Isolamento di leucociti infiltranti da mouse pelle utilizzando enzimatica Digest e Separazione Gradient

Le condizioni della pelle che vanno da dermatite da contatto, eczema, psoriasi, cellulite, infezioni fungine e ascessi a tumori cutanei non-melanoma sono risultati essere tra le 50 malattie più diffuse a livello mondiale, e la quarta causa globale di malattie non mortali nel 2010 ^1. Di conseguenza, l'indagine dei meccanismi molecolari e cellulari alla base diverse patologie della pelle è una zona necessaria e attiva di ricerca. Modelli di roditori sono stati notevolmente utili per la comprensione delle condizioni infiammatorie della pelle come la dermatite atopica ^{2, 3} psoriasi, o infezione da Staphylococcus aureus ^4. Protocolli economici, efficienti e semplici per la digestione enzimatica del tessuto cutaneo mouse può fornire preparazioni di cellule che possono essere utilizzati per una varietà di applicazioni a valle per comprendere meglio la fisiopatologia di malattie della pelle. Qui, un metodo semplice ed economico è descritto per digerito enzimatico di pelle topotessuto e l'isolamento di leucociti infiltranti pelle che può essere utilizzato per la coltura cellulare, in vivo trasferimento adottivo, analisi citofluorimetrica e smistamento o studi di espressione genica. L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare una sospensione singola cella di leucociti-pelle infiltrante con la vitalità delle cellule di alta minimizzando i costi tipicamente associati con kit di reagenti personalizzate e dissociatori meccanici.

Esistenti tessuto cutaneo metodi di dissociazione ^5-7 può provocare vitalità delle cellule e la superficie di integrità basso marcatore, o richiedere i kit di enzimi personalizzate e costose macchine di dissociazione dei tessuti ^8-11. Mentre la digestione del tessuto cutaneo orecchio del mouse è ragionevolmente diffusa ^12-13, digerire il tessuto della pelle altamente cheratinizzato (ad esempio, dal fianco) può risultare in preparazioni di cellule contaminate con grandi quantità di detriti non cellulare. In un recente studio, Zaid e colleghi hanno digerito la pelle del fianco del mouse per 90 minuti a 2,5 mg / ml dispasi, follocon a capo 45 min a 3 mg / ml di collagenasi ^7. In un altro studio, questi ricercatori hanno utilizzato più incubazioni con una digestione combinato di 2,5 ore, compreso l'uso di tripsina / EDTA, collagenasi III, e dispasi ^5. L'uso di tripsina non è raccomandato per la digestione enzimatica della pelle, come il trattamento con tripsina da diversi costruttori ha mostrato di influenzare misurabile l'integrità delle proteine ​​di superficie cellulare su cellule di mammifero ^14-15. Inoltre, dispasi può avere effetti significativi sulla capacità proliferativa delle cellule CD4 e CD8α T e influenzare l'abbondanza superficie di almeno 20 molecole, tra cui comune T marcatori di attivazione delle cellule, quali CD62L ^16. Altri protocolli utilizzano RPMI 1640 nel mezzo di digestione ^6. Tuttavia, la presenza di Mg ^{2+ e} Ca ²⁺ in RPMI può causare aggregazione vasta cella ^17.

Un protocollo ideale per la dissociazione di tessuto dovrebbe puntare per la vitalità delle cellule in alto, bassolivelli di aggregazione delle cellule, e il minimo danno al cellulare proteine ​​di superficie. Alta qualità preparazioni cellulari linfonodo stromali sono stati compiuti con protocolli che utilizzano enzimi incubazione più brevi, Ca ^{2+ e} Mg ²⁺ media liberi, e di evitare tripsina e dispasi ^18. Tuttavia, non sono state stabilite protocolli di questo tipo per la dissociazione di tutta la pelle del mouse.

Qui, un protocollo è descritto a dissociarsi, isolare, e arricchire leucociti-pelle infiltrazione dalla pelle del mouse fianco allergene-sfidati. In breve, la pelle asportata è pre-incubato in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con siero fetale bovino 10% per 1 ora per ammorbidire i tessuti per la digestione e rimuovere il tessuto adiposo della pelle o morti in eccesso. Questa è seguita da una fase 30 min di digestione enzimatica con 0,7 mg / ml di collagenasi D. collagenasi D ha effetti minimi sulla densità di marcatori di superficie cellulare, e nessun effetto sulla proliferazione delle cellule T in vitro ^16,18, rendendoparticolarmente adatto per applicazioni che coinvolgono la caratterizzazione delle proteine ​​di superficie. A seguito di digestione enzimatica, discontinua gradiente di densità centrifugazione è stato utilizzato per rimuovere le cellule epiteliali e detriti dalla cella singola sospensione e arricchire per le cellule ematopoietiche. È importante sottolineare che questo procedimento evita costosi cellulari magnetico reagenti separazione basati su colonne e macchine dissociazione tissutale ^8-11, e può essere eseguita con attrezzature e materiali trovati in un laboratorio di base ricerca biomedica. Ecco questo protocollo è stato utilizzato per isolare leucociti dalla pelle fianco sfidato tre volte con il oxazolone aptene (bue) in precedenza sensibilizzati topi ND4 svizzeri (adattato da 19). Le cellule sono state analizzate utilizzando citometria a flusso multiparametrica. Questa tecnica ha prodotto una sospensione cellulare con detriti minima e> 95% vitalità dei linfociti isolati che sono state analizzate mediante flusso multi-parametrica citometria a misurare l'infiltrazione di linfociti T e neutrofili nella sk interessatoin.