JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Published: September 20, 2016
doi:
10.3791/54286
, ,
1Department for Plant and Environmental Sciences,University of Copenhagen, 2School of Agriculture, Food and Rural Development,Newcastle University

Summary

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Abstract

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme’s biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

Introduction

Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.

We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.

One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8.

The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).

CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.

Protocol

1. хромогенного анализа с CPH субстраты в 96-луночный планшет формата Активация набора для анализа пластины Активация фильтра 96-луночного (содержащий синий CPH-ксилана) набор для анализа пластины (список материалов) путем добавления 200 мкл раствора, полученного активации (с комплектом) в каждую лунку с последующим 10 мин инкубации при комнатной температуре без перемешивания. Применение вакуума с помощью вакуумного коллектора (с распорной блок внутри и любого стандарта, прозрачный 96-луночный планшет в виде коллекции пластины), чтобы удалить из дошедших до нас активирующего раствора. Кроме того, можно использовать центрифугу при 2,700 мкг в течение 10 мин для этого шага вместо вакуумного коллектора. Вымойте КПВ субстратов путем добавления 100 мкл стерильной воды и применять вакуум (или центробежной силы) для удаления стабилизатора. Повторите этот шаг еще два раза и планшеты теперь готовы к использованию. ферментной реакции Примечание: Всегда включайте буферв одиночку в качестве отрицательного контроля, и, если возможно, ранее охарактеризованными ферментами в качестве положительных контролей. Используйте статистически необходимое количество повторов. КПВ субстраты стабильны при рН от 3,0 до 10,0 и от общего объема раствора конечного буфера фермента в каждую лунку, не должна превышать 180 мкл. Экстракт из растений или культуральный бульон также может быть использован вместо очищенного раствора фермента. Добавьте 150 мкл 100 мМ натрий – ацетатного буфера, рН 4,5 , и 5 мкл эндо -cellulase раствора (до конечной концентрации 1 ед / мл) в каждую лунку набора для анализа пластины. Поместите продукт пластину (ясный-луночный планшет совместим с читателем Микротитровальный пластины) под набор для анализа пластины для сбора любой потенциальной утечки из реакционной пластины при сотрясении. Выдержите набора для анализа пластины при температуре 25 ° С в течение 30 мин в горизонтальном шейкере при 150 оборотах в минуту. Примечание: Смешивание реакции в набор для анализа пластины во время инкубации имеет решающее значение для достижения последовательного и репроприводима результат. CPH субстраты стабильны до 90 ° C. Время инкубации должна быть увеличена до 24 часов при испытании культуральных бульонах, содержащих неизвестные концентрации фермента с CPH субстратов. Следует отметить, что соответствующие периоды инкубации зависят от активности фермента (ов), но в общем случае, если не обнаружено активности в течение 24 часов, вполне вероятно, что фермент не будет ухудшать тестируемый субстрат. Активный фермент деградирует нерастворимых хромогенные полисахаридами КПВ субстрата в растворимые хромогенных олигосахариды, которые видны в виде окрашенного супернатанта. Поместите чистую тарелку продукта внутри вакуумного коллектора с распорного блока внутри. Поместите пластину набора для анализа на верхней и применять вакуум (максимальное отрицательное давление -60 кПа). Кроме того, можно использовать центрифугу при 2,700 мкг в течение 10 мин. Примечание: Фильтрат , содержащий цветные олигосахариды в качестве продукта реакции теперь в продукте пластины для дальнейшего анализа 8 </sвверх>. Обнаружение и Количественное Убедитесь, что объем жидкости в каждую лунку продукта пластины примерно одинакова при визуальном осмотре. Измерить оптическую плотность сбора пластины при 595 нм для синего CPH-ксилана, используя планшет-ридер. При выполнении анализа данных, вычесть буфера только отрицательные контрольные значения из значений из скважин, где был добавлен фермент. Рассчитывают среднее значение и стандартное отклонение от средств (SEM) из дублированных лунках 8. 2. хромогенного анализа с МКТ Подложки в формате 96-луночного ферментной реакции Добавляют 150 мкл 100 мМ ацетата натрия буфера, рН 4,5 , и 5 мкл 31 ед / мл эндо -xylanase раствора в каждую лунку набора для анализа пластины , содержащей красный МКТ-пшеничной соломы (конечная концентрация фермента в скважине: 1 ед / мл) , Примечание: Набор для анализа пластины (96-луночного фильтр плАтес содержащие ICB субстраты) производятся, как описано в литературе (см перечень материалов). МБК субстратами являются стабильными в буферах при рН в диапазоне между рН 3,0 до 10,0. Всегда включать только буфер в качестве отрицательного контроля, коммерческие ферменты в качестве положительного контроля и использовать статистически соответствующее количество копий. Не активировать ICB субстраты, как пластины CPH подложки, но удалить стабилизатор промывкой три раза с 100 мкл воды, а затем с помощью вакуумной фильтрации или центрифугирования. Поместите пластину продукта под пластиной подложки для сбора любой потенциальной утечки из пластины подложки при сотрясении. Инкубируйте реакции при 25 ° С, встряхивая при 150 оборотах в минуту в течение 2 часов. Примечание: активный фермент деградирует нерастворимых хромогенные полисахариды в ICB субстрата в растворимые олигосахариды, которые видны как цветная супернатанта. ICB субстраты стабильны до 90 ° C. Инкубационный тIME должен быть увеличен до 24 часов, если неочищенные ферменты, такие как культуральных бульонов используются. Поместите пластину продукта внутри вакуумного коллектора с распорного блока внутри. Поместите пластину набора для анализа на верхней и применять вакуум (максимальное отрицательное давление -60 кПа) или использовать центрифугу для фильтрата продукта из набора для анализа пластины в лунку продукта пластины. Примечание: Фильтрат , содержащий цветные олигосахариды в качестве продукта реакции в настоящее время в коллекции пластины для дальнейшего анализа 8. Обнаружение и количественное определение Убедитесь, что объем жидкости в каждую лунку для сбора пластины приблизительно одинакова при визуальном осмотре. Измерить оптическую плотность сбора пластины при 517 нм для красного ICB-пшеничной соломы с использованием планшет-ридера. При выполнении анализа данных – вычесть буфер – только отрицательные контрольные значения из значений из лунок, где ферментбыл добавлен. Рассчитывают среднее значение и стандартное отклонение от средств (SEM) из дублированных лунках 8. Примечание: В случае скрининга неизвестных ферментов, мы предлагаем сделать серию разбавления, чтобы получить более подробные данные о динамическом диапазоне активности фермента.

Representative Results

С высокой пропускной способностью и мультиплексирование способность данного анализа основан на нерастворимый полимер хромогенный (или белок) гидрогеля (CPH) подложках, расположенных в 96-луночные фильтровальные планшеты. Ферменты, так и отрицательные элементы управления добавляются в набор для анализа пластины (рис 1А) и ферменты , деградируют соответствующую подложку , продуцирующих цветной супернатант (Фигура 1В). После завершения реакции, супернатант переносили в пластинчатое изделие ясно-луночного и оптическую плотность можно измерить непосредственно с помощью спектрофотометра , подходящий для 96-луночные планшеты (рис 1C). Пример ответа дозы СРН-арабиноксилана к ксиланазы при различных концентрациях фермента (0,00 – 0,75 ед / мл), показан на рис 1D , где уменьшением концентрации фермента можно наблюдать визуально. Более подробное спектрофотометрический Quantфикация может быть использован для построения поглощения в зависимости от концентрации фермента (рис 1E). Интенсивность сигнала соответствует активности фермента. Воспроизводимость анализа показана Столбики ошибок (стандартная ошибка среднего значения, SEM, из трех реплик). Более детальные эксперименты по воспроизводимости этого анализа опубликованы в другом месте 8. Рисунок 1. Ксиланазная лечение СРН-арабиноксилана. А) показана схема набора для анализа пластины с КПВ субстратом (например, CPH-арабиноксилан) загружают в 96-луночных лунки фильтрационного планшета непосредственно перед добавлением ферментов , 1 и 2 , и буфер -только контроль (фермент 1 имел эндо -xylanase активность); Б) Деградация CPH-арабиноксилана ферментом 1 получают цветной супернатант с) при вакууме при содействии filtratиона супернатантов в к пластинчатому изделию, абсорбция измеряется спектрофотометрически; D) , пластина продукт , содержащий продукты реакции после обработки СРН-арабиноксилана в 4 -х различных цветов с различными концентрациями эндо -р-1,4-ксиланазы в 100 мМ ацетатный буфер натрия, рН 4,5 в течение 60 мин при комнатной температуре, д . ) Количественная продуктов реакции из D с помощью спектрофотометрии Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Существуют различные варианты использования этого анализа в ферментной скрининга. Один из вариантов заключается в использовании 96-луночного планшет, содержащий различные полисахариды для скрининга, например, небольшое количество (очищенного) эндо -enzymes с неизвестной активностью. В этом случае результат покажет, какие полисахаридами являются degradв состоянии с помощью фермента-мишени. Чтобы показать этот принцип, эндо -cellulase тестировали против различных CPH субстратов при 25 ° C. Три различные концентрации фермента (0,5 Ед / мл, 1,0 ед / мл и 5 ед / мл) инкубировали в течение 30 мин. Результат хорошо виден в табличке (фиг.2А). Лист продукт для этого эндо -cellulase предоставленного поставщиком определяет побочный активность для ксилоглюкана (тамаринд), ячменя бета-глюкан, глюкоманнан, Birchwood ксилана и низкую боковую активность для галактоманнану. В соответствии с этим, деятельность в дополнение к целлюлазы была обнаружена против CPH-бета-глюкан (ячмень), CPH-ксилоглюкан (тамаринд), CPH-ксилана (букового) и низкой активностью в отношении CPH-галактоманнану (рис 2B). Глюкоманнан не был протестирован. Те же CPH субстраты были переварены коммерческими доступными ферментами (три различные концентрации фермента: 0,1 ед / мл, 0,5 ед / мл и 1,0 ед / мл) использовали в качестве положительного контроля, при тех же самых условиях, чем предыдущийэксперимент. Все основы были деградирует с помощью положительного контроля фермента и интенсивность сигнала увеличилась , соответствующая более высокой концентрации фермента (фиг.2с). Рисунок 2. Восемь различных CPH субстратов инкубировали при перемешивании при 25 ° С в течение 30 мин. A) Продукт пластины из различных субстратов CPH переваривают с эндо -cellulase, при различных концентрациях. В) Количественное деятельности и различные побочные активности эндо -cellulase. Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку среднего значения трех реплик C) активности различных коммерческих ферментов к соответствующему CPH подложке (эндо-целлюлазы и 2-HE-целлюлозы;. E-LAMSE и CPH-pachyman, CPH-курдлан, CPH- β-глюкан (ячмень); E-XYAN4 и CPH-ксилана, E-XEGP и СРH-ксилоглюкан, E-BLAAM и CPH-амилозы, E-BMACJ и CPH-галактоманнановый; все ферменты из Megazyme). Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку среднего значения двух реплик. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Нерастворимые хромогенная биомасса (ICB) подложки являются полезным дополнением к хромогенного субстрата репертуара, поскольку они сохраняют частично естественное расположение полисахаридами в стенках клеток растений, которые являются основным компонентом биомассы. CPH и ICB субстраты используются в нашем примере для анализа секретируемые ферменты Phanerochaete Chrysosporium при культивировании в жидкой среде. Установка пластины из набора для анализа пластины показан на фигуре 3А, с 19 CPH подложек и 5 МКТ субстратов (4 лунки для каждой подложки, рис 3B). П. Chrysosporium был cultivatред в течение трех дней, а затем супернатант культуры анализировали. Таким образом, 125 мкл 200 мМ буфер переносили в каждую лунку и по 25 мкл супернатанта культуры добавили. Три различных значения рН были протестированы с использованием буферного раствора ацетата натрия , рН 4,0, натрий – фосфатного буфера рН 6,0 или при рН 8,0 (3С). Планшет инкубировали в встряхивании (150 оборотов в минуту) при 25 ° С в течение 2 часов. Продукты реакции были переведены на табличке (рис 3D) и проанализированы. П. Chrysosporium полученных ферментов для расщепления различных глюканов, крахмал и ксиланов (рис 3e). Более низкие сигналы могут быть обнаружены для arabinan гемицеллюлоз (сахарная свекла) и пектинового галактана, а также для RGI (сои). Ферменты, синтезируемые были более активны в кислой среде (рН 4,0), чем в нейтральной или слегка щелочной среде (рН 8,0). Нижняя активность по отношению к МКТ субстратов (рис 3F)показывает, что, когда Полисахариды в более естественном контексте, эффективность фермента не то же самое, как с чистым полисахарида, и именно поэтому ICB субстраты демонстрируют более реалистичное представление о ферментативной эффективности, если она была применена к сырой или предварительно обработке растительного материала. Рисунок 3. Скрининг супернатанта культуры из 3-дневного возраста жидкой культуры Phanerochaete Chrysosporium с использованием мульти подложки планшет, содержащий 19 CPH и 5 ICB субстратов. А) схема установки плиты с 4 -х скважин для каждой отдельной подложки (серый фон = CPH субстраты, оранжевый фон = ICB субстраты). B) Изображение планшета для анализа , содержащей подложку. C) Схема , показывающая условия буфера , используемого в этом эксперименте (200 мМ ацетат натрия , рН 4,0, натрия фосфат рН 6,0 и фосфата натрия , рН 8,0). D) , изображение продукта пластины после того, как 2 ч при 25 ° С. Е) спектральной поглощательной способности были обнаружены при 517 нм и наносили на график для каждой отдельной подложки СРН и F ) результаты ICB субстратом для соответствующих ферментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Хромогенные субстраты могут быть также использованы для изучения синергического эффекта при использовании смеси различных цветных CPH субстратов в одной скважине и анализом реакционной надосадочной жидкости после обработки с использованием одиночных ферментов или энзимов коктейли. В следующем примере , показанном на фиг.4, красный CPH-целлюлоза и желтые CPH-ксилана субстратов смешивали вместе при приблизительно фасОтношение Al в 96-луночных лунки фильтрационного планшета. На фиг.4А показаны окрашенные продукты реакции после обработки 1 ч при комнатной температуре, без фермента (контроль), целлюлоза CEL (2 ед / мл), ксиланазы Xyl (1 ед ​​/ мл) и смесь обоих ферментов (3 реплицируется для каждого подхода) в 100 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 4,5. Для анализа, продукт реакции количественно спектрофотометрически путем сканирования спектра поглощения от 350 нм до 700 нм (рис 4б). Часто в одиночку визуальный осмотр может дать указание о том, действует фермент на одной или нескольких подложек, однако регистрируются спектры поглощения , вытекающие из различных красителей также могут быть решены с помощью простой линейной регрессии 8 , чтобы дать более точное представление о степени деградации каждого подложка из смеси. Использование CPH субстраты в виде смесей существенно повышает пропускную способность анализа, что позволяет ОПЗeening против до 4-х различных субстратов в одном эксперименте (одна скважина). В примере, показанном четыре различных субстратов, используемых: синий CPH-β-глюкан (ячмень), желтый CPH-ксилана (букового), зеленый CPH-амилозы и красный CPH-пектиновые галактановый (люпин). Расположение пластины подложки показан на рисунке 4C и изображение планшета для анализа на рис 4D. Реакцию проводили в 100 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 4,5 в течение 30 мин при 25 ° С и 150 оборотах в минуту. Первые одиночные ферменты с увеличением концентрации фермента были протестированы с соответствующей СРН подложке (рис 4д) и окрашенного супернатанта был получен , как ожидалось в табличке (рис 4F, строка 1А – 12D). Ряд E содержал два различных CPH подложки желтый CPH-ксилана и синий CPH-β-глюкан, которые разлагаются при различных соотношениях соответствующих ферментов эндо -xylanase и эндо -glucanase. После завершения реакции, результат visibле в табличке: цвет продукта реакции был темно – зеленый-синий, когда более эндо -glucanase присутствовал (рис 4F, 4E-6е) и превратилась в зажигалку желто-зеленого цвета, при увеличении концентрации эндо -xylanase ( Рисунок 4F, 10-12E). То же самое наблюдается в строке F, где две подложки красный CPH-пектиновые галактановый и желтый CPH-ксилана деградировали с эндо -galactanase и эндо -xylanase. Все четыре разные цветные CPH подложки присутствовали (рис 4F, 1G-12F) и одиночные ферменты деградирует соответствующий CPH субстрат и путем добавления дополнительных ферментов сочетание окрашенных продуктов реакции было получено. Рисунок 4. Сочетание двух различных CPH субстратов, красный CPH-целлюлоза и желтый CPH-ксилана, обрабатывают различными ферментами.) Реакции супернатантов после обработки двух подложек с эндо -cellulase (КВЖД) или эндо -xylanase (Xyl) или обоих ферментов. B) спектры поглощения супернатантах реакции. Комбинация из четырех различных субстратов CPH обрабатывают различными ферментами C) Схема подложки пластины , содержащей КПВ субстраты:. Синий CPH-β-глюкан (ячмень), желтый CPH-ксилана (букового), зеленый CPH-амилозы и красный CPH- пектиновые галактановый (люпин) D) Изображение планшета для анализа , содержащего различные подложки CPH Е) Схема продукта пластины , показывающий соотношение количества добавленных ферментов (номинальной концентрации (НК):.. Glu = 1 ед / мл эндо -glucanase, Xyl = 1 ед / мл эндо -xylanase, Amy = 5 ед / мл эндо – амилазы и гал = 0,5 ед / мл эндо -galactanase). F) изображение продукта пластины после 30 – минутной инкубации при 25 ° C. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. подложка Источник CPH-2-гидроксиэтил- N / A (CPH-2-ОН-целлюлоза) CPH-амилопектина картошка CPH-амилозы картошка CPH-arabinan сахарная свекла CPH-арабиноксилан пшеница CPH-казеина бычьего молоко CPH-хитозан животного происхождения CPH-курдлан Alcaligenes фекальный CPH-декстрана Leuconostoc SPP. </eм> CPH-галактоманнановый рожковое дерево CPH-ЛАМИНАРИН ламинарии CPH-lichenan Исландский мох CPH-метилцеллюлозы N / A CPH-pachyman Poria Кокосовые CPH-пектиновые галактановый картошка CPH-пуллулановый Aureobasidium пуллуланы CPH-rhamnogalacturonan I (RG I) картошка CPH-rhamnogalacturonan I (-Gal) * картошка CPH-rhamnogalacturonan соевые бобы CPH-ксилана букового CPH-ксилоглюкан тамаринд CPH-β-глюкан из ячменя ячмень CPH-β-глюкан из овса овсяной </td> CPH-β-глюкан из дрожжей дрожжи ICB-Arabidopsis Розетка листьев из Резуховидка Таля Col-0 ( для взрослых растений) Семена ICB-Arabidopsis Резуховидка Таля ICB-жома Saccharum officinarum (высушенный взрослого растения, стебель и листья) ICB-кристаллическая целлюлоза (фильтровальная бумага) коммерческие бумаги Ватман 3MM Chr хроматографии Семена ICB-пажитника Trigonella SPP. Семена ICB-пеньки Конопля SPP. (Высушенный взрослого растения, стебель и листья) Семена ICB-люпин Люпин узколистный семена ICB-пыльцевой П. луговой Phleum луговой пыльца ICB-ель Picea SPP. (Милиствол дерева заполненной) ICB-табак листья из Nicotiana benthamiana (молодое растение) ICB-пшеничной соломы Triticum SPP. (Высушенный взрослое растение, стебель и листья) ICB-Ива Salix SPP. (Высушенный взрослое растение, ствол дерева измельченный) ICB-Сорго Сорго SPP. (Уходит от взрослого растения) * (β-1,4-D-галактановый боковые цепи , удаленные с эндо -β-1,4-D-galactanase) Таблица 1. Список доступных хромогенного Полимерный гидрогель (CPH) и нерастворимые Хромогенная Биомасса (ICB) субстратов.

Discussion

Мы используем новое поколение разноцветных CPH и МКТ субстратов , которые основаны на chlorotriazine красителей (полный список подложек в таблице 1) расположены в специально созданных коммерческого набора для анализа. Ферментативного расщепления субстратов дает мелкие, растворимые, окрашенные продукты , которые могут быть обнаружены в растворе для анализа и может быть определена количественно с помощью ридера 9 пластин. Этот анализ предназначен для оценки эндо -Актерское ферментов и чувствительность анализа аналогичен подход, использующий azurine поперечно сшитую (AZCL) подложках 10, в то время как другие способы доступны для экзо -Актерское ферментов 11,12. Ограничение этого набора для анализа заключается в выявлении эндо -enzyme активности, а CPH, а также ICB подложки не разлагаемые на экзо -enzymes , скорее всего , из – за стерических затруднений , возникающих из красителя и сшивающих молекул 8.

Анализ проводят в 96-достл формат и индивидуальные реакции происходят в скважинах. Реакция должна быть тщательно перемешана в плите, чтобы получить воспроизводимые данные. Полученные супернатанты фильтруют в табличке, где поглощение каждой лунки может быть определена количественно с помощью оптической плотности спектрометрией. Основные принципы и расположение анализа показаны на рисунке 1. Анализ состоит из аналитического планшета (96-луночный фильтровальный планшет а) с подложками, и после инкубации с ферментами, надосадочную жидкость фильтруют через в четком луночного планшета и оптические плотности считывают обеспечивая полуколичественный измерение ферментной специфичности и активности. Было показано, что этот скрининг тест с использованием CPH субстраты могут быть также использованы в агаровой формате пластины, где растворимые продукты реакции создать цветной ореол после инкубации в течение ночи. 8

Наборы анализа могут быть использованы для скрининга очищенные ферменты и их возможные побочные действия, как показано вРисунок 2. Побочные действия могут возникать из одного фермента и его беспорядочном специфичности , но и с тем , что образец анализировали представляет собой смесь различных ферментов и их синергический эффект должен быть изучен. Кроме того, как было показано в предыдущих исследованиях, что ферментные коктейли, кишечную флору 13 и культуральные бульоны из грибов 8, а также эндогенный фермент , растений и бактерий (неопубликованные данные) могут быть использованы в качестве источника фермента.

ICB субстраты решения сложных смесей компонентов клеточной стенки часто встречаются в промышленных процессах пробоя биомассы. Эти подложки предназначены для оценки наличия полисахарида и предоставить информацию о том, как эффективно оптимизировать коктейли деградации для более эффективного выхода деградации. Как показано на рисунке 3 CPH и ICB подложки могут быть использованы в ферментной скрининга бок о бок – показывая огромное количество информации о специфичности фермента А.Н.d активность в обоих контексте предпочтительного субстрата (CPH) и более природный комплекс, содержащий другие компоненты в дополнение к предпочтительным субстратом более близко имитируя макромолекулярная сборка обнаруживаемых в природе (ICB). Использование нескольких цветов позволяет одновременного обнаружения различных ферментативных активностей против нескольких субстратов, что увеличивает высокую пропускную способность и multiplexity анализа. Спектры различных красителей может быть решена путем простой линейной регрессии и в большинстве случаев активность мульти-субстрат можно наблюдать при визуальном осмотре в одиночку. Имитируемый примером такого эксперимента и его результаты изображено на рисунке 4.

Этот анализ инструментов и универсальность его применения очень хорошо подходит для скрининга первого уровня ферментов и культуры бульонов с неизвестными деятельности. Наиболее важными аспектами этого анализа являются его высокая пропускная природа, настраиваемость, простота использования и гибкость. Имея это в виду, ше полагают, что этот новый набор инструментов позволит значительно улучшить и ускорить процессы фермента скрининг на промышленных объектах, а также научных приложений.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить профессора J. Paul Нокс (Университет Лидса, Великобритания), который предоставил доступ к своей лаборатории для съемок, и Сьюзан Е. Маркус за отличную техническую помощь. JS не признает проект WallTraC (Европейской рамочной программы Комиссии Седьмой (соглашение о гранте №. 263916) и биомассой проекта для 21-го века (инновационный фонд Дании; дело № .: 103408) SKK благодарит проект SET4Future (Danish стратегических исследований Совета), Био-Значение стратегического основан датским советом стратегических исследований, датского совета по технологиям и инновациям (грант делу № .: 0603-00522B) и биологии-ориентированный подход для понимания ферментативного разложения комплекса полисахарид систем (грант делу № .:. 107279) для финансирования Эта статья отражает взгляды авторов только Европейский Союз не несет ответственности за любое использование, которое может быть изготовлен из информации, содержат в настоящем документе..

Materials

assay kit plates Glycospot customized assay kit plates
activation solution Glycospot for activating CPH substrates
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold Pall Corporation 5015 spacer block
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile Millipore MSHVN4510 assay plate
96-Well Microplates, Polypropylene Greiner Bio-One 651201 collection plate after washing the substrates
Nunc™ MicroWell™ 96-Well Microplates Thermo Scientific 269620 product plate
Diaphragm pump MZ 2 NT Vacuubrand 732000 vacuum pump used with the vacuum manifold
Infors HT Ecotron Infors HT 4950132 (Buch & Holm) horizontal shaker
SpectraMax M5 Molecular Devices 10067-750 (VWR) 96-well plate absorbance reader
Vacuum manifold Pall Corporation 5017 vacuum manifold
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) Megazyme E-CELTR cellulase [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus)  Megazyme E-BMACJ mannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) Megazyme E-LAMSE β-glucanase [glu]
endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger)  Megazyme E-EGALN galactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger)  Megazyme E-XYAN4 xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)  Megazyme E-XEGP xyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis)  Megazyme E-BLAAM amylase [amy]
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).
  2. Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).
  3. Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography. Biotechnol. Lett. 26 (15), 1207-1211 (2004).
  4. Black, G. E., Fox, A. Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 720 (1-2), 51-60 (1996).
  5. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).
  6. Somogyi, M. Notes on Sugar Determination. J. Biol. Chem. 195 (1), 19-23 (1952).
  7. Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms. Biotechniques. 33 (4), 798 (2002).
  8. Kračun, S. K., et al. A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes. Biotechnol Biofuels. 8, (2015).
  9. Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity. J. Biotechnol. 103 (3), 203-212 (2003).
  10. Nyyssonen, M., et al. Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries. Front Microbiol. 4, 282 (2013).
  11. Sweeney, M. D., Xu, F. Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments. Catalysts. 2 (2), 244-263 (2012).
  12. Biely, P., et al. Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose. J. Biotechnol. 151 (1), 137-142 (2011).
  13. Mackenzie, A. K., et al. A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility. Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).

Tags

High-throughput ScreeningCarbohydrate-degrading EnzymesNovel Insoluble Chromogenic Substrate Assay KitsEnzyme DiscoveryBiomass DegradationChromogenic SubstratesEndo-cellulaseICB-wheat StrawAbsorbancePlate Reader

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Schückel, J., Kračun, S. K., Willats, W. G. T. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. Vis. Exp. (115), e54286, doi:10.3791/54286 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image