Isolement de leucocytes infiltrant de la peau de souris Utilisation de digestion enzymatique et séparation par gradient

Affections de la peau allant de la dermatite de contact, l'eczéma, le psoriasis, la cellulite, les infections fongiques et les abcès à des cancers de la peau non-mélanome ont été trouvés à être parmi les 50 maladies les plus répandues dans le monde, et la quatrième cause mondiale des maladies non mortelles en 2010 ^1. En conséquence, l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents pathologies cutanées diverses est une zone nécessaire et actif de la recherche. Des modèles de rongeurs ont été remarquablement utiles pour la compréhension des maladies inflammatoires de la peau telles que la dermatite atopique ^{2, 3} psoriasis, l'infection ou ⁴ Staphylococcus aureus. Protocoles peu coûteux, efficaces et simples pour la digestion enzymatique de tissu de la peau de la souris peuvent fournir des préparations de cellules qui peuvent être utilisés pour une variété d'applications en aval afin de mieux comprendre la physiopathologie de maladies de la peau. Ici, une méthode simple et économique est décrit par digestion enzymatique de la peau de souriset l'isolement des tissus cutanés leucocytes infiltrants qui peut être utilisé pour la culture cellulaire, le transfert adoptif in vivo, une analyse par cytométrie de flux et triage ou des études d'expression génique. L'objectif global de cette procédure est de préparer une suspension cellulaire unique de leucocytes infiltrant la peau avec la viabilité cellulaire élevée tout en minimisant les coûts généralement associés à des kits de réactifs personnalisé et dissociateurs mécaniques.

Existants tissu cutané méthodes de dissociation ^5-7 peuvent donner lieu à l'intégrité du marqueur bas de la viabilité des cellules et de la surface, ou exiger des kits d'enzymes de mesure et des machines coûteuses de dissociation des tissus ^8-11. Alors que la digestion des tissus de la peau de l'oreille de la souris est raisonnablement répandue ^12-13, digérant tissu très kératinisée de la peau (par exemple, sur le flanc) peut entraîner des préparations de cellules contaminées avec de grandes quantités de débris non-cellulaire. Dans une étude récente, Zaid et collègues digérés peau du flanc de la souris pendant 90 min dans 2,5 mg / ml dispase, Follomené par 45 min dans 3 mg / ml de collagénase ^7. Dans une autre étude, ces chercheurs ont utilisé plusieurs incubations avec une digestion totale de 2,5 h, y compris l'utilisation de trypsine / EDTA, la collagénase III, la dispase et ^5. L'utilisation de la trypsine est déconseillé pour la digestion enzymatique de la peau, comme a été montré traitement à la trypsine provenant de différents fabricants pour affecter de manière mesurable l'intégrité des protéines de surface cellulaire sur des cellules de mammifère ^14-15. En outre, la dispase peut avoir des effets importants sur la capacité de prolifération des cellules CD4 et CD8a T et affecter l'abondance de surface d'au moins 20 molécules, y compris les marqueurs d'activation des cellules T commun tels que CD62L ^16. D'autres protocoles utilisent RPMI 1640 dans le milieu de digestion ^6. Cependant, la présence de ^Mg2 + et ^Ca2 + dans du RPMI peut provoquer une agrégation de cellules ¹⁷ étendue.

Un protocole idéal pour la dissociation des tissus devrait viser pour la viabilité cellulaire élevée, faibleniveaux d'agrégation cellulaire, et un minimum de dommages à la cellule des protéines de surface. Préparations de cellules ganglionnaires du stroma de haute qualité ont été réalisés avec des protocoles qui utilisent plus courtes incubations enzymatiques, ^Ca 2+ et Mg ²⁺ médias libres, et d'éviter la trypsine et dispase ^18. Cependant, les protocoles de ce type ont pas été établies pour la dissociation de la peau entière de la souris.

Ici, un protocole est décrit à dissocier, isoler, et d'enrichir les leucocytes infiltrant la peau de la peau du flanc de la souris allergène en cause. Brièvement, peau excisée est pré-incubées dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec du sérum fœtal bovin de 10% pendant 1 heure pour adoucir le tissu pour la digestion et éliminer tout excès de tissus morts peau ou gras. Ceci est suivi par une étape de digestion enzymatique de 30 min avec 0,7 mg / ml de collagénase D. collagénase D a des effets minimaux sur la densité de marqueurs de surface cellulaire, et aucun effet sur ​​la prolifération des cellules T in vitro ^16,18, ce qui rendtrès convenable pour des applications impliquant la caractérisation des protéines de surface. Après digestion enzymatique, discontinue centrifugation en gradient de densité a été utilisé pour éliminer les cellules epitheliales et les débris de la suspension à cellule unique et un enrichissement en cellules hématopoïétiques. Surtout, cette procédure évite des coûteuses cellulaires magnétique réactifs de séparation à base de colonnes et machines de dissociation des tissus ^8-11, et peut être réalisé avec l'équipement et de matériaux trouvés dans un laboratoire de recherche biomédicale fondamentale. Ici, ce protocole a été utilisé pour isoler les leucocytes à partir de la peau du flanc contestées trois fois avec de l'oxazolone haptène (Ox) chez des souris suisses précédemment sensibilisées ND4 (adapté à partir de 19). Les cellules ont été analysées en utilisant la cytométrie en flux multi-paramétrique. Cette technique a donné une suspension de cellules avec un minimum de débris et> 95% de viabilité des lymphocytes isolés qui ont été analysés par écoulement multi-paramétrique cytométrie de mesurer l'infiltration de lymphocytes T et des neutrophiles dans le sk affectéedans.