Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

La maggior parte degli studi in corso di biologia cellulare e molecolare si basano sulle medie della popolazione. Tuttavia, importanti eventi biologici possono essere mascherati da queste analisi tradizionali basati sulla popolazione dal momento che le popolazioni minori possono giocare un ruolo importante nei processi biologici e l'esito della malattia. Comprendere l'espressione genica in popolazioni eterogenee a livello di singola cellula può (e deve) portare a dati biologici e clinici rilevanti ^1,2. Di interesse per gli studi di sviluppo embrionale, in un numero maggiore di cellule, le cellule progenitrici sono spesso sottorappresentati, il che rende difficile per rilevare sottili cambiamenti nell'espressione genica che in ultima analisi iniziativa per le decisioni sul destino delle cellule ^3. Analogamente, un singolo tipo di cellula può avere diversi profili di espressione in risposta al microambiente ^4. Ad esempio, le cellule endoteliali residenti nello stesso organo o in diversi organi (ad es., Dell'aorta o renali) mostrano una significativa eterogeneità, nonostante la condivisione di MORP comunehological e funzionale dispone di ^5. Inoltre, le cellule tumorali che popolano lo stesso tumore può anche avere diversi profili molecolari o mutazioni a livello di singola cellula ^6.

In sistemi modello, trascrittomica in singole cellule ha identificato con successo nuove popolazioni di cellule, caratterizzato stati intermedi che si verificano durante la differenziazione cellulare, e ha rivelato le risposte cellulari differenziali agli stimoli ^7,8,9. Tali intuizioni sarebbero stati mascherati in studi basati sulla popolazione convenzionali. embrioni di zebrafish sono una fonte immensamente utilizzato sotto-dello stelo, progenitore, e differenziazione delle cellule per esplorare questioni di singola eterogeneità cellulare e regolazione molecolare delle identità cellulari durante lo sviluppo. Il loro altamente stereotipato, ex vivo lo sviluppo e la facilità di manipolazione genetica loro un sistema modello eccellente per questo approccio ^10,11 fanno. In particolare, una limitazione importante per l'interpretazione della singola cellula gendati e espressione è che l'identificazione affidabile di nuovi stati di cella intermedi durante lo sviluppo richiede molto attenti tempi di raccolta dei tessuti ^9. Ciò è necessario per garantire che eterogeneità tra cellule catturate rappresenta eterogeneità all'interno di un tessuto in un singolo punto tempo piuttosto che eterogeneità nell'espressione genica presentata dalla differenziazione cellulare dipendente dall'età. Rispetto ai topi, sviluppo embrionale zebrafish può essere sincronizzato con precisione su un ampio numero di embrioni ^12. Inoltre, con le grandi dimensioni della covata, embrioni di zebrafish può essere utilizzato come una fonte abbondante di cellule staminali e progenitrici.

Questo protocollo descrive un metodo per isolare le cellule da embrioni zebrafish e catturare singole cellule utilizzando un chip e autoprep sistema disponibile commercialmente circuito microfluidica integrato (CFI) per qRT-PCR analisi di espressione genica. Questo protocollo può essere rapidamente trasferibili a qualsiasi test di throughput elevato di multiplazione tra cui interotrascrittoma sequenziamento che permette l'analisi più completa della eterogeneità cellulare ^13. Inoltre, offre diversi vantaggi per analisi di espressione genica tradizionali. Il singolo protocollo di isolamento delle cellule produce alta la vitalità dopo FACS, che diminuisce la proporzione di cellule compromesse che sono inclusi in applicazioni a valle. Utilizzando un IFC, le cellule catturate possono essere osservati direttamente per valutare i tassi di cattura e di valutare la salute delle cellule morfologicamente. Inoltre, questo protocollo è ampiamente applicabile per la comunità di ricerca zebrafish, che richiede solo una linea di pesce transgenico etichettati e l'accesso alle tecnologie di cattura microfluidica cellulare.

Come prova di principio, singole cellule derivate da progenitori cardiaci sono stati isolati e catturato su un chip IFC, e quindi la relativa abbondanza di marcatori di differenziazione cardiaci stata misurata qRT-PCR. analisi di espressione genica a livello di singola cellula dimostra che i progenitori cardiaci convivono con la loro differeprogenie ntiating. La conoscenza acquisita da profilatura cella singola di progenitori cardiaci può far luce su l'eterogeneità nei modelli di espressione genica tra cellule progenitrici cardiache durante lo sviluppo dei vertebrati, che potrebbe essere stato mascherato nelle analisi tradizionali basati sulla popolazione.