酵素消化および勾配分離を使用したマウス皮膚から浸潤白血球の単離

皮膚接触性皮膚炎、湿疹、乾癬、蜂巣炎、真菌感染症および膿瘍からの非黒色腫皮膚癌が世界50最も一般的な疾患の一つであることが判明した範囲の条件、および2010年¹における非致死的疾患の第四世界的なリーディング原因。したがって、多様な皮膚の病変の基礎となる分子・細胞メカニズムの研究は、研究の必要と活性領域です。げっ歯類モデルは、アトピー性皮膚炎^2、乾癬^3、または黄色ブドウ球菌感染 ⁴のような炎症性皮膚状態の理解に非常に有用でした。マウスの皮膚組織の酵素消化のための、安価で効率的、かつ簡単なプロトコルは、優れた皮膚疾患の病態生理を理解するために、下流の様々な用途に使用することができる細胞の調製物を提供することができます。ここでは、簡単かつ経済的な方法は、マウスの皮膚の酵素消化のために記載されています組織および細胞培養、in vivoでの養子移入のために使用することができる皮膚浸潤白血球の単離は、サイトメトリー分析および選別または遺伝子発現研究を流します。この手順の全体的な目的は、典型的には、カスタムの試薬キットや機械的解離剤に関連するコストを最小限に抑えながら、高い細胞生存率で皮膚浸潤白血球の単一細胞懸濁液を調製することです。

既存の皮膚組織解離方法^5-7は、低細胞生存率および表面マーカーの完全性をもたらす、またはカスタム酵素キットや高価な組織解離機^{8-11が必要な場合があります。}マウス耳皮膚組織の消化は、合理的に^、12-13流行高度角化皮膚組織を消化し ​​ている間（例えば、サイドから）非細胞破片の大量の汚染された細胞調製物をもたらすことができます。最近の研究では、ザイドらは、2.5 mg / mlのディスパーゼ、follo 90分間マウスの脇腹の皮膚を消化しました3 mg / mlのコラゲナーゼ⁷で45分までに結婚。別の研究では、これらの研究者は、トリプシン/ EDTA、コラゲナーゼIIIの使用を含む、2.5時間の組み合わせ消化で複数のインキュベーションを使用し^、5をディスパーゼ。異なる製造業者からのトリプシン処理は、測定可能な哺乳動物細胞の^14-15上の細胞表面タンパク質の完全性に影響を与えることが示されているようにトリプシンの使用は、皮膚の酵素消化には ​​推奨されません。さらに、ディスパーゼは、CD4およびCD8αT細胞の増殖能力に有意な効果を有しており、例えば、CD62L ¹⁶などの一般的なT細胞活性化マーカーを含む少なくとも20の分子の表面の存在量に影響を与えることができます。他のプロトコルは、消化媒体^6に RPMI 1640を使用しています。しかし、RPMI中のMg ²⁺およびCa ²⁺の存在は、大規模な細胞凝集^{17を引き起こす可能性があります} 。

組織解離のための理想的なプロトコルは、低、高細胞生存率を目指す必要があります細胞凝集、および細胞表面タンパク質への最小限の損傷のレベル。高品質のリンパ節間質細胞調製物は、短い酵素インキュベーション、 ^の Ca 2+およびMg ²⁺を含まない培地を使用するプロトコルを用いて達成し、トリプシンを回避し^、18をディスパーゼされています。しかし、このタイプのプロトコルは、全マウス皮膚の解離のために確立されていません。

ここでは、プロトコルは、解離分離、およびアレルゲンチャレンジマウスの脇腹の皮膚から皮膚浸潤白血球を豊かにするために記載されています。簡単に説明すると、切除された皮膚は、消化のために、組織を柔らかくし、余分な死んだ皮膚または脂肪組織を除去するために、1時間、10％ウシ胎児血清を含むハンクス平衡塩溶液（HBSS）中でプレインキュベートします。これは、0.7ミリグラムで30分間酵素消化工程が続く/ mLのコラゲナーゼD.コラゲナーゼDはそれを作る、細胞表面マーカーの密度、 およびインビトロ^16,18 における T細胞の増殖に影響を与えずに最小限の効果を有します表面タンパク質の特徴付けを含む用途に非常に適しています。酵素消化の後、不連続密度勾配遠心分離は、単一細胞懸濁液からの上皮細胞及び破片を除去し、造血細胞を富化するために使用しました。重要なことには、この手順は、高価なカラムベースの磁気細胞分離試薬および組織解離機^{8-11を回避し} 、かつ基本的な生物医学研究室で見つけ機材を用いて行うことができます。ここでは、このプロトコルは、脇腹皮膚から白血球を分離するために使用された（19から適応）以前に増感ND4のスイスマウスにハプテンオキサゾロン（OX）で3回挑戦しました。細胞を、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いて分析しました。この技術は、最小限の破片と、影響を受けたSKにTリンパ球および好中球の浸潤を測定するために、マルチパラメトリックフローサイトメトリーによって分析された、単離されたリンパ球の> 95％の生存率と細胞懸濁液が得られましたに。