Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

A maioria dos estudos atuais de biologia celular e molecular são baseados em médias populacionais. No entanto, os eventos biológicos importantes podem ser mascaradas por estas análises tradicionais de base populacional já que as populações menores podem desempenhar papéis importantes em processos biológicos e evolução da doença. Compreendendo a expressão do gene em populações heterogéneas ao nível da célula individual podem (e têm) levar a insights biológicos e clínicos relevantes ^1,2. Motivo de preocupação para estudos de desenvolvimento embrionário, em uma população maior de células, as células progenitoras são muitas vezes sub-representados, tornando-o difícil de detectar mudanças sutis na expressão gênica que em última análise, propor decisões destino celular ^3. De modo semelhante, um único tipo de célula pode ter diferentes perfis de expressão, em resposta ao microambiente ^4. Por exemplo, células endoteliais residentes no mesmo órgão ou em diferentes órgãos (por exemplo., Aorta ou renal) exibem uma heterogeneidade significativa apesar de compartilhar MORP comumhological e funcionais características ^5. Além disso, as células cancerosas que povoam o mesmo tumor também podem ter diferentes perfis moleculares ou mutações ao nível da célula individual ^6.

Em sistemas modelo, transcriptomics em células individuais identificou com sucesso novas populações de células, caracterizado estados intermediários que ocorrem durante a diferenciação celular, e revelou respostas celulares diferenciais aos estímulos ^7,8,9. Tais percepções teriam sido detectáveis ​​em estudos de base populacional convencionais. embriões de peixe-zebra são uma fonte tremendamente subutilizado do caule, progenitor, e as células de diferenciação para explorar questões de heterogeneidade célula única e regulação molecular de identidades celulares durante o desenvolvimento. Sua, ex vivo desenvolvimento e facilidade de manipulação genética altamente estereotipados torná-los um sistema modelo excelente para esta abordagem ^10,11. Especificamente, uma grande limitação para a interpretação de uma única célula gendados e expressão é que a identificação fiável de novos estados de células intermediárias durante o desenvolvimento exige um timing muito cuidado de coleta de tecido ^9. Isto é necessário para assegurar que a heterogeneidade entre as células capturadas representa heterogeneidade dentro de um tecido a um único ponto de tempo, em vez de heterogeneidade na expressão de genes apresentada pela diferenciação celular dependente da idade. Em comparação com ratos, o desenvolvimento do embrião de peixe-zebra podem ser precisamente sincronizados através de um grande número de embriões ^12. Além disso, com os tamanhos grandes de embraiagem, os embriões de peixe-zebra pode ser usado como uma fonte abundante de células estaminais e progenitoras.

Este protocolo descreve um método para isolar a partir de embriões de peixe-zebra células e capturar as células individuais utilizando um sistema de chip e Autoprep disponível comercialmente circuito microfluidos integrado (IFC) para análise da expressão do gene qRT-PCR. Este protocolo pode ser rapidamente transferível para quaisquer ensaios de alto rendimento de multiplexagem, incluindo todasequenciamento do transcriptoma que permite a análise mais abrangente da heterogeneidade celular ^13. Também oferece várias vantagens para ensaios de expressão de gene tradicionais. O protocolo de isolamento de células individuais produz alta viabilidade depois de FACS, o que diminui a proporção de células comprometidas que são incluídos em aplicações a jusante. Usando um IFC, as células capturadas pode ser observado diretamente para avaliar as taxas de captura e avaliar a saúde das células morfologicamente. Além disso, este protocolo é amplamente aplicável para a comunidade científica peixe-zebra, necessitando apenas de uma linha de peixes transgénicos marcado e acesso às tecnologias de captura de células microfluídicos.

Como prova de princípio, células únicas derivadas de progenitores cardíacas foram isoladas e capturado num chip IFC, e, em seguida, a abundância relativa de marcadores de diferenciação cardíaca foi medida por qRT-PCR. Análise da expressão de genes ao nível da célula individual demonstra que células progenitoras cardíacas coexistir com a sua diferenprogênie ntiating. O conhecimento adquirido a partir de perfis de uma única célula de células progenitoras cardíacas podem lançar luz sobre a heterogeneidade nos padrões de expressão gênica entre células progenitoras cardíacas durante o desenvolvimento dos vertebrados, que pode ter sido mascarado nas análises tradicionais de base populacional.