vloeibaar medium. De plaat opzet van de testkit plaat wordt getoond in figuur 3A, met 19 CPH substraten en 5 ICB substraten (4 wells voor elk substraat, figuur 3B). P. Chrysosporium was Cultivatored drie dagen waarna de kweeksupernatant onderzocht. Daarom werd 125 gl 200 mM buffer overgebracht naar elk putje en 25 ul kweeksupernatant toegevoegd. Drie verschillende pH-omstandigheden zijn getest met natriumacetaatbuffer pH 4,0, natriumfosfaatbuffer pH 6,0 of pH 8,0 (Figuur 3C). De plaat werd geïncubeerd onder schudden (150 rpm) bij 25 ° C gedurende 2 uur. De reactieproducten werden overgebracht naar het product plaat (Figuur 3D) en geanalyseerd. P. Chrysosporium geproduceerde enzymen voor de afbraak van verschillende glucanen, zetmeel en xylanen (figuur 3E). Lagere signalen worden gedetecteerd voor hemicellulose arabinan (suikerbiet) en pectinestoffen galactan en voor RGI (sojabonen). De enzymen die actiever waren in zure omstandigheden (pH 4,0) dan bij neutrale of licht basische omstandigheden (pH 8,0). Lagere activiteit in de richting van ICB substraten (figuur 3F)toont aan dat wanneer de polysachariden in een natuurlijke omgeving, de efficiëntie van het enzym is niet hetzelfde als een zuivere polysaccharide en daarom ICB substraten vertonen een meer realistische inschatting enzymefficiëntie, als het wordt toegepast op ruwe of pre- behandelde plantmateriaal. Figuur 3. Screening van een kweeksupernatant van een 3-dagen oude vloeibare cultuur van Phanerochaete chrysosporium met behulp van een multi-substraat plaat met 19 CPH en 5 ICB substraten. A) Een schema van de plaat opstelling met 4 putten voor elke individuele substraat (grijze achtergrond = CPH substraten, oranje achtergrond = ICB-substraten). B) Beeld van de assay plaat met de ondergrond. C) regeling met de buffer voorwaarden die volgens dat experiment (200 mM natriumacetaat pH 4,0, natriumfosfaat pH 6,0 en natriumfosfaat pH 8,0). D) foto te platen na 2 uur bij 25 ° C. E) absorpties werden gedetecteerd bij 517 nm en uitgezet voor elk CPH substraat en F ) ICB substraat resultaten voor de betreffende enzymen. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. De chromogene substraten kunnen ook gebruikt worden om synergistische effecten te bestuderen door toepassing van een mengsel van verschillende gekleurde CPH substraten in één putje en analyse van de reactie supernatant na behandeling met één enzymen of enzym cocktails. In het volgende voorbeeld getoond in figuur 4, werden rode CPH-cellulose en geel CPH-xylaan substraten samen een ongeveer equ gemengdAl verhouding in 96-well filterplaat putjes. Figuur 4A toont het gekleurde reactieproducten na 1 uur behandeld bij kamertemperatuur zonder enzymen (controle), cellulose cel (2 U / ml), xylanase Xyl (1 U / ml) en een mengsel van beide enzymen (3 replicaten van elke benadering) in 100 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5. Voor analyse werd het reactieproduct spectrofotometrisch gekwantificeerd door het scannen van het absorptiespectrum van 350 nm tot 700 nm (figuur 4B). Vaak visuele inspectie alleen kan een indicatie of het enzym werkt op één of meerdere substraten geven echter opgenomen absorptie spectra die voortvloeien uit verschillende kleurstoffen kunnen ook worden opgelost met behulp van eenvoudige lineaire regressie 8 om een nauwkeuriger indicatie van de mate van afbraak van elk geven substraat uit het mengsel. Gebruik CPH substraten hoofdzaak mengsels draagt ​​bij aan de verwerkingscapaciteit van de assay, zodat screening tegen maximaal 4 verschillende substraten in één experiment (één ook). In het getoonde voorbeeld zijn vier verschillende substraten gebruikt: blauw CPH-β-glucan (gerst), geel CPH-xylaan (beukenhout), groene CPH-amylose en rode CPH-pectine galactan (lupine). De indeling van de substraatplaat wordt getoond in figuur 4C en een foto van de testplaat in figuur 4D. De reactie werd uitgevoerd in 100 mM natriumacetaatbuffer pH 4,5 gedurende 30 minuten bij 25 ° C en 150 rpm. Eerste single enzymen met toenemende enzymconcentratie werden getest met de bijbehorende CPH substraat (Figuur 4E) en de gekleurde supernatant werd ontvangen zoals verwacht in het product plaat (Figuur 4F, rij 1A – 12D). Rij E bevatte twee verschillende substraten geel CPH CPH-xylaan en blauwe CPH-β-glucan, die werden afgebroken met verschillende verhoudingen van de overeenkomstige enzymen endo -xylanase en endo-glucanase. Na de reactie werd het resultaat visible in het product plaat: de kleur van het reactieproduct werd donkerder groen-blauw, wanneer meer endo glucanase aanwezig was (figuur 4F, 4E-6E) en omgezet in een lichtere geel-groen, wanneer het endo -xylanase concentratie verhoogd ( Figuur 4F, 10-12E). Hetzelfde is te zien in rij F, waarbij de twee substraten rode CPH-pectine galactan en geel CPH-xylaan werd afgebroken met endo -galactanase en endo -xylanase. Alle vier verschillende gekleurde CPH substraat aanwezig (figuur 4F, 1G-12F) en enkele enzymen afgebroken passende CPH substraat en doordat extra enzymen een combinatie van de gekleurde reactieproducten ontvangen. Figuur 4. Een combinatie van twee verschillende substraten CPH, red CPH-cellulose en geel CPH-xylaan, behandeld met verschillende enzymen. EEN) Reactie supernatanten na behandeling van twee substraten met endo -cellulase (cel) of endo -xylanase (Xyl) of beide enzymen. B) De absorptie spectra van de reactie supernatanten. Een combinatie van vier verschillende CPH substraten behandeld met verschillende enzymen C) Regeling van de substraatplaat met de CPH substraten. Blue CPH-β-glucan (gerst), geel CPH-xylaan (beukenhout), groene CPH-amylose en rode CPH- pectinestoffen galactan (lupine) D) Afbeelding van de testplaat met de verschillende substraten CPH E) regeling van het product plaat toont de verhouding van de toegevoegde enzymen (nominale concentraties (NC):.. glu = 1 U / ml endo-glucanase, Xyl = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo-amylase en gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Afbeelding van het product plaat na 30 min incubatie bij 25 ° C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Substraat Bron CPH-2-hydroxyethyl- N / A (CPH-2-HE-cellulose) CPH-amylopectine aardappel CPH-amylose aardappel CPH-arabinan suikerbiet CPH-arabinoxylaan tarwe CPH-caseïne koemelk CPH chitosan dierlijke oorsprong CPH-curdlan Alcaligenes faecalis CPH-dextran Leuconostoc spp. </em> CPH-galactomannan sint CPH-laminarine Laminaria digitata CPH-lichenan IJslands mos CPH-methylcellulose N / A CPH-pachyman Poria cocos CPH-pectinestoffen galactan aardappel CPH-pullulan Aureobasidium pullulans CPH-rhamnogalacturonan I (RG I) aardappel CPH rhamnogalacturonan-I (Gal) * aardappel CPH-rhamnogalacturonan sojaboon CPH-xylaan beukenhout CPH-xyloglucan tamarinde CPH-β-glucan uit gerst gerst CPH-β-glucaan van haver haver- </td> CPH-β-glucan uit gist gist ICB-Arabidopsis Rosette vertrekt uit Arabidopsis thaliana Col-0 (volwassen plant) ICB-Arabidopsis zaden Arabidopsis thaliana ICB-bagasse Saccharum officinarum (gedroogde volwassen plant, stengel en bladeren) ICB-kristallijne cellulose (filterpapier) commerciële Whatman 3MM Chr Chromatography papier ICB-fenegriekzaden Trigonella spp. Zaad ICB-hennep Cannabis spp. (Gedroogde volwassen plant, stengel en bladeren) ICB-lupine zaden Blauwe lupine zaden ICB-pollen P. pratense Phleum pratense pollen ICB-spar Picea spp. (Migevuld boomstam) ICB-tabak vertrekt vanaf Nicotiana benthamiana (jonge planten) ICB-tarwestro Triticum spp. (Gedroogde volwassen plant, stengel en bladeren) ICB-wilg Salix spp. (Gedroogde volwassen plant, gemalen boomstam) ICB-Sorghum Sorghum spp. (Vertrekt uit volwassen plant) * (β-1,4-D-galactan zijketens verwijderd -β endo-1,4-D-galactanase) Tabel 1. Lijst van de beschikbare Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) en onoplosbare Chromogenic Biomassa (ICB) substraten.

Discussion

We maken gebruik van een nieuwe generatie van multi-gekleurde CPH en ICB substraten die zijn gebaseerd op chlorotriazine kleurstoffen (volledige lijst van substraten in tabel 1) die in een speciaal ontworpen commerciële testkit. Enzymdigestie van de substraten oplevert kleine, oplosbare, geverfde producten die detecteerbaar in de testoplossing en kan worden gekwantificeerd met behulp van een plaatlezer 9. Deze test is ontworpen voor het evalueren van endo-werkende enzymen en de gevoeligheid van de test is vergelijkbaar de ene met azurine verknoopt (AZCL) substraten 10, terwijl andere methoden beschikbaar voor exo-werkende enzymen 11,12. De beperking van deze testkit ligt in de detectie van endo -enzyme activiteit CPH alsmede de ICB substraten niet afbreekbaar door exo -enzymes waarschijnlijk door sterische hindering die door de kleurstof en crosslinker molecules 8.

De test wordt uitgevoerd in een 96-well formaat en individuele reacties plaatsvinden in de putjes. De reactie is in de plaat te mengen reproduceerbare gegevens te ontvangen. De resulterende supernatanten worden gefilterd in een plaat product waarbij de absorptie van elk putje kan worden gekwantificeerd middels absorptie spectrometrie. De basisprincipes en de indeling van de assay worden getoond in figuur 1. De test bestaat uit een testplaat (een 96-well filterplaat) met de substraten en na incubatie met enzymen, wordt de bovenstaande vloeistof gefiltreerd in een duidelijke putjes en de absorpties uitgelezen verschaffen van een semi-kwantitatieve meting enzym specificiteit en activiteit. Aangetoond is, dat deze screeningstest gebruikt CPH substraten ook kunnen worden gebruikt in een agarplaat format, waarbij de oplosbare reactieproducten maakt een gekleurde halogeen na overnacht incubatie. 8

De testkits kunnen worden gebruikt om gezuiverde enzymen en hun mogelijke nevenactiviteiten scherm zoals aangetoond inFiguur 2. Nevenactiviteiten kan ontstaan ​​uit een enkel enzym en de promiscue specificiteit maar ook een feit dat het geanalyseerde monster een mengsel van verschillende enzymen en hun synergetische effect moet worden bestudeerd. Bovendien, zoals dat in eerdere studies is aangetoond dat enzym cocktails, darmflora 13 en kweekbouillon van fungi 8 en endogene plantenenzym en bacteriën (ongepubliceerde gegevens) kan worden gebruikt als een enzymbron.

ICB substraten te pakken complexe mengsels van celwand componenten vaak aangetroffen in industriële processen van afbraak biomassa. Deze substraten zijn ontworpen om polysaccharide beschikbaarheid te evalueren en geven informatie over hoe u degradatie cocktails effectief te optimaliseren voor een efficiëntere afbraak output. Zoals weergegeven in figuur 3 kan CPH en ICB substraten in enzym screenen naast elkaar worden gebruikt door side – het onthullen van een schat aan informatie over enzym specificiteit eend activiteiten in zowel de context van de voorkeursuitvoeringsvorm substraat (CPH) en een natuurlijker complex met andere componenten naast het voorkeurssubstraat beter nabootsen van een macromoleculaire assemblage die in de natuur (ICB). Het gebruik van meerdere kleuren maakt gelijktijdige detectie van verschillende enzymactiviteiten tegen verschillende substraten die de high-throughput en multiplexity van de test verhoogt. Spectra van verschillende kleurstoffen kunnen worden opgelost door eenvoudige lineaire regressie en meestal meerdere substraatactiviteit kan alleen worden waargenomen door visuele inspectie. Een gesimuleerd voorbeeld van een dergelijk experiment en de resultaten is weergegeven in figuur 4.

Deze test toolbox en de veelzijdigheid van de toepassing ervan zijn zeer goed geschikt voor eerste niveau screening van enzymen en kweekmedia met onbekende activiteiten. De belangrijkste aspecten van deze test zijn de hoge doorvoer natuur, aanpasbaarheid, gebruiksgemak en flexibiliteit. Met dat in gedachten, we geloven dat deze nieuwe set van tools sterk zal verbeteren en versnellen enzym screening processen in zowel industriële als academische toepassingen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken Prof. J. Paul Knox (University of Leeds, UK), die toegang verschaft tot zijn laboratoria voor het filmen, en Susan E. Marcus voor een uitstekende technische ondersteuning. JS erkent de WallTraC project (European Commission Seventh Framework Program (subsidieovereenkomst nr.: 263.916) en het project Biomassa voor 21e eeuw (Stichting Innovatie Denemarken; zaak nr .: 103408) SKK is het bedanken van de SET4Future project (Deense Strategic Research Council), de Bio-Value Strategische gesticht door de Deense Raad voor Strategische Research, de Deense Raad voor Technologie en Innovatie (Grant zaak nr .: 0603-00522B), en A-Biology aanpak voor het begrijpen van enzymatische afbraak van complexe polysaccharide Systems (Grant zaak geen .:. 107.279) voor de financiering van dit document geeft de mening van de auteurs enige de Europese Unie is niet aansprakelijk voor het gebruik dat kan worden gemaakt van de gegevens te bevatten..

Materials

assay kit plates Glycospot customized assay kit plates
activation solution Glycospot for activating CPH substrates
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold Pall Corporation 5015 spacer block
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile Millipore MSHVN4510 assay plate
96-Well Microplates, Polypropylene Greiner Bio-One 651201 collection plate after washing the substrates
Nunc™ MicroWell™ 96-Well Microplates Thermo Scientific 269620 product plate
Diaphragm pump MZ 2 NT Vacuubrand 732000 vacuum pump used with the vacuum manifold
Infors HT Ecotron Infors HT 4950132 (Buch & Holm) horizontal shaker
SpectraMax M5 Molecular Devices 10067-750 (VWR) 96-well plate absorbance reader
Vacuum manifold Pall Corporation 5017 vacuum manifold
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) Megazyme E-CELTR cellulase [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus)  Megazyme E-BMACJ mannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) Megazyme E-LAMSE β-glucanase [glu]
endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger)  Megazyme E-EGALN galactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger)  Megazyme E-XYAN4 xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)  Megazyme E-XEGP xyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis)  Megazyme E-BLAAM amylase [amy]
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).
  2. Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).
  3. Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography. Biotechnol. Lett. 26 (15), 1207-1211 (2004).
  4. Black, G. E., Fox, A. Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 720 (1-2), 51-60 (1996).
  5. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).
  6. Somogyi, M. Notes on Sugar Determination. J. Biol. Chem. 195 (1), 19-23 (1952).
  7. Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms. Biotechniques. 33 (4), 798 (2002).
  8. Kračun, S. K., et al. A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes. Biotechnol Biofuels. 8, (2015).
  9. Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity. J. Biotechnol. 103 (3), 203-212 (2003).
  10. Nyyssonen, M., et al. Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries. Front Microbiol. 4, 282 (2013).
  11. Sweeney, M. D., Xu, F. Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments. Catalysts. 2 (2), 244-263 (2012).
  12. Biely, P., et al. Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose. J. Biotechnol. 151 (1), 137-142 (2011).
  13. Mackenzie, A. K., et al. A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility. Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).

Tags

High-throughput ScreeningCarbohydrate-degrading EnzymesNovel Insoluble Chromogenic Substrate Assay KitsEnzyme DiscoveryBiomass DegradationChromogenic SubstratesEndo-cellulaseICB-wheat StrawAbsorbancePlate Reader

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Schückel, J., Kračun, S. K., Willats, W. G. T. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. Vis. Exp. (115), e54286, doi:10.3791/54286 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image