عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة
Summary
This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.
Introduction
وتستند معظم الدراسات الحالية من الخلية والبيولوجيا الجزيئية على المعدلات السكانية. ومع ذلك، قد يكون حجب الأحداث البيولوجية الهامة من قبل هذه التحليلات التقليدية القائمة على السكان منذ السكان البسيط يمكن أن تلعب دورا رئيسيا في العمليات البيولوجية ونتيجة المرض. فهم التعبير الجيني في السكان غير متجانسة على مستوى خلية واحدة يمكن (وديه) يؤدي إلى رؤى البيولوجية والسريرية ذات الصلة 1،2. من تهم دراسات التطور الجنيني، في عدد أكبر من السكان من الخلايا، الخلايا الاولية غالبا ما تكون ممثلة تمثيلا ناقصا، مما يجعلها صعبة للكشف عن التغييرات الطفيفة في التعبير الجيني التي تبدأ في نهاية المطاف القرارات مصير الخلية 3. وبالمثل، قد يكون نوع خلية واحدة ملامح التعبير المختلفة ردا على المكروية 4. على سبيل المثال، الخلايا البطانية المقيمين في نفس الجهاز أو في أجهزة مختلفة (على سبيل المثال، الشريان الأورطي أو الكلى) يحمل تجانس كبير على الرغم من اشتراكهم morp المشتركميزات hological وظيفية 5. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الخلايا السرطانية ملء الورم نفسه أيضا متفاوتة التشكيلات الجزيئية أو الطفرات على مستوى خلية واحدة 6.
في النظم نموذج، transcriptomics في الخلايا واحد وقد حددت بنجاح السكان الخلية الجديدة، تتميز الدول الوسيطة التي تحدث أثناء تمايز الخلايا، وكشفت الاستجابات الخلوية التفاضلية للمنبهات 7،8،9. قد تم ملثمين مثل هذه الأفكار في الدراسات السكانية التقليدية. الأجنة الزرد هي مصدر كبير غير المستغلة الجذعية، السلف، والتفريق خلايا لاستكشاف الأسئلة من عدم التجانس وحيد الخلية والتنظيم الجزيئي الهويات الخلوية خلال التنمية. على نمطية للغاية، خارج الحي التنمية وسهولة التلاعب الجيني جعلها نظام نموذجا ممتازا لهذا النهج 10،11. على وجه التحديد، يشكل قيدا رئيسيا على تفسير خلية واحدة جنرالبيانات البريد التعبير هو أن تحديد موثوق للدول خلية متوسطة جديدة خلال التنمية يتطلب توقيت دقيق للغاية لجمع الأنسجة 9. وهذا أمر ضروري لضمان عدم التجانس بين الخلايا والقبض يمثل عدم التجانس داخل الأنسجة عند نقطة زمنية واحدة بدلا من عدم التجانس في التعبير الجيني التي قدمها تعتمد على سن تمايز الخلايا. بالمقارنة مع الفئران، تطور الجنين الزرد قد تكون متزامنة بدقة عبر عدد كبير من الأجنة 12. بالإضافة إلى ذلك، مع أحجام مخلب كبير والأجنة الزرد يمكن استخدامها كمصدر وفرة من الخلايا الجذعية والسلف.
يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل الخلايا من الأجنة الزرد والتقاط الخلايا واحدة باستخدام الدوائر المتكاملة على microfluidics (IFC) رقاقة وautoprep النظام المتوفرة تجاريا لQRT-PCR تحليل التعبير الجيني. هذا البروتوكول يمكن أن يكون للتحويل السريع إلى أي فحوصات عالية الإنتاجية المتنوعة بما في ذلك كلهالتسلسل Transcriptome على أن يسمح تحليل أكثر شمولا من عدم التجانس الخلوية 13. كما أنها توفر العديد من المزايا لفحوصات الجينات التقليدية. بروتوكول العزلة خلية واحدة تعطي قابلية عالية بعد FACS، مما يقلل من نسبة الخلايا الشبهة التي تم تضمينها في التطبيقات المصب. باستخدام مؤسسة التمويل الدولية، الخلايا والقبض ويمكن ملاحظة مباشرة لتقييم معدلات القبض وتقييم صحة الخلية شكليا. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا البروتوكول هو الواجب التطبيق على نطاق واسع في الأوساط البحثية الزرد، لا تتطلب سوى خط الأسماك المعدلة وراثيا وصفت والحصول على التكنولوجيات القبض على خلية ميكروفلويديك.
وكدليل على المبدأ، تم عزل الخلايا واحد مستمد من الأسلاف القلب واستولت على رقاقة مؤسسة التمويل الدولية، ومن ثم تم قياس الوفرة النسبية للعلامات التمايز في القلب من قبل QRT-PCR. تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية واحد يدل على أن الأسلاف القلب تتعايش مع اح بهمذرية ntiating. البصيرة المكتسبة من التنميط وحيدة الخلية من الأسلاف القلب قد تسلط الضوء على الاختلاف في أنماط التعبير الجيني بين الخلايا الاصلية القلب خلال تطوير الفقاريات، التي ربما تكون قد ملثمين في التحليلات التقليدية القائمة على السكان.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الموصوفة هنا يستخدم تعبير عن بروتين فلوري تحت سيطرة أحد المروجين محددة الخلية من نوع لإثراء مجموعة من الخلايا الاصلية في القلب من الأجنة الزرد لاستخدامها في نظام بمساعدة القبض على خلية واحدة ميكروفلويديك لتقييم تعبير عن مجموعة فرعية من الجينات القلب في واح?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).
Materials
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 mL | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye – Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
References
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
- Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
- Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
- Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
- Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
- Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
- Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
- McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
- Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
- Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
- Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
- McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
- Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
- Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
- de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
- Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
- Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).
