ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

細胞及び分子生物学の最新の研究は、母集団平均に基づいています。マイナー集団は生物学的プロセスおよび疾患の結果で主要な役割を再生することができますので、重要な生物学的事象は、これらの伝統的な集団ベースの分析によってマスクすることができます。関連する生物学的および臨床的洞察^1,2につながる（たと）単一細胞レベルでの不均一な集団における遺伝子発現をすることができます理解します。胚発生の研究に懸念されるのは、細胞の大きな集団において、前駆細胞は、それが困難な、最終的に細胞の運命の決定^3を開始^し 、遺伝子発現の微妙な変化を検出すること、しばしば過小評価されています。同様に、単一の細胞型は、微小環境⁴に対応して異なる発現プロファイルを有することができます。たとえば、同じ器官または異なる器官内に常駐内皮細胞（ 例えば 、大動脈または腎臓）は、共通のmorpを共有するにもかかわらず、有意な異質性を示しますhologicalおよび機能的特徴^5。また、同じ腫瘍を移植癌細胞は、単一細胞レベルでの⁶分子プロフィールまたは突然変異を変化させることができます。

モデル系では、単一細胞におけるトランスクリプトが正常に、新しい細胞集団を同定し、細胞分化の間に生じる中間状態を特徴づけ、そして^7,8,9を刺激するために、差動細胞応答を明らかにしました。このような洞察は、従来の集団ベースの研究でマスクされていたであろう。ゼブラフィッシュの胚は、単一の細胞の不均一や開発中の細胞のアイデンティティの分子調節の質問を探索するための幹細胞、前駆細胞、および分化する細胞の途方もなく過小利用源です。彼らの非常にステレオタイプ、ex vivoでの開発や遺伝子操作の容易さは、それらのこのアプローチ^10,11のための優れたモデル系にします。具体的には、単一のセル世代の解釈に大きな制限Eの発現データは、開発中の新規な中間体セル状態の信頼性の識別は、組織収集⁹の非常に慎重にタイミングを必要とすることです。これは、捕捉された細胞との間の不均一性は、年齢依存性細胞分化によって提示される遺伝子発現における単一の時点で組織内の不均一ではなく、不均一性を表していることを保証する必要があります。マウスと比較して、ゼブラフィッシュ胚発生を正確に胚¹²の多数にわたって同期させることができます。さらに、大規模なクラッチサイズで、ゼブラフィッシュの胚は、幹細胞および前駆細胞の豊富な供給源として使用することができます。

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚からの細胞を単離し、市販の集積マイクロ流体回路のqRT-PCR遺伝子発現解析のために（IFC）チップとオートプレップシステムを用いて単一細胞を捕捉する方法を記載します。このプロトコルは、全体を含む任意の高スループット多重アッセイに急速に譲渡することができます細胞異質¹³のより包括的な分析を可能にするトランスクリプトーム配列決定。また、伝統的な遺伝子発現アッセイにいくつかの利点を提供しています。単一細胞単離プロトコールは、下流アプリケーションに含まれている妥協細胞の割合を減少さFACS、後に高い生存率をもたらします。 IFCを使用することにより、捕捉された細胞を直接捕捉率を評価し、形態学的細胞の健康を評価するために観察することができます。また、このプロトコルは、マイクロ流体細胞捕捉技術にのみラベルされたトランスジェニック魚のラインとのアクセスを必要とする、ゼブラフィッシュ研究コミュニティに広く適用可能です。

原理の証明として、心臓前駆細胞に由来する単一の細胞を単離し、IFCチップ上に捕捉し、次いで心臓分化マーカーの相対的存在量は、定量RT-PCRにより測定しました。単一細胞レベルでの遺伝子発現解析は、心臓前駆体が自分のdiffereと共存することを実証しますntiating子孫。心臓前駆体の単一細胞プロファイリングから得られた知見は、伝統的な集団ベースの解析でマスクされている可能性があり、脊椎動物の発生時に心臓前駆細胞間の遺伝子発現パターンの不均一性、に光を当てることがあります。