Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d'embryons de poisson zèbre

La plupart des études actuelles de biologie cellulaire et moléculaire sont basées sur des moyennes de la population. Cependant, les événements biologiques importants peuvent être masqués par ces analyses basées sur la population traditionnelle puisque les populations mineures peuvent jouer un rôle majeur dans les processus biologiques et les résultats de la maladie. Comprendre l' expression des gènes dans les populations hétérogènes au niveau de la cellule unique peut (et a) conduire à des idées biologiques et cliniques pertinentes ^1,2. Une préoccupation pour les études de développement embryonnaire, dans une plus grande population de cellules, les cellules progénitrices sont souvent sous – représentées, ce qui rend difficile de détecter les changements subtils dans l' expression des gènes qui déclenchent finalement les décisions du destin cellulaire ^3. De même, un seul type de cellule peuvent avoir des profils d'expression différents en réponse au microenvironnement ^4. Par exemple, les cellules endothéliales résidentes dans le même organe ou dans différents organes (par exemple., De l' aorte ou des reins) présentent une hétérogénéité significative malgré le partage MORP communhological caractéristiques fonctionnelles et ^5. En outre, les cellules cancéreuses qui peuplent la même tumeur peuvent également avoir des profils variés ou des mutations moléculaires au niveau cellulaire unique ^6.

Dans des systèmes modèles, transcriptomique dans des cellules individuelles a réussi à identifier de nouvelles populations de cellules, caractérisé par des états intermédiaires qui se produisent au cours de la différenciation cellulaire, et ont révélé des réponses cellulaires à des stimuli différentielles ^7,8,9. Ces idées auraient été masqués dans des études basées sur la population classiques. embryons de poisson zèbre sont une source extrêmement sous-utilisées de la tige, progéniteurs et la différenciation des cellules pour explorer des questions d'hétérogénéité cellulaire unique et la régulation moléculaire des identités cellulaires au cours du développement. Leur très stéréotypée, ex vivo le développement et la facilité de manipulation génétique font un excellent système modèle pour cette approche ^10,11. Plus précisément, une limitation majeure à l'interprétation de la cellule unique genles données e d'expression est que l' identification fiable des nouveaux états de cellules intermédiaires au cours du développement exige une synchronisation très prudent de la collecte des tissus ^9. Cela est nécessaire pour assurer que l'hétérogénéité entre les cellules capturées représente l'hétérogénéité au sein d'un tissu à un seul point du temps plutôt que de l'hétérogénéité dans l'expression des gènes présenté par la différenciation des cellules dépendant de l'âge. Par rapport à des souris, le développement de l' embryon de poisson zèbre peut être précisément synchronisée à travers un grand nombre d'embryons ^12. En outre, avec les grandes tailles d'embrayage, les embryons de poisson zèbre peuvent être utilisés comme une source abondante de cellules souches et progénitrices.

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules à partir d'embryons de poisson zèbre et de capturer des cellules individuelles en utilisant un circuit de microfluidique intégré (IFC) puce et autoprep système disponible dans le commerce pour qRT-PCR analyse de l'expression génique. Ce protocole peut être rapidement cessible à tous les essais à haut débit de multiplexage, y compris touteséquençage du transcriptome qui permet une analyse plus complète de l' hétérogénéité cellulaire ^13. Il offre également plusieurs avantages aux essais traditionnels d'expression génique. Le protocole d'isolement d'une cellule unique donne une viabilité élevée après FACS, ce qui diminue la proportion de cellules compromis qui sont inclus dans les applications en aval. En utilisant un CFI, les cellules capturées peuvent être directement observées pour évaluer les taux de capture et d'évaluer la santé des cellules morphologiquement. En outre, ce protocole est largement applicable à la communauté de recherche zebrafish, exigeant seulement une ligne de poissons transgéniques étiquetés et l'accès aux technologies de capture de cellules microfluidiques.

Comme preuve de principe, des cellules individuelles dérivées de progéniteurs cardiaques ont été isolés et capturés sur une puce IFC, puis l'abondance relative des marqueurs de différenciation cardiaque a été mesurée par qRT-PCR. l'analyse de l'expression génique au niveau de la cellule unique démontre que progéniteurs cardiaques coexistent avec leur différeprogéniture ntiating. L'idée tirée de profilage à cellule unique de progéniteurs cardiaques peut faire la lumière sur l'hétérogénéité des profils d'expression génique entre les cellules progénitrices cardiaques au cours du développement des vertébrés, qui peuvent avoir été masqués dans les analyses basées sur la population traditionnelle.