Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo's

De meeste huidige studies van de cel- en moleculaire biologie gebaseerd op gemiddelden populatie. Echter, belangrijke biologische gebeurtenissen worden gemaskeerd door deze traditionele bevolking op basis van analyses aangezien kleine populatie grote rol in biologische processen en de ziekte uitkomst kunnen spelen. Inzicht in genexpressie in heterogene populatie in de enkele cel niveau kan (en moet) leiden tot relevante biologische en klinische inzichten ^1,2. Van belang voor studies embryonale ontwikkeling, in een grotere populatie van cellen, progenitorcellen vaak ondervertegenwoordigd, waardoor het een uitdaging om subtiele veranderingen in genexpressie die uiteindelijk lot van de cel beslissingen ³ initiëren detecteren. Evenzo kan een enkel celtype verschillende expressieprofielen hebben in reactie op de micro ^4. Bijvoorbeeld, woonachtig endotheelcellen in hetzelfde orgaan of in verschillende organen (bijv., Aorta of nier) vertonen aanzienlijke heterogeniteit, ondanks het delen van gemeenschappelijke morphological en functionele kenmerken ^5. Bovendien kunnen kankercellen bevolken dezelfde tumor ook variërende moleculaire profielen of mutaties op de enkele cel niveau ^6.

In modelsystemen heeft transcriptomics in enkele cellen met succes geïdentificeerd nieuwe cel populaties, gekenmerkt tussenliggende staten die optreden tijdens de celdifferentiatie, en onthulde differentiële cellulaire reacties op stimuli ^7,8,9. Dergelijke inzichten zou zijn gemaskeerd in conventionele bevolking op basis van studies. Zebravis embryo's zijn een enorm weinig gebruikte bron van stamcellen, voorlopercellen, en differentiërende cellen voor het verkennen van vragen van enkele cel heterogeniteit en moleculaire regulatie van cellulaire identiteiten tijdens de ontwikkeling. Hun zeer stereotiep, ex vivo ontwikkeling en het gemak van genetische manipulatie maken ze een uitstekend modelsysteem voor deze aanpak ^10,11. In het bijzonder, een belangrijke beperking van de interpretatie van enkele cel gene uitdrukking gegevens is dat een betrouwbare identificatie van nieuwe intermediaire cel toestanden tijdens de ontwikkeling vereist zeer zorgvuldige timing van weefsel collectie ^9. Dit is nodig om ervoor te zorgen dat de heterogeniteit tussen gevangen cellen vertegenwoordigt heterogeniteit binnen een weefsel op een enkel tijdstip in plaats van heterogeniteit in genexpressie door leeftijdsafhankelijke celdifferentiatie. In vergelijking met muizen kunnen zebravisembryo ontwikkeling nauwkeurig gesynchroniseerd over een groot aantal embryo's ^12. Bovendien, met grote clutch formaten zebravisembryo's kunnen worden gebruikt als een rijke bron van stamcellen en progenitorcellen.

Dit protocol beschrijft een werkwijze om cellen van zebravis embryo's te isoleren en te vangen enkele cellen met behulp van een commercieel verkrijgbare geïntegreerde schakeling microfluidics (IFC) chip en autoprep voor qRT-PCR analyse van genexpressie. Dit protocol kan snel overdraagbaar aan een high throughput multiplexing assays waaronder geheeltranscriptoom sequencing dat meer uitgebreide analyse van de cellulaire heterogeniteit ¹³ toelaat. Het biedt ook een aantal voordelen aan traditionele genexpressie testen. Ééncellig isolatieprotocol levert hoge levensvatbaarheid na FACS, waar het aantal besmette cellen die zijn opgenomen in stroomafwaartse toepassingen afneemt. Door het gebruik van een IFC, kan gevangen cellen direct worden genomen om vast te leggen tarieven te evalueren en morfologisch beoordelen gezondheid van de cellen. Bovendien, dit protocol is breed toepasbaar op de zebravis onderzoek gemeenschap, is er slechts een label transgene vis lijn en toegang tot microfluïdische cel afvangtechnologieën.

Als bewijs van het principe werden afzonderlijke cellen afkomstig van cardiale progenitors geïsoleerd en vastgelegd op een IFC chip, en vervolgens de relatieve hoeveelheid van cardiale differentiatie merkers werd gemeten met qRT-PCR. Genexpressie analyse op de single cell niveau toont aan dat cardiale voorlopercellen samengaan met hun differentiating nageslacht. Het inzicht verkregen uit eencellige profilering van cardiale voorlopercellen kan licht werpen op de heterogeniteit in genexpressie patronen onder cardiale stamcellen tijdens de ontwikkeling van gewervelde dieren, die kunnen zijn gemaskeerd in de traditionele bevolking op basis van analyses.