בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה
Summary
This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.
Introduction
רוב המחקרים הנוכחיים של ביולוגיה מולקולרית של תא מבוססים על ממוצעי אוכלוסייה. עם זאת, אירועים ביולוגיים חשובים עשויים להיות רעולי פנים על ידי ניתוחים מבוסס אוכלוסיה המסורתיים הללו, מאחר ואנשים קטין יכול לשחק תפקידים מרכזיים בתהליכים ביולוגיים ותוצאות המחלה. הבנת ביטוי גני אוכלוסיות הטרוגניות ברמת התא הבודדה יכולה (ויש לו) להוביל לתובנות ביולוגיים וקליניים רלוונטיים 1,2. דאגה ללימודי התפתחות עובריות, בתוך אוכלוסייה גדולה יותר של תאים, ובתאים הם בדרך כלל מיוצגים כראוי, מה שהופכים אותו מאתגר כדי לזהות שינויים עדינים ביטוי גנים שבסופו של דבר ליזום החלטות גורל תא 3. באופן דומה, סוג תא בודד יכול להיות ביטוי פרופילים שונים בתגובה במיקרו-סביבה של 4. לדוגמה, תאי אנדותל תושב אותו איבר או באיברים שונים (למשל., אבי העורקים או כליות) להפגין ההטרוגניות רבה, למרות שיתוף morp משותףתכונות hological ופונקציונליות 5. בנוסף, תאים סרטניים לאכלוס אותה הגידול יכולים להיות גם משתנים פרופילים או מוטציות מולקולריים ברמת התא הבודדה 6.
במערכות מודל, transcriptomics יחידים תאים זיהה בהצלחת אוכלוסיות תאים חדשות, המאופיינת מצבי ביניים המתרחשים במהלך התמיינות תאים, וגילה תגובות הסלולר הפרש לגירויי 7,8,9. תובנות אלה היו רעולי פנים במחקרים מבוסס אוכלוסיה קונבנציונאלי. עוברי דג זברה הם מקור מתחת מנוצל מאוד של גזע, אב, ובידול תאים לחקר שאלות ההטרוגניות תא בודד ורגולציה מולקולרית של זהויות הסלולר במהלך פיתוח. פיתוח וקלות מניפולציה גנטית סטריאוטיפית שלהם מאוד, לשעבר vivo לגרום להם מערכת מודל מצוינת עבור גישה זו 10,11. באופן ספציפי, מגבלה משמעותית לפרשנות של תא בודד genנתוני דואר ביטוי הוא כי זיהוי אמין של מדינות תא ביניים רומן במהלך פיתוח דורש תזמון מאוד זהיר של אוסף רקמות 9. הדבר נחוץ כדי להבטיח כי ההטרוגניות בין תאים שנתפסו מייצג ההטרוגניות בתוך רקמה בנקודת זמן אחת ולא הטרוגניות בביטוי גנים שהציג התמיינות תאים תלוי גיל. בהשוואה לעכברים, פיתוח עובר דג זברה יכול להיות מסונכרן בדיוק על פני מספר גדול של עובר 12. בנוסף, עם גדלי מצמד גדולים, עוברי דג זברה יכולים לשמש מקור שופע של תאי גזע מולידם.
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד תאים מעוברים דג הזברה ללכוד תאים בודדים באמצעות מעגל מיקרופלואידיקה משולבת זמינים מסחרית (IFC) מערכת שבבים autoprep עבור ניתוח ביטוי גנים qRT-PCR. פרוטוקול זה יכול להיות להעברה מיד על כל מבחני ריבוב תפוקה גבוהה כולל כלרצף transcriptome המאפשר ניתוח מקיף יותר של ההטרוגניות הסלולר 13. הוא מציע גם מספר יתרונות מבחני ביטוי גנים מסורתיים. פרוטוקול בידוד תא הבודד מניב כדאיות גבוהה לאחר FACS, אשר מקטינה את חלקם של תאים נפגעים כלולי יישומים במורד זרם. באמצעות IFC, תאים שצולמו עשויים להיות שנצפו ישירות להעריך שיעורים ללכוד ולהעריך תא בריאות מורפולוגית. בנוסף, פרוטוקול זה הוא החלים רחב לקהילת מחקר דג הזברה, המחייב רק קו דג מהונדס שכותרתו וגישה לטכנולוגיות ללכוד תאי microfluidic.
כהוכחה עקרונית, תאים בודדים נגזרו אבות לב הבודדים שנתפסו על שבב IFC, ולאחר מכן את השפע היחסי של סמני בידול לב נמדד על ידי qRT-PCR. ניתוח התבטאות גנים ברמת התא הבודדה מוכיח כי אבות לב לדור בכפיפה אחת עם differe שלהםצאצאי ntiating. התובנה שנצבר פרופיל תא בודד של אבות לב עשוי לשפוך אור על ההטרוגניות דפוסי ביטוי גנים בין ובתאים לב במהלך ההתפתחות חוליות, אשר עשויים להיות רעולי פנים בניתוחים מבוסס אוכלוסיה מסורתית.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת במסמך זה השתמש ביטוי של חלבון פלואורסצנטי תחת השליטה של מקדם ספציפי תאים מהסוג להעשיר אוכלוסייה של ובתאים לב מעוברי דג זברה לשימוש במערכת ללכוד microfluidic בסיוע תא בודד להעריך ביטוי של תת-קבוצה של גני לב יחיד תאים. ובלבד יכולות עירור ופליטה לייזר FACS עול?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).
Materials
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 mL | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye – Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
References
- Speicher, M. R. Single-cell analysis: toward the clinic. Genome medicine. 5, (2013).
- Macaulay, I. C., Voet, T. Single cell genomics: advances and future perspectives. PLoS genetics. 10, e1004126 (2014).
- Marco, E., et al. Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals epigenetic landscape. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5643-5650 (2014).
- Yin, H., Marshall, D. Microfluidics for single cell analysis. Current opinion in biotechnology. 23, 110-119 (2012).
- Garlanda, C., Dejana, E. Heterogeneity of endothelial cells. Specific markers. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 17, 1193-1202 (1997).
- Diaz-Cano, S. J. Tumor heterogeneity: mechanisms and bases for a reliable application of molecular marker design. International journal of molecular sciences. 13, 1951-2011 (2012).
- Guo, G., et al. Mapping cellular hierarchy by single-cell analysis of the cell surface repertoire. Cell stem cell. 13, 492-505 (2013).
- Guo, G., et al. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Developmental cell. 18, 675-685 (2010).
- Treutlein, B., et al. Reconstructing lineage hierarchies of the distal lung epithelium using single-cell RNA-seq. Nature. 509, 371-375 (2014).
- Kimmel, C. B. Genetics and early development of zebrafish. Trends in genetics : TIG. 5, 283-288 (1989).
- Liu, J., Stainier, D. Y. Zebrafish in the study of early cardiac development. Circulation research. 110, 870-874 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 203, 253-310 (1995).
- Zhao, S., Fung-Leung, W. P., Bittner, A., Ngo, K., Liu, X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PloS one. 9, e78644 (2014).
- McCall, M. N., McMurray, H. R., Land, H., Almudevar, A. On non-detects in qPCR data. Bioinformatics. 30, 2310-2316 (2014).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature. 3, 1101-1108 (2008).
- Lyons, I., et al. Myogenic and morphogenetic defects in the heart tubes of murine embryos lacking the homeo box gene Nkx2-5. Genes & development. 9, 1654-1666 (1995).
- Chen, J. N., Fishman, M. C. Zebrafish tinman homolog demarcates the heart field and initiates myocardial differentiation. Development. 122, 3809-3816 (1996).
- Zhou, Y., et al. Latent TGF-beta binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 474, 645-648 (2011).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Heart field origin of great vessel precursors relies on nkx2.5-mediated vasculogenesis. Nature cell biology. 15, 1362-1369 (2013).
- McCurley, A. T., Callard, G. V. Characterization of housekeeping genes in zebrafish: male-female differences and effects of tissue type, developmental stage and chemical treatment. BMC molecular biology. 9, 102 (2008).
- Tang, R., Dodd, A., Lai, D., McNabb, W. C., Love, D. R. Validation of zebrafish (Danio rerio) reference genes for quantitative real-time RT-PCR normalization. Acta biochimica et biophysica Sinica. 39, 384-390 (2007).
- Serbedzija, G. N., Chen, J. N., Fishman, M. C. Regulation in the heart field of zebrafish. Development. 125, 1095-1101 (1998).
- de Pater, E., et al. Distinct phases of cardiomyocyte differentiation regulate growth of the zebrafish heart. Development. 136, 1633-1641 (2009).
- Hami, D., Grimes, A. C., Tsai, H. J., Kirby, M. L. Zebrafish cardiac development requires a conserved secondary heart field. Development. 138, 2389-2398 (2011).
- Yelon, D., Horne, S. A., Stainier, D. Y. Restricted expression of cardiac myosin genes reveals regulated aspects of heart tube assembly in zebrafish. Developmental biology. 214, 23-37 (1999).
- Molina, N., et al. Stimulus-induced modulation of transcriptional bursting in a single mammalian gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 20563-20568 (2013).
