הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות
Summary
A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.
Abstract
Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme’s biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.
Introduction
Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid5 and Nelson-Somogyi6 assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly7.
We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.
One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods7. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability 8 and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge 8.
The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).
CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנחנו משתמשים דור חדש של מצעי CPH ו ICB צבעוניות המבוססים על צבעי chlorotriazine (רשימה מלאה של מצעים בטבלה 1) מסודר ערכת assay מסחרית אישי מעוצב. עיכול אנזימים של מצעי מניב קטנים, מסיסים, מוצרי צבוע אשר ניתן לזיהוי בפתרון assay וניתן לכמת באמצעות צלחת קורא 9. Assay זה נועד לצורך ההערכה של אנזימי -acting אנדו ואת הרגישות של assay דומה לזו באמצעות azurine הצולב (AZCL) מצעים 10, בעוד שיטות אחרות זמינות עבור אנזימי -acting exo 11,12. המגבלה של ערכת assay זה טמון זיהוי של פעילות אנדו -enzyme, כמו CPH כמו גם מצעים ICB אינם מתכלה ידי exo -enzymes ככל הנראה בשל הפרעה סטרית הנובעים מולקולות צבע ו crosslinker 8.
Assay הוא ביצע ב 96-welפורמט l ותגובות פרט להתקיים הבארות. התגובה צריכה להיות מעורבת הצליח לקבל נתונים לשחזור. את supernatants וכתוצאה יסונן צלחת מוצר שבו הספיג של כל טוב ניתן לכמת באמצעות ספקטרומטריית ספיגה. העקרונות הבסיסיים ואת הפריסה של assay מוצגים באיור 1. את assay מורכב צלחת assay (צלחת מסנן 96-היטב) עם מצעים, ואחרי הדגירה עם אנזימים, supernatant מסוננת דרך לתוך צלחת גם ברור ואת absorbances נקרא מתן מדידה וכמותיות ספציפי ואת פעילות אנזים. הוכח, כי assay הקרנה זו באמצעות מצעי CPH ניתן גם להשתמש בתבנית צלחת אגרה, שבו תוצרי התגובה המסיסים ליצור הילה בצבע לאחר דגירת הלילה. 8
ערכות assay יכול לשמש מסך אנזימים מטוהרים-פעילויות הלוואי האפשריות שלהם כפי שמודגםאיור 2. Side-פעילויות יכולות לנבוע אנזים יחיד וספציפי המופקר שלה אלא גם מן העובדה כי המדגם נתח הוא תערובת של אנזימים שונים ותוצאת סינרגטית שלהם צריכה להיחקר. בנוסף, כפי שכבר הוכח במחקרים קודמים, קוקטיילי אנזים הזה, 13 חיידקים במעיים והתרבות broths מן הפטריות 8 וכן אנזים צמח אנדוגני וחיידקים (נתונים שלא פורסמו) יכול לשמש כמקור אנזים.
מצעי ICB לטפל תערובות מורכבות של רכיבי דופן התא נתקלו לעתים קרובות בתהליכים תעשייתיים של התמוטטות ביומסה. מצעים אלה נועדו להעריך זמינים פוליסכריד ולספק מידע על איך לייעל קוקטיילים שפלים ביעילות לפלט שפלה יעילה יותר. כמו באיור 3 מצעים CPH ו ICB ניתן להשתמש בצד הקרנת אנזים זה לצד זה – חושף שפע של מידע על סגוליות אנזיםפעילות ד הוא בהקשר של המצע המועדף (CPH) וכן קומפלקס טבעי יותר המכיל רכיבים אחרים בנוסף המצע המועדף יותר מקרוב מחק אסיפת macromolecular המצויים בטבע (ICB). השימוש בצבעים מרובים מאפשר זיהוי סימולטני של פעילות אנזים שונה נגד מצעים כמה דבר אשר מגביר את התפוקה הגבוהה multiplexity של assay. ניתן לפתור ספקטרה של צבעים שונים על ידי רגרסיה ליניארית פשוטה, וברוב המקרים פעילות רב מצע יכול להיות שנצפו על ידי בדיקה ויזואלית בלבד. דוגמא מדומה של ניסוי כזה ותוצאותיו מתוארות באיור 4.
ארגז כלי assay זה ואת צדדיות של היישום שלה מתאימים היטב להקרנה הראשונה ברמה של אנזימים סמיכים וצח תרבות עם פעילויות ידועות. ההיבטים החשובים ביותר של assay זה הם טבע תפוקה גבוהה, התאמה אישית, קל שימוש וגמישות. עם זה בחשבון, wדואר מאמין כי מערכת חדשנית זו של כלים תשפר מאוד ולהאיץ תהליכי מיון אנזים תעשייתי כמו גם יישומים אקדמיים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לפרופ 'J. Paul נוקס (אוניברסיטת לידס, בריטניה), שסיפק גישה למעבדות שלו עבור הצילומים, וסוזן א מרקוס לקבלת סיוע טכני מעולה. JS מודה הפרויקט WallTraC (תוכנית המסגרת השביעית של הנציבות האירופית (הסכם מענק לא:. 263,916) ואת ביומסה פרויקט המאה ה -21 (קרן Innovation דנמרק; מקרה לא .: 103,408) SKK מודה הפרויקט SET4Future (המועצה למחקר אסטרטגי דנית), האסטרטגי ביו-ערך הוקמה על ידי המועצה הדנית למחקרים אסטרטגיים, המועצה הדנית לטכנולוגיה וחדשנות (גרנט מקרה לא .: 0603-00522B), ו להתקרב מונחה ביולוגיה להבנת השפלה אנזימתי של מערכות פוליסכריד מורכבים (גרנט מקרה לא .:. 107,279) למימון מאמר זה משקף את הדעות של המחברים רק האיחוד האירופי אינו אחראי לכל שימוש שעלולה להתבצע המידע מכיל בזאת..
Materials
| assay kit plates | Glycospot | customized assay kit plates | |
| activation solution | Glycospot | for activating CPH substrates | |
| 350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold | Pall Corporation | 5015 | spacer block |
| 96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile | Millipore | MSHVN4510 | assay plate |
| 96-Well Microplates, Polypropylene | Greiner Bio-One | 651201 | collection plate after washing the substrates |
| Nunc™ MicroWell™ 96-Well Microplates | Thermo Scientific | 269620 | product plate |
| Diaphragm pump MZ 2 NT | Vacuubrand | 732000 | vacuum pump used with the vacuum manifold |
| Infors HT Ecotron | Infors HT | 4950132 (Buch & Holm) | horizontal shaker |
| SpectraMax M5 | Molecular Devices | 10067-750 (VWR) | 96-well plate absorbance reader |
| Vacuum manifold | Pall Corporation | 5017 | vacuum manifold |
| endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) | Megazyme | E-CELTR | cellulase [cel] |
| endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus) | Megazyme | E-BMACJ | mannanase [man] |
| endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) | Megazyme | E-LAMSE | β-glucanase [glu] |
| endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger) | Megazyme | E-EGALN | galactanase [gal] |
| endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger) | Megazyme | E-XYAN4 | xylanase [xyl] |
| endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.) | Megazyme | E-XEGP | xyloglucanase [xg] |
| α-amylase (Bacillus licheniformis) | Megazyme | E-BLAAM | amylase [amy] |
References
- Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).
- Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).
- Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography. Biotechnol. Lett. 26 (15), 1207-1211 (2004).
- Black, G. E., Fox, A. Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 720 (1-2), 51-60 (1996).
- Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).
- Somogyi, M. Notes on Sugar Determination. J. Biol. Chem. 195 (1), 19-23 (1952).
- Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms. Biotechniques. 33 (4), 798 (2002).
- Kračun, S. K., et al. A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes. Biotechnol Biofuels. 8, (2015).
- Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity. J. Biotechnol. 103 (3), 203-212 (2003).
- Nyyssonen, M., et al. Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries. Front Microbiol. 4, 282 (2013).
- Sweeney, M. D., Xu, F. Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments. Catalysts. 2 (2), 244-263 (2012).
- Biely, P., et al. Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose. J. Biotechnol. 151 (1), 137-142 (2011).
- Mackenzie, A. K., et al. A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility. Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).
