Criblage à haut débit d'Enzymes Glucides dégradant Utilisation Novel Insoluble chromogénique Substrat Assay Kits

Le haut-débit et la capacité de multiplexage de ce test est basé sur un polymère insoluble dans chromogénique (ou protéine) hydrogel (CPH) des substrats disposés dans des plaques filtrantes à 96 puits. Les enzymes ainsi que des contrôles négatifs sont ajoutés à la plaque de kit d'essai (figure 1A) et les enzymes dégradent le substrat correspondant à produire un surnageant coloré (figure 1B). Une fois la réaction terminée, le surnageant est transféré dans une plaque de produit limpide puits et l'absorbance peut être mesurée directement à l' aide d' un spectrophotomètre approprié pour des plaques à 96 puits (figure 1C). Un exemple d'une réponse à la dose de CPH-arabinoxylane xylanase à différentes concentrations de l'enzyme (0,00 à 0,75 U / ml) est représenté sur la figure 1D , lorsque la concentration d'enzyme décroissante peut être observée visuellement. A quant spectrophotométrique plus détailléification peut être utilisé pour tracer l'absorbance en fonction de la concentration enzymatique (figure 1E). L'intensité du signal correspondant à l'activité enzymatique. La reproductibilité du test est indiquée par les barres d'erreur (erreur standard de la moyenne, SEM, de trois répliques). Des expériences plus détaillées sur la reproductibilité de cet essai sont publiés ailleurs 8. Figure 1. Traitement xylanase de CPH-arabinoxylane. A) Un schéma de la plaque de kit d'essai avec le substrat CPH (par exemple, CPH-arabinoxylane) chargé dans 96 puits puits de plaques de filtre juste avant l'addition d'enzymes 1 et 2 et le tampon contrôle -seulement (enzyme 1 avait une activité -xylanase endo); B) dégradation de CPH-arabinoxylane par l' enzyme 1 produit un surnageant de couleur; C) Sur Filtrat sous vide assistéion des surnageants de la plaque de produit, l'absorbance est mesurée par spectrophotométrie; D) , la plaque de produit contenant les produits de réaction après le traitement de CPH-arabinoxylane en 4 couleurs différentes avec différentes concentrations de l' endo -β-1,4-xylanase dans 100 mM tampon d'acétate de sodium, pH 4,5 pendant 60 min à température ambiante;. E) Quantification des produits de réaction de D à l' aide de spectrophotométrie S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Il existe différentes options pour l'utilisation de ce test dans le dépistage enzyme. Une option consiste à utiliser une plaque de 96 puits contenant différents polysaccharides pour le dépistage, par exemple, un petit nombre de (purifié) endo -enzymes avec une activité inconnue. Dans ce cas, le résultat montrera que les polysaccharides sont Dégradmesure par l'enzyme cible. Pour afficher ce principe, un -cellulase endo a été testée contre différents substrats CPH à 25 ° C. Trois concentrations différentes d'enzyme (0,5 U / ml, 1,0 U / ml et 5 U / ml) ont été incubées pendant 30 min. Le résultat est clairement visible dans la plaque de produit (figure 2A). La fiche produit pour cette endo -cellulase fourni par le fournisseur spécifie côté-activité pour le xyloglucane (tamarin), orge β-glucanes, glucomannane, xylane Birchwood et côté bas-activité pour galactomannane. Conformément à cela, l' activité supplémentaire pour cellulase a été trouvée contre CPH-β-glucane (orge), CPH-xyloglucane (tamarin), CPH-xylane (hêtre) et une faible activité contre CPH-galactomannane (figure 2B). Glucomannan n'a pas été testé. Les mêmes substrats de MNC ont été digérés avec les enzymes disponibles dans le commerce (trois différentes concentrations d'enzyme: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml et 1,0 U / ml) utilisés en tant que témoins positifs dans les mêmes conditions que le précédentexpérience. Tous les substrats ont été dégradés par l'enzyme témoin positif et l'intensité de l' augmentation du signal correspondant à une concentration plus élevée de l' enzyme (figure 2C). Figure 2. Huit substrats CPH différentes ont été mises en incubation sous agitation à 25 ° C pendant 30 min. A) La plaque de produit de substrats différents CPH digérées avec une endo -cellulase, à différentes concentrations. B) Quantification de l'activité et de diverses activités latérale endo -cellulase. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne de trois répliques C) de l' activité de différentes enzymes commerciales au substrat correspondant CPH (endo-cellulase et 2-HE-cellulose;. E-LAMSE et CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-glucane (orge); E-XYAN4 et CPH-xylane, E-XEGP et CPH-xyloglucane, E-BLAAM et CPH-amylose, E-BMACJ et CPH-galactomannane; toutes les enzymes de Megazyme). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne des deux répliques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. La biomasse chromogénique (ICB) substrats insolubles sont un complément utile au répertoire de substrat chromogène parce qu'ils conservent en partie la disposition naturelle des polysaccharides dans les parois des cellules végétales qui sont le constituant majeur de la biomasse. CPH et ICB substrats sont utilisés dans notre exemple pour analyser les enzymes sécrétées de Phanerochaete chrysosporium lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu liquide. La configuration de la plaque de la plaque de kit d'essai est représenté sur la figure 3A, avec 19 CPH substrats et 5 substrats ICB (4 puits pour chaque substrat, figure 3B). P. chrysosporium était cultivated pendant trois jours, puis le surnageant de culture analysée. Par conséquent, 125 ul de tampon 200 mM a été transféré à chaque surnageant de culture bien et 25 ul ajouté. Trois conditions de pH différentes ont été testées en utilisant un tampon d'acétate de sodium à pH 4,0, un tampon de phosphate de sodium pH 6,0 ou pH 8,0 (figure 3C). La plaque a été incubée sous agitation (150 rpm) à 25 ° C pendant 2 heures. Les produits de réaction ont été transférés dans la plaque de produit (figure 3D) et analysées. P. chrysosporium produit des enzymes pour la dégradation de divers glucanes, l' amidon et les xylanes (Figure 3E). des signaux plus faibles pourraient être détectés pour la hémicelluloses arabinan (betterave à sucre) et galactane pectique ainsi que pour RGI (soja). Les enzymes produites étaient plus actives dans des conditions acides (pH 4,0) que dans des conditions neutres ou légèrement basiques (pH 8,0). Activité inférieure vers des substrats ICB (Figure 3F)démontre que lorsque les polysaccharides sont dans un contexte plus naturel, l'efficacité de l'enzyme est pas de même qu'avec un polysaccharide pur et qui est la raison pour laquelle les substrats d'AOI montrent une vue plus réaliste de l'efficacité enzymatique, si elle était appliquée à la matière première ou pré matériel végétal traité. Figure 3. Projection d'un surnageant de culture à partir d' une ancienne culture de Phanerochaete chrysosporium liquide 3 jours en utilisant une plaque de substrat multicouche contenant 19 CPH et 5 ICB substrats. A) un schéma de la configuration de la plaque avec 4 puits pour chaque substrat individuel (fond gris = substrats CPH, fond orange = substrats AOI). B) Photo de la plaque d'essai contenant le substrat. C) Schéma montrant les conditions de tampon utilisées dans cette expérience (200 mM d' acétate de sodium pH 4,0, le phosphate de sodium pH 6,0 et de phosphate de sodium pH 8,0). D) image de la plaque de produit après 2 heures à 25 ° C. E) absorbances ont été détectés à 517 nm et tracées pour chaque substrat CPH individuel et F ) les résultats de substrat ICB pour les enzymes respectives. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Les substrats chromogènes peuvent également être utilisés pour étudier les effets synergiques en utilisant un mélange de différents substrats colorés MNC dans un puits et l'analyse du surnageant de réaction après le traitement en utilisant des enzymes uniques ou des cocktails d'enzymes. Dans l'exemple suivant représenté sur la figure 4, la cellulose CPH-rouge et des substrats CPH-xylane jaune ont été mélangés à un peu près équAl dans 96 puits , les puits des plaques de filtre. La figure 4A montre les produits de réaction de couleur après un traitement de 1 heure à température ambiante, sans enzyme (témoin), de la cellulose cel (2 U / ml), la xylanase xyl (1 U / ml) et mélange des deux enzymes (3 répétitions pour chaque méthode) dans 100 mM de tampon acétate de sodium pH 4,5. Pour l' analyse, le produit réactionnel a été quantifié par spectrophotométrie en balayant le spectre d'absorbance de 350 nm à 700 nm (figure 4B). Souvent , une inspection visuelle seule ne peut donner une indication si l'enzyme agit sur ​​un ou plusieurs substrats, cependant enregistré les spectres d'absorption provenant de différents colorants peuvent également être résolu en utilisant une régression linéaire simple 8 pour donner une indication plus précise de l'ampleur de la dégradation de chaque substrat à partir du mélange. En utilisant des substrats sous forme de mélanges CPH sensiblement ajoute au débit de l'essai, ce qui permet screening contre un maximum de 4 substrats différents dans une expérience (un puits). Dans l'exemple illustré quatre substrats différents utilisés: CPH-de β-glucane bleu (orge), jaune CPH-xylane (hêtre), vert CPH-amylose et rouge CPH-pectique galactane (lupin). La disposition de la plaque de substrat est représentée sur la figure 4C et une image de la plaque d'essai sur la figure 4D. La réaction a été réalisée dans 100 mM de tampon acétate de sodium pH 4,5 pendant 30 min à 25 ° C et à 150 tours par minute. Premières enzymes individuelles avec augmentation de la concentration de l' enzyme ont été testées avec le substrat correspondant CPH (Figure 4E) et le surnageant de couleur a été reçu comme prévu dans la plaque de produit (Figure 4F, ligne 1A – 12D). La ligne E contenait les deux substrats différents CPH jaune CPH-xylane et le bleu CPH-β-glucanes qui ont été dégradées avec différents rapports des enzymes correspondantes endo -xylanase et d' endo – glucanase. Après la réaction, le résultat est Visible dans la plaque de produit: la couleur du produit de réaction était plus sombre vert-bleu, lorsque plus endo glucanase était présent (Figure 4F, 4E-6E) et transformé en un jaune-vert clair, lorsque la -xylanase concentration endo augmenté ( Figure 4F, 10-12E). La même chose est visible dans la ligne F, où les deux substrats rouge de galactane CPH-pectique et jaune CPH-xylane ont été dégradés avec endo -galactanase et endo -xylanase. Tous les quatre substrat MNC de couleur différente sont présents (figure 4F, 1G-12F) et des enzymes uniques dégradé le substrat CPH approprié et en ajoutant des enzymes supplémentaires d' une combinaison des produits de réaction de couleur a été reçue. La figure 4. Une combinaison de deux substrats différents CPH, CPH-cellulose , rouge et jaune CPH-xylane, traitée avec des enzymes différentes. UNE) Surnageants de réaction après un traitement de deux substrats avec endo -cellulase (cel) ou endo -xylanase (xyl) ou les deux enzymes. B) des spectres d' absorbance des surnageants de réaction. Une combinaison de quatre substrats CPH différents traités avec différentes enzymes C) Schéma de la plaque de substrat contenant les substrats CPH:. Bleu CPH-β-glucane (orge), jaune CPH-xylane (hêtre), vert CPH-amylose et CPH- rouge galactane pectique (lupin) D) Image de la plaque d'essai contenant les différents substrats CPH E) Schéma de la plaque du produit faisant apparaître le rapport des enzymes ajoutées (concentrations nominales (NC):.. glu = 1 U / ml endo glucanase, Xyl = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo amylase et gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Photo de la plaque de produit après incubation de 30 min à 25 ° C. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Substrat La source CPH-2-hydroxyéthylcellulose N / A (CPH-2-HE-cellulose) CPH-amylopectine pomme de terre CPH-amylose pomme de terre CPH-arabinan Betterave à sucre CPH-arabinoxylane blé CPH-caséine lait de vache CPH-chitosan origine animale CPH-curdlan Alcaligenes faecalis CPH-dextran Leuconostoc spp. </em> CPH-galactomannane caroube CPH-laminarine Laminaria digitata CPH-lichénane mousse islandaise CPH-méthylcellulose N / A CPH-pachyman Poria cocos CPH-pectique galactane pomme de terre CPH-pullulane Aureobasidium pullulans CPH-rhamnogalacturonane I (RG I) pomme de terre CPH-rhamnogalacturonane I (Gal) * pomme de terre CPH-rhamnogalacturonane soja CPH-xylane Beechwood CPH-xyloglucane Tamarin CPH-β-glucanes de l'orge orge CPH-β-glucanes d'avoine à partir avoine </td> CPH-β-glucane de levure Levure ICB-Arabidopsis Rosette part de Arabidopsis thaliana Col-0 (plante adulte) graines ICB-Arabidopsis Arabidopsis thaliana ICB-bagasses Saccharum officinarum (plante adulte séchée, tige et feuilles) cellulose ICB-cristallin (papier filtre) papier Whatman 3MM Chr Chromatographie commerciale graines ICB-fenugrec Trigonella spp. Graines ICB-chanvre Cannabis spp. (Plante adulte séchée, tige et feuilles) graines ICB-lupin Lupinus angustifolius graines ICB-pollen P. pratense Phleum pratense pollen ICB-épinette Picea spp. (Miarbre LLED du tronc) ICB-tabac feuilles de Nicotiana benthamiana (jeune plante) paille ICB-blé Triticum spp. (Plante adulte séchée, tige et feuilles) ICB-willow Salix spp. (Plante adulte séché, arbre blanchi tronc) ICB-Sorgho Sorghum spp. (Feuilles de la plante adulte) (chaînes latérales β-1,4-D-galactane enlevés avec endo -β-1,4-D-galactanase de) * Tableau 1. Liste des disponibles chromogénique Polymer Hydrogel (CPH) et Insoluble chromogénique Biomasse (ICB) substrats.