Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

Большинство современных исследований клеточной и молекулярной биологии основаны на средних показателях населения. Тем не менее, важные биологические события могут быть замаскированы этих традиционных анализов населения на основе, так как небольшие группы населения могут играть важную роль в биологических процессах и исход заболевания. Понимание экспрессии генов в гетерогенных популяций на уровне одной клетки может (и имеет) приводят к соответствующим биологическим и клиническим прозрений ^1,2. Беспокойство исследований эмбрионального развития, в большей популяции клеток, клетки – предшественники часто недостаточно представлены, что делает его сложным для обнаружения тонких изменений в экспрессии генов , которые в конечном счете , инициирующих клеток судьбы решений ^3. Точно так же, один тип клеток , могут иметь различные профили экспрессии в ответ на микроокружение ^4. Например, эндотелиальные клетки – резиденты в том же органе или в различных органах (например., Аорте или почек) проявляют значительную гетерогенность , несмотря на общий обмен morphological и функциональные особенности ^5. Кроме того, раковые клетки , обитающие той же опухоли также могут иметь различные молекулярные профили или мутации на уровне одной клетки ^6.

В модельных системах, транскриптомика в одиночных камерах успешно идентифицировали новые клеточные популяции, характеризуются промежуточными состояниями , которые происходят во время дифференцировки клеток, и выявили дифференциальные клеточные реакции на стимулы ^7,8,9. Такое понимание был бы замаскирован в обычных популяционных исследованиях. Эмбрионы рыбок данио являются чрезвычайно малоиспользуемых источником стволовых, прародителя и дифференцируя клеток для изучения вопросов одной гетерогенности клеточной и молекулярной регуляции клеточных идентичности в процессе развития. Их весьма стереотипны, исключая виво развитие и простота генетических манипуляций делают их отличной моделью системы для такого подхода ^10,11. В частности, основным ограничением для интерпретации одного клеточного гене выражение данных является то , что надежная идентификация новых промежуточных состояний клеток в процессе развития требует очень тщательного сроки сбора ткани ^9. Это необходимо для того, чтобы гарантировать, что гетерогенность между захваченными клетками представляет гетерогенность в пределах ткани в одной точке времени, а не гетерогенность экспрессии гена, представленного возрастного дифференциации клеток. По сравнению с мышами, развитие эмбриона данио рерио могут быть точно синхронизированы через большое количество эмбрионов ^12. Кроме того, при больших размерах сцепления, данио эмбрионы могут быть использованы в качестве обильного источника стволовых и клеток-предшественников.

Этот протокол описан способ выделения клеток из эмбрионов данио и захвата отдельных клеток с использованием коммерчески доступного чипа и autoprep интегрированной системы микрофлюидики схема (МФК) для анализа экспрессии генов QRT-PCR. Этот протокол может быть быстро передаваемом к любым мультиплексирование с высокой пропускной способностью анализов, включая целомтранскриптомный секвенирования , которая позволяет более всесторонний анализ клеточной неоднородности ^13. Он также предлагает ряд преимуществ для традиционных анализов экспрессии генов. Один протокол изоляции клеток дает высокую жизнеспособность после FACS, что уменьшает долю скомпрометированных клеток, которые включены в последующих применений. Используя IFC, захваченные клетки могут наблюдать непосредственно оценить скорости захвата и оценки состояния здоровья клеток морфологически. Кроме того, этот протокол широко применима к данио научное сообщество, требуя только меченый трансгенной линии рыбы и доступ к микрофлюидальных технологии улавливания клеток.

В качестве доказательства принципа, отдельные клетки, полученные из кардиальных предшественников были выделены и захваченный на чипе МФК, а затем относительное обилие кардиомаркеров дифференцировки измеряли с помощью QRT-PCR. Анализ экспрессии генов на уровне одной клетки показывает, что сердечные клетки-предшественники сосуществуют с их differentiating потомством. Понимание того, полученные от одноклеточного профилирования сердечных клеток-предшественников может пролить свет на неоднородности в экспрессии генов моделей среди сердечных клеток-предшественников в процессе развития позвоночных животных, которые могут быть замаскированы в традиционных анализов популяций.