فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم
Summary
A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.
Abstract
Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme’s biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.
Introduction
Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.
We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.
One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8.
The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).
CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نستخدم جيل جديد من CPH وICB ركائز متعددة الألوان التي تعتمد على الأصباغ chlorotriazine (قائمة كاملة من ركائز في الجدول 1) مرتبة في العرف تصميم عدة فحص التجارية. انزيم الهضم من ركائز غلة صغيرة، قابلة للذوبان، ومنتجات مصبوغ والتي يمكن كشفها في حل الاختبار، ويمكن أن يكون كميا باستخدام قارئ لوحة 9. تم تصميم هذا الاختبار لتقييم إندو -acting الانزيمات وحساسية الفحص مشابه لاحد باستخدام azurine عبر ربط (AZCL) ركائز 10، في حين أن الوسائل الأخرى المتاحة لإكسو الانزيمات -acting 11،12. الحد من هذه المجموعة الفحص تكمن في الكشف عن إندو -enzyme النشاط، كما CPH فضلا عن ركائز ICB ليست للتحلل من قبل -enzymes الأرجح إكسو بسبب عائق الفراغية الناتجة عن الصبغة وcrosslinker جزيئات 8.
يتم إجراء الفحص في 96 أهلا وسهلاشكل لتر وردود الفعل الفردية تتم في الآبار. رد الفعل يجب أن تكون مختلطة في لوحة لاستقبال البيانات استنساخه. وتصفية supernatants مما أدى إلى لوحة المنتج حيث الامتصاصية من كل جانب يمكن قياسها كميا باستخدام الامتصاص الطيفي. وترد المبادئ الأساسية والتخطيط للفحص في الشكل 1. الفحص يتكون من لوحة فحص (مرشح لوحة 96 أيضا) مع ركائز، وبعد الحضانة مع الانزيمات، ويتم تصفية طاف خلال في لوحة جيدا واضحة وتتم قراءة الامتصاصية توفير قياس نصف الكمية من خصوصية الإنزيم والنشاط. فقد تبين أن هذا الفحص فحص باستخدام ركائز CPH يمكن أن تستخدم أيضا في شكل لوحة أجار، حيث خلق منتجات التفاعل القابلة للذوبان هالة ملونة بعد الحضانة بين عشية وضحاها. 8
مجموعات الفحص يمكن استخدامها لفحص انزيمات النقاء والأنشطة الجانبية المحتملة كما هو موضح فيالرقم 2، ويمكن-الأنشطة الجانبية تنشأ من إنزيم واحد وخصوصيته منحل ولكن أيضا من حقيقة أن العينات التى تم تحليلها هي مزيج من الإنزيمات المختلفة وتأثيرها تآزر يحتاج إلى دراسة. بالإضافة إلى ذلك، كما ثبت ذلك في دراسات سابقة، أن الكوكتيلات الانزيم، والقناة الهضمية الجراثيم 13 و ثقافة مرق من الفطريات 8 وكذلك الذاتية انزيم النباتية والبكتيريا (بيانات غير منشورة) يمكن استخدامها كمصدر للإنزيم.
ركائز ICB معالجة مخاليط معقدة من مكونات جدار الخلية اجه كثير من الأحيان في العمليات الصناعية من انهيار الكتلة الحيوية. وقد تم تصميم هذه ركائز لتقييم توافر السكاريد وتقديم معلومات حول كيفية تحسين فعالية الكوكتيلات تدهور للإخراج تدهور أكثر كفاءة. كما هو موضح في الشكل (3) CPH وICB ركائز يمكن استخدامها في الإنزيم جانب فحص من قبل الجانب – وكشف عن ثروة من المعلومات حول خصوصية انزيمالنشاط د في كل سياق الركيزة المفضلة (CPH) ومجمع أكثر طبيعية تحتوي على مكونات أخرى بالإضافة إلى الركيزة المفضلة محاكاة عن كثب على تجمع لجزيئات الموجودة في الطبيعة (ICB). استخدام ألوان متعددة يسمح للكشف في وقت واحد من الأنشطة الإنزيمية المختلفة ضد عدة ركائز مما يزيد من الإنتاجية العالية وmultiplexity من الفحص. أطياف الأصباغ المختلفة يمكن حلها عن طريق الانحدار الخطي البسيط وفي معظم الحالات النشاط متعددة الركيزة يمكن ملاحظتها عن طريق التفتيش البصري وحده. ويصور مثال محاكاة هذه التجربة ونتائجها في الشكل (4).
هذه الأدوات فحص وبراعة تطبيقه تناسب بشكل جيد للغاية للكشف عن المستوى الأول من الانزيمات والمرق الثقافة مع الأنشطة غير معروفة. وأهم جوانب هذا الاختبار هي طبيعة الإنتاجية العالية لها، التفصيل، وسهولة الاستخدام والمرونة. مع أخذ ذلك في الاعتبار، ثه ويعتقد أن هذه المجموعة رواية من الأدوات سوف تحسن كثيرا وتسريع عمليات الفرز الانزيم في الصناعة وكذلك التطبيقات الأكاديمية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر البروفيسور جون بول نوكس (جامعة ليدز، المملكة المتحدة)، الذين قدموا الوصول إلى مختبراته للتصوير، وسوزان ماركوس لتقديم المساعدة التقنية الممتازة. شبيبة يقر مشروع WallTraC (البرنامج الإطاري السابع المفوضية الأوروبية (اتفاقية منحة لا: 263916) والكتلة الحيوية المشروع للقرن ال21 (الابتكار الأساس الدنمارك، القضية رقم: 103408) SKK وشكر المشروع SET4Future (مجلس البحوث الاستراتيجية الدنماركية)، والاستراتيجية الحيوية القيمة التي أسسها المجلس الدانمركي للبحوث الاستراتيجية، والمجلس الدانمركي للتكنولوجيا والابتكار (جرانت القضية رقم: 0603-00522B)، ونهج يحركها الأحياء لفهم تدهور الأنزيمية من السكاريد نظم مجمع (جرانت القضية رقم .:. 107279) للحصول على التمويل وتعكس هذه الورقة آراء المؤلفين فقط الاتحاد الأوروبي ليست مسؤولة عن أي استخدام يمكن أن تكون مصنوعة من المعلومات تتضمن هذه الوثيقة.
Materials
| assay kit plates | Glycospot | customized assay kit plates | |
| activation solution | Glycospot | for activating CPH substrates | |
| 350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold | Pall Corporation | 5015 | spacer block |
| 96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile | Millipore | MSHVN4510 | assay plate |
| 96-Well Microplates, Polypropylene | Greiner Bio-One | 651201 | collection plate after washing the substrates |
| Nunc™ MicroWell™ 96-Well Microplates | Thermo Scientific | 269620 | product plate |
| Diaphragm pump MZ 2 NT | Vacuubrand | 732000 | vacuum pump used with the vacuum manifold |
| Infors HT Ecotron | Infors HT | 4950132 (Buch & Holm) | horizontal shaker |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | 10067-750 (VWR) | 96-well plate absorbance reader |
| Vacuum manifold | Pall Corporation | 5017 | vacuum manifold |
| endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) | Megazyme | E-CELTR | cellulase [cel] |
| endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus) | Megazyme | E-BMACJ | mannanase [man] |
| endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) | Megazyme | E-LAMSE | β-glucanase [glu] |
| endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger) | Megazyme | E-EGALN | galactanase [gal] |
| endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger) | Megazyme | E-XYAN4 | xylanase [xyl] |
| endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.) | Megazyme | E-XEGP | xyloglucanase [xg] |
| α-amylase (Bacillus licheniformis) | Megazyme | E-BLAAM | amylase [amy] |
References
- Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).
- Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).
- Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography. Biotechnol. Lett. 26 (15), 1207-1211 (2004).
- Black, G. E., Fox, A. Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 720 (1-2), 51-60 (1996).
- Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).
- Somogyi, M. Notes on Sugar Determination. J. Biol. Chem. 195 (1), 19-23 (1952).
- Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms. Biotechniques. 33 (4), 798 (2002).
- Kračun, S. K., et al. A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes. Biotechnol Biofuels. 8, (2015).
- Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity. J. Biotechnol. 103 (3), 203-212 (2003).
- Nyyssonen, M., et al. Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries. Front Microbiol. 4, 282 (2013).
- Sweeney, M. D., Xu, F. Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments. Catalysts. 2 (2), 244-263 (2012).
- Biely, P., et al. Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose. J. Biotechnol. 151 (1), 137-142 (2011).
- Mackenzie, A. K., et al. A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility. Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).
