Aislamiento de leucocitos infiltrantes de ratón Piel Usando enzimática Digest y Separación de degradado

No se encontraron enfermedades de la piel que van desde dermatitis de contacto, eczema, psoriasis, celulitis, infecciones por hongos y abscesos a los cánceres de piel no melanoma de estar entre las 50 enfermedades más prevalentes en todo el mundo, y la cuarta causa mundial de enfermedades no mortales en 2010 ^1. Por consiguiente, la investigación de los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a diversas patologías de la piel es un área necesaria y activa de investigación. Modelos de roedores han sido notablemente útil en la comprensión de las condiciones inflamatorias de la piel tales como dermatitis atópica ^{2, 3} psoriasis, o infección Staphylococcus aureus ^4. Protocolos de bajo costo, eficientes y simples para la digestión enzimática de tejido de la piel del ratón pueden proporcionar preparaciones de células que se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones posteriores para entender mejor la fisiopatología de enfermedades de la piel. Aquí, un método sencillo y económico se describe, por digestión enzimática de la piel del ratónel tejido de la piel y el aislamiento de leucocitos infiltrantes que puede ser utilizado para el cultivo celular, la transferencia adoptiva in vivo, análisis citométrico de flujo y clasificación o estudios de expresión génica. El objetivo general de este procedimiento consiste en preparar una suspensión de células de leucocitos infiltrantes de piel con la viabilidad celular alta y reducir al mínimo los costos normalmente asociados con kits de reactivos de encargo y disociadores mecánicos.

Métodos de disociación del tejido de la piel existentes ^5-7 pueden resultar en una baja viabilidad celular y la superficie de la integridad marcador, o requerir kits enzimáticos personalizados y costosas máquinas de disociación de tejidos ^8-11. Mientras que la digestión de los tejidos de la piel de oreja de ratón es razonablemente frecuente ^{12-13 de} la digestión de tejidos de la piel altamente queratinizado (por ejemplo, desde el flanco) puede resultar en preparaciones de células contaminadas con grandes cantidades de escombros no celular. En un estudio reciente, Zaid y colegas digeridos ratón piel flanco durante 90 minutos en 2,5 mg / ml de dispasa, Folloconducido por 45 min en 3 mg / ml de colagenasa ^7. En otro estudio, estos investigadores utilizaron múltiples incubaciones con una digestión combinada de 2,5 hr, incluyendo el uso de tripsina / EDTA, colagenasa III, y dispasa ^5. No se recomienda el uso de tripsina durante la digestión enzimática de la piel, como se ha demostrado que el tratamiento con tripsina de diferentes fabricantes para afectar apreciablemente la integridad de las proteínas de la superficie celular en células de mamífero ^14-15. Además, dispasa puede tener efectos significativos sobre las capacidades proliferativas de células CD4 y CD8a T y afectar a la abundancia de superficie de al menos 20 moléculas, incluyendo T común marcadores de activación celular, tales como CD62L ^16. Otros protocolos utilizan RPMI 1640 en el medio de la digestión ^6. Sin embargo, la presencia de ^Mg2 + y ^Ca2 + en medio RPMI puede causar la agregación extensa celular ^17.

Un protocolo ideal para la disociación del tejido debe aspirar a la viabilidad celular alta, bajaniveles de agregación celular, y un daño mínimo a proteínas de la superficie celular. Preparaciones de células del estroma de los ganglios linfáticos de alta calidad se han cumplido con los protocolos que utilizan incubaciones enzimáticas más cortos, Ca ²⁺ y Mg ²⁺ medios de comunicación libres, y evitar la tripsina y Dispasa ^18. Sin embargo, los protocolos de este tipo no se han establecido para la disociación de la piel entera de ratón.

Aquí, un protocolo se describe a disociar, aislar y enriquecer los leucocitos infiltrantes de la piel de la piel del flanco del ratón alergeno-desafió. Brevemente, piel extirpada se pre-incubó en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con suero bovino fetal al 10% durante 1 hora para suavizar el tejido para la digestión y eliminar cualquier exceso de piel o tejido graso muerto. Esto es seguido por una etapa de digestión enzimática 30 min con 0,7 mg / ml de colagenasa D. colagenasa D tiene efectos mínimos sobre la densidad de marcadores de superficie celular, y ningún efecto sobre la proliferación de células T in vitro ^16,18, por lo que esmuy adecuado para aplicaciones que implican la caracterización de proteínas de la superficie. Después de la digestión enzimática, se utilizó centrifugación en gradiente de densidad discontinuo para eliminar las células epiteliales y los restos de la suspensión de una sola célula y enriquecer para las células hematopoyéticas. Es importante destacar que este procedimiento evita costosos reactivos separación celular magnética basada en la columna de disociación y máquinas de tejido ^8-11, y se puede realizar con el equipo y los materiales encontrados en un laboratorio de investigación básica biomédica. Aquí se utiliza este protocolo para aislar los leucocitos de la piel flanco desafiado tres veces con la oxazolona hapteno (buey) en ratones ND4 suizos previamente sensibilizados (adaptado de 19). Las células se analizaron mediante citometría de flujo multiparamétrica. Esta técnica produjo una suspensión de células con los desechos mínimo y> 95% de viabilidad de los linfocitos aislados que fueron analizados por el flujo multi-paramétrico citometría para medir la infiltración de linfocitos y neutrófilos T en el sk afectadaen.