新規不溶性発色基質アッセイキットを使用した炭水化物分解酵素のハイスループットスクリーニング

高スループットと、このアッセイの多重化能力は、96ウェルフィルタープレートに配置された不溶性の発色性ポリマー（またはタンパク質）ヒドロゲル（CPH）基板に基づいています。酵素ならびにネガティブコントロールは、アッセイキットプレート（ 図1A）に添加し、酵素、着色上清（ 図1B）の製造に対応する基質を分解する。反応が完了した後、上清を透明なウェル製品プレートに移し、吸光度を96ウェルプレート（ 図1C）のために適切な分光光度計を用いて直接測定することができます。 酵素の異なる濃度でのキシラナーゼのCPH-アラビノキシランの用量反応の例（0.00 – 0.75 U / ml）を減少させる酵素濃度を視覚的に観察することができ、図1Dに示されています。より詳細な分光光度定量ificationは酵素濃度（ 図1E）に対する吸光度をプロットするために使用することができます。信号強度は、酵素活性に相当します。アッセイの再現性は、エラーバー（3つの複製の平均値の標準誤差、SEM）によって示されています。このアッセイの再現性に関するより詳細な実験は、他の場所8公開されています。 。A）CPH基板とアッセイキットプレートのスキーム（ 例えば 、CPH-アラビノキシランが）ただ、酵素1及び2と緩衝液の添加前に、96ウェルフィルタープレートのウェルにロードCPH-アラビノキシランの 図1. キシラナーゼ処理真空補助filtrat時C）;のみのコントロール（酵素1は、 エンド -xylanase活性を有していた）; B）酵素1によりCPH-アラビノキシランの劣化が着色上清を生産製品版へにおける上清のイオン、吸光度を分光光度法で測定される; 100 mMの中でエンド -β-1,4-キシラナーゼの異なる濃度の4つの異なる色でCPH-アラビノキシランの治療後の反応生成物を含むD）製品板酢酸ナトリウム緩衝液、pH 4.5、室温で60分間; E）分光光度計を用いて、Dからの反応生成物の定量この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 酵素のスクリーニングこのアッセイを使用するための別の選択肢があります。 1つのオプションは、未知の活性を有するエンド -enzymes、例えば 、（精製）の少数をスクリーニングするための別の多糖類を含む96ウェルプレートを使用することです。この場合、結果はdegradである多糖類が表示されます標的酵素によってできます。この原理を表示するには、 遠藤 -cellulaseは、25℃で異なるCPH基質に対して試験しました。三つの異なる酵素濃度（0.5 U / mlを、1.0 U / ml及び5U / ml）を30分間インキュベートしました。結果は、製品のプレート（ 図2A）ではっきりと見えます。サプライヤーが提供する-cellulaseこのエンドの製品シートは、キシログルカン（タマリンド）のためのサイドアクティビティ、大麦βグルカン、グルコマンナン、カバノキキシランおよびガラクトマンナンのための低サイドアクティビティを指定します。これと一致し、セルラーゼへの追加の活動はCPH-βグルカン（大麦）に対して、CPH-キシログルカン（タマリンド）、CPH-キシラン（ブナ）と低活性CPH-ガラクトマンナン（ 図2B）に対して発見されました。グルコマンナンは試験しませんでした。同じCPH基板は市販の酵素（三つの異なる酵素濃度：0.1 U / mlで、0.5 U / mlおよび1.0 U / ml）で消化した前と同じ条件下で、陽性対照として使用し実験。全ての基質は、陽性対照の酵素によって分解された信号強度は、より高い酵素濃度（ 図2C）に対応する増加しました。 図2の 8つの異なるCPH基板を異なる濃度で、30分。A） エンド -cellulaseで消化異なるCPH基質の生成物プレートを25℃で攪拌しながらインキュベートした 。B）活性との様々な副活性の定量化エンド -cellulase。 。E-LAMSEとCPH-パキマン、CPH-カードラン、CPH-;エラーバーは、3つのレプリカC）に対応するCPH基板（エンド-セルラーゼおよび2-HE-セルロースとは異なる市販酵素の活性の平均値の標準誤差を表しますβグルカン（大麦）; E-XYAN4とCPH-キシラン、E-XEGPとCPH-キシログルカン、E-BLAAMとCPH-アミロース、E-BMACJとCPH-ガラクトマンナン;メガザイムからすべての酵素）。エラーバーは、2つのレプリカの平均値の標準誤差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 彼らは部分的にはバイオマスの主要成分である植物の細胞壁多糖類の自然な配置を維持するので、不溶性発色性バイオマス（ICB）基板は、発色基質のレパートリーに有用で加えています。 CPHとICB基板が液体培地で培養したときファネロカエテ・クリソスポリウムの分泌された酵素を分析するためにこの例で使用されています。アッセイキットプレートのプレート設定は19 CPH基板5 ICB基板（各基板、 図3Bは4ウェル）で、 図3Aに示されている。P.クリソスポリウムは cultivatました三日編、その後、培養上清を分析しました。したがって、125μlの200mMの緩衝液を各ウェルに移し、25μlの培養上清を添加しました。三つの異なるpH条件は、酢酸ナトリウム緩衝液pH 4.0、リン酸ナトリウム緩衝液pH 6.0またはpH 8.0（ 図3C）を用いて試験されてきました。プレートを2時間25℃で（150 rpm）を振とう培養しました。 反応生成物は、製品のプレート（ 図3D）に移し、そして分析した。P.クリソスポリウムは 、様々なグルカン、デンプンおよびキシラン（ 図3E）の分解酵素を生産します。下側の信号は、ヘミセルロースのアラビナン（甜菜）およびペクチンガラクタンのためだけでなく、RGI（大豆）のために検出することができました。産生される酵素は、中性またはわずかに塩基性条件下（pHは8.0）よりも酸性条件（pH値4.0）でより活性でした。 ICB基質に対する低い活性（ 図3F）多糖類はより自然な文脈である場合には、酵素の効率は純粋な多糖類と同じではないことを示している、それは生または事前に適用された場合ICB基板は、酵素の効率上のより現実的な見解を示さ理由です処理された植物材料。 19 CPHと5 ICB基板を含む複数の基板プレートを使用して、 ファネロカエテ・クリソスポリウム の3日齢の液体培養からの培養上清の 図3. スクリーニング 。A）各個別の基板のための4つのウェルを有するプレートのセットアップのスキーム（灰色の背景= CPH基板、オレンジ色の背景= ICB基板）。B）基質を含むアッセイプレートの写真。C）Schemeはその実験に用いた緩衝液条件を示します（200 mM酢酸ナトリウムpH4.0のリン酸ナトリウムpH6.0のリン酸ナトリウムのpHは8.0）。D）25℃Eで2時間後に、製品版の画像）吸光度を517 nmで検出し、各個々のCPH基板及びFに対してプロットしました。それぞれの酵素のための）ICB基板結果。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 発色基質は、単一の酵素を用いて、またはカクテル酵素1ウェルに異なる色CPH基質の混合物を用いて処置した後の反応上清を分析することによって相乗効果を研究するために使用することができます。 図4に示す次の例では、赤色CPHセルロース及び黄色CPHキシラン基質は約EQUで混合し96ウェルフィルタープレートのウェル中のAl比は、 図4（a）は、酵素なし（コントロール）、セルロースCEL（2 U / ml）を、キシラナーゼXYL（1 U / mL）で室温で1時間処理後の着色した反応生成物を示します両方の酵素の混合物を100 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH 4.5（3、各アプローチのために複製します）。分析のために、反応生成物は700nmで（ 図4B）に350nmでの吸光度スペクトルを走査することにより分光光度法で定量しました。多くの場合、単独で目視検査は、異なる色素から生じる吸収スペクトルは、各劣化の程度のより正確な指標を与えるために、単純な線形回帰8を使用して解決することができるが記録された酵素は、1つまたは複数の基板上に作用しているかどうかの指示を与えることができます混合物から基板。 混合物としてCPH基板を使用すると、実質的にSCRを可能にするアッセイのスループットを増大させます一つの実験（1ウェル）で、最大4つの異なる基板に対してeening。青CPH-βグルカン（大麦）、黄色CPH-キシラン（ブナ材）、緑CPHアミロースと赤CPH-ペクチンガラクタン（ルピナス）：示された例で使用される4つの異なる基質です。基板プレートのレイアウトは、 図4Cおよび図4Dにおけるアッセイプレートの画像に示されています。反応物を25℃、150rpmで30分間、100 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH 4.5で行いました。製品版で期待どおりに増加し、酵素濃度との最初の単一の酵素が対応するCPH基板（ 図4E）と着色上清を用いて試験したが受信された（ 図4F、行1A – 12D）。行Eが含まれているCPH-キシランと青CPH-βグルカン、 エンド -xylanaseおよびエンド -グルカナーゼ対応する酵素の異なる比で分解された2つの異なるCPH基板黄色。反応後、結果はvisibですル製品板で：より多くのエンドのグルカナーゼが存在した時に反応生成物の色は、暗い緑、青だった（ 図4F、4E-6E）およびエンド -xylanase濃度が増加したとき、軽い黄緑色に変わりました（ 図4F、10-12E）。同じことが、二枚の基板の赤CPH-ペクチンガラクタンと黄色のCPH-キシランは、 エンド -galactanaseおよびエンド -xylanaseで分解した行F、に見られます。すべての4つの異なる色のCPH基板が存在した（ 図4F、1G-12F）と単一酵素が適切なCPH基質を分解し、付加的な添加によって着色された反応生成物の組み合わせは受信された酵素。 図4. 異なる酵素で処理された二つの異なるCPH基板の組み合わせ、赤CPH-セルロースと黄色のCPH-キシラン、。 A）反応上清を反応上清のエンド -cellulase（ セル ）またはエンド -xylanase（XYL）または両方の酵素。B）吸光スペクトルを有する二枚の基板を処理した後。異なる酵素で処理された四つの異なるCPH基質の組み合わせC）CPH基板を含む基板プレートのスキーム：青CPH-βグルカン（大麦）、黄色CPH-キシラン（ブナ材）、緑CPHアミロースと赤CPH-ペクチンガラクタン（ルピナス）D）異なるCPH基質を含有するアッセイプレートの写真E）を添加酵素（名目濃度（NC）の比率を示す製品板のスキーム：GLU = 1 U / mlのエンド -グルカナーゼ、 25℃で30分間のインキュベーション後に製品版の= 1 U / mlのエンド -xylanase、 花子 = 5 U / mlのエンドアミラーゼとギャル = 0.5 U / mlのエンド -galactanase）。F）の画像をXYL。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 基板 ソース CPH -2-ヒドロキシ N / A （CPH-2-HEセルロース） CPH-アミロペクチンポテト CPH-アミロースポテト CPH-アラビナンテンサイ CPH-アラビノキシラン小麦 CPH-カゼイン牛乳 CPH-キトサン動物起源 CPH-カードラン アルカリゲネス・フェカリス CPH-デキストラン ロイコノストック属。 </eメートル> CPH-ガラクトマンナンイナゴマメ CPH-ラミナリン ラミナリアdigitata CPH-リケナンアイスランドの苔 CPH-メチルセルロース N / A CPH-パキマン ポリアココス CPH-ペクチンガラクタンポテト CPH-プルラン アウレオバシジウムプルランス CPH-ラムノガラクツロナンI（RG I） ポテト CPH-ラムノガラクツロナンI（-Gal）* ポテト CPH-ラムノガラクツロナン大豆 CPH-キシランブナ材 CPH-キシログルカンタマリンド大麦からCPH-βグルカン大麦オート麦からのCPH-βグルカンエンバク</td> 酵母からのCPH-βグルカン酵母 ICB-シロイヌナズナロゼットは、 シロイヌナズナ COL-0（成人の植物）の葉から ICB-シロイヌナズナの種子 シロイヌナズナ ICB-バガス サトウキビのofficinarum（乾燥した大人の植物、茎と葉） ICB結晶セルロース（濾紙） 商用たWhatman 3MM Chr関数クロマトグラフィー紙 ICB-フェヌグリーク種子 Trigonella属の種 ICB-麻 大麻属 （乾燥した大人の植物、茎と葉） ICB-ルピナス種子 ルピナスのangustifolius種子 ICB-花粉P. pratense チモシー花粉 ICB-トウヒ トウヒ属 （マイル満たさ木の幹） ICB-タバコ ベンサミアナタバコの葉から（若い植物） ICB-麦わら コムギ属 （乾燥した大人の植物、茎と葉） ICB-ヤナギ ヤナギ属 （乾燥した大人の植物、粉砕された木の幹） ICB-ソルガム ソルガム属 （大人植物から葉） *（ エンド -β-1,4-D-ガラクタで除去β-1,4-D-ガラクタン側鎖） 表1. 利用可能な発色性高分子ハイドロゲル（CPH）と不溶性発色バイオマス（ICB）基板の一覧。