عزل التسلل الكريات البيض من ماوس الجلد عن طريق الأنزيمية دايجست والفصل التدرج
Summary
This protocol describes enzymatic digestion of mouse skin in nutrient-rich medium followed by gradient separation to isolate leukocytes. Cells thus derived can be used for diverse downstream applications. This is an effective, economical, and improved alternative to tissue dissociation machines and harsher trypsin and dispase-based tissue digestion protocols.
Abstract
Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune cells in rodent models of skin inflammation. Here, we describe a protocol for the digestion of mouse skin in a nutrient-rich solution with collagenase D, followed by separation of hematopoietic cells using a discontinuous density gradient. Cells thus obtained can be used for in vitro studies, in vivo transfer, and other downstream cellular and molecular analyses including flow cytometry. This protocol is an effective and economical alternative to expensive mechanical dissociators, specialized separation columns, and harsher trypsin- and dispase-based digestion methods, which may compromise cellular viability or density of surface proteins relevant for phenotypic characterization or cellular function. As shown here in our representative data, this protocol produced highly viable cells, contained specific immune cell subsets, and had no effect on integrity of common surface marker proteins used in flow cytometric analysis.
Introduction
تم العثور على الأمراض الجلدية التي تتراوح بين التهاب الجلد التماسي، والأكزيما، الصدفية، التهاب النسيج الخلوي، والالتهابات الفطرية وخراجات لسرطانات الجلد غير القتامي لتكون من بين 50 الأمراض الأكثر انتشارا في جميع أنحاء العالم، ورابع السبب الرئيسي العالمي للأمراض غير المميتة في عام 2010 1. وفقا لذلك، والتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء أمراض الجلد المختلفة هي منطقة الضرورية ونشطة للبحث. وكانت نماذج القوارض مفيدة بشكل ملحوظ في فهم الأمراض الجلدية الالتهابية مثل التهاب الجلد التأتبي 2، 3 الصدفية، أو عدوى المكورات العنقودية الذهبية (4). يمكن البروتوكولات غير مكلفة وفعالة وبسيطة لعملية الهضم الأنزيمي من أنسجة الجلد الماوس توفر الاستعدادات من الخلايا التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب من أجل فهم أفضل الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الجلد. هنا، يتم وصف طريقة بسيطة واقتصادية لالأنزيمية ملخص من الجلد الماوسالأنسجة وعزل الجلد الكريات البيض التسلل التي يمكن استخدامها لزراعة الخلايا، في الجسم الحي نقل بالتبني، وتدفق تحليل cytometric والفرز أو دراسات التعبير الجيني. الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد تعليق خلية واحدة من الكريات البيض-التسلل الجلد مع بقاء الخلية عالية مع تقليل التكاليف المرتبطة عادة مع مجموعات كاشف العرف وdissociators الميكانيكية.
أنسجة الجلد طرق تفكك القائمة 5-7 قد يؤدي إلى انخفاض بقاء الخلية وسلامة سطح علامة، أو تتطلب مجموعات انزيم العرف ومكلفة آلات تفكك النسيج 11/08. في حين أن هضم أذن الفأر أنسجة الجلد منتشر بشكل معقول 12-13، وهضم أنسجة الجلد الكيراتينية للغاية (على سبيل المثال من الجهة) يمكن أن يؤدي إلى الاستعدادات الخلية الملوثة مع كميات كبيرة من الحطام غير الخلوية. في دراسة حديثة، يهضم زيد وزملاؤه الماوس الجناح البشرة لمدة 90 دقيقة في 2.5 ملغ / مل dispase، FOLLOتزوجا قبل 45 دقيقة في 3 ملغ / مل كولاجيناز 7. في دراسة أخرى، استخدم هؤلاء الباحثون حضانات متعددة مع الهضم مجتمعة من 2.5 ساعة، بما في ذلك استخدام التربسين / EDTA، كولاجيناز الثالث، وdispase 5. لا ينصح استخدام التربسين لالأنزيمية الهضم الجلد، كما أظهرت المعاملة مع التربسين من مختلف الصانعين لتؤثر بشكل ملموس على سلامة بروتينات سطح الخلية في خلايا الثدييات 14-15. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون dispase آثار كبيرة على قدرات التكاثري خلايا CD4 وCD8α T وتؤثر على وفرة سطح لا يقل عن 20 الجزيئات، بما في ذلك T مشترك علامات تنشيط الخلايا مثل CD62L 16. بروتوكولات أخرى تستخدم RPMI 1640 في المتوسط 6 الهضم. ومع ذلك، فإن وجود من المغنيسيوم والكالسيوم 2+ 2+ في RPMI يمكن أن يسبب الخلايا واسعة التجميع 17.
وينبغي أن يهدف بروتوكول مثالية للتفكك الأنسجة لبقاء الخلية عالية، وانخفاضمستويات تجميع الخلية، والحد الأدنى من الضرر إلى الخلية البروتينات السطحية. وقد تم إنجاز جودة عالية التحضيرات خلية العقدة الليمفاوية انسجة مع البروتوكولات التي تستخدم حضانات انزيم أقصر، الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+ سائل الإعلام الحرة، وتجنب التربسين وdispase 18. ومع ذلك، لم تثبت البروتوكولات من هذا النوع لتفكك الجلد الماوس كله.
هنا، يتم وصف بروتوكول لفصل وعزل، وإثراء الكريات البيضاء-التسلل الجلد من تحدى حساسية الماوس الجناح الجلد. لفترة وجيزة، وحضنت قبل رفعه الجلد في محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) مع 10٪ مصل بقري جنيني لمدة 1 ساعة لتليين الأنسجة لعملية الهضم وإزالة أي جلد أو الدهنية الميتة الأنسجة الزائدة. وأعقب ذلك 30 دقيقة خطوة الأنزيمية الهضم مع 0.7 ملغ / مل كولاجيناز D. كولاجيناز D ديه الحد الأدنى من الآثار على كثافة علامات سطح الخلية، وليس له تأثير على T تكاثر الخلايا في المختبر 16،18، مما يجعلهامناسبة جدا للتطبيقات التي تنطوي على توصيف البروتينات السطحية. بعد الهضم الأنزيمي، وكان يستخدم متقطع التدرج الكثافة الطرد المركزي لإزالة الخلايا الظهارية والحطام من تعليق وحيد الخلية وإثراء لالخلايا المكونة للدم. الأهم من ذلك، هذا الإجراء يتجنب الخلايا المغناطيسية الكواشف الفصل القائم على عمود مكلفة وآلات تفكك النسيج 11/8، ويمكن أن يؤديها مع المعدات والمواد الموجودة في مختبر البحوث الطبية الحيوية الأساسية. هنا تم استخدام هذا البروتوكول لعزل الكريات البيض من الجلد الجناح تحدى ثلاث مرات مع oxazolone ناشبة (الثور) في المتحسسة سابقا الفئران ND4 السويسري (مقتبس من 19). وقد تم تحليل الخلايا باستخدام متعددة حدودي التدفق الخلوي. هذه التقنية أسفرت تعليق خلية مع الحد الأدنى من الحطام و> 95٪ قابلية الخلايا الليمفاوية المعزولة التي تم تحليلها من قبل التدفق متعدد حدودي الخلوي لقياس تسلل الخلايا الليمفاوية T والعدلات في كورونا المتضررينفي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تميز التغيرات في الكريات البيضاء والجلد المقيمين في نماذج القوارض من الأمراض الجلدية مثل الاكزيما أو الصدفية المهم لفهم الاتصالات الآلية بين تدفق الخلايا الالتهابية وعلم الأمراض. نحن هنا وصف تقنية اقتصادية لعزل الكريات البيض من أنسجة الجلد مع المعدات الأساسية الم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المعاهد الوطنية للصحة (NIH R15 NS067536-01A1 لDC)، والرابطة الوطنية التهاب الأعضاء الأنثوية (الجائزة لDC)، وماك ألستر كلية دعمت هذا العمل. تلقى CB زمالة من برنامج بيكمان علماء ماك ألستر كلية، بتمويل من مؤسسة أرنولد ومابيل بيكمان. معتمدة BTF وTM التي كتبها JDRF 2-2011-662. نشكر الدكتور جيسون شنكل والدكتور جوليانا لويس للحصول على المشورة التقنية، وجميع الأعضاء الحاليين والسابقين في المختبر Chatterjea لما قدموه من مساعدة والدعم.
Materials
| HBSS with phenol red, without calcium, without magnesium, liquid | Sigma Aldrich | 55021C | Keep sterile until day of usage. |
| HEPES, ≥99.5% (titration) | Sigma Aldrich | H3375 | |
| EDTA disodium salt solution | Sigma Aldrich | E7889 | Keep sterile until day of usage. |
| Fetal Bovine Serum, USDA, Heat Inactivated, Premium Select | MidSci | S01520HI | Keep sterile until day of usage. |
| Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C) | Sigma Aldrich | P1644 | Keep sterile. Percoll needs to be made isotonic with sterile 10X PBS prior to use. |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | Use the larger trimmer for shaving the flank and back. |
| 4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one | Sigma Aldrich | E0753-10G | Dissolve in 100% EtOH at 50°C for 15 minutes on a rotating plate. |
| Purified anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2) | Tonbo Biosciences | 70-0161 | Antibody used to block non-specific antibody binding during antibody staining for flow cytometry |
| anti-CD3e-BV650 (145-2C11) | Becton Dickinson | 564378 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5) | eBioscience | 47-0042-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD8a-BV785 (53-6.7) | BioLegend | 100749 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11b-eFluor450 (M1/70) | eBioscience | 48-0112-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD11c-eFluor450 (N418) | eBioscience | 48-0114-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD44-BV711 (IM7) | Becton Dickinson | 563971 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45-FITC (30-F11) | Tonbo Biosciences | 35-0451-U025 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2) | eBioscience | 48-0452-80 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14) | BioLegend | 104431 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5) | BioLegend | 108407 | Antibody used to stain cells for flow cytometry |
| Ghost Dye-BV510 | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Viability dye for flow cytometry |
| LSR Fortessa | Becton Dickinson | N/A | Cell analyzer (18 parameters) |
| Collagenase D from Clostridium histolyticum | Roche Applied Science | 11088858001 | Aliquot lyophilized enzyme at 5 mg/mL in HBSS with phenol red, without calcium, and without magnesium into 1 mL aliquots. Store immediately at -20°C for up to six months. |
| ND4 Swiss female mice | Harlan | 0-32 | 8-12 weeks old; conventionally housed with free access to food and water and used according to Macalester College's IACUC guidelines. |
References
- Hay, R. J., et al. The Global Burden of Skin Disease in 2010: An Analysis of the Prevalence and Impact of Skin Conditions. J. Invest. Dermatol. 134 (6), 1-8 (2013).
- Honda, T., Egawa, G., Grabbe, S., Kabashima, K. Update of immune events in the murine contact hypersensitivity model: toward the understanding of allergic contact dermatitis. J. Invest. Dermatol. 133 (2), 303-315 (2013).
- Gudjonsson, J. E., Johnston, A., Dyson, M., Valdimarsson, H., Elder, J. T. Mouse models of psoriasis. J. Invest. Dermatol. 127 (6), 1292-1308 (2007).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Braughton, K. R., DeLeo, F. R. Mouse Models of Innate Immunity. Mouse Models of Innate Immunity: Methods and Protocols. 1031, 109-116 (2013).
- Mackay, L. K., et al. Cutting Edge: CD69 Interference with Sphingosine-1-Phosphate Receptor Function Regulates Peripheral T Cell Retention. J. Immun. 194, 2059-2063 (2015).
- Schaerli, P., et al. A skin-selective homing mechanism for human immune surveillance T cells. J. Exp. Med. 199 (9), 1265-1275 (2004).
- Zaid, A., et al. Persistence of skin-resident memory T cells within an epidermal niche. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (14), 5307-5312 (2014).
- Harris, J. E., Harris, T. H., Weninger, W., Wherry, E. J., Hunter, C. A., Turka, L. A. A mouse model of vitiligo with focused epidermal depigmentation requires IFN-Γ for autoreactive CD8+ T cell accumulation in the skin. J. Invest. Dermatol. 132 (7), 1869-1876 (2012).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator. J. Vis. Exp. (22), e1029 (2008).
- Nagao, K., et al. Murine epidermal Langerhans cells and langerin-expressing dermal dendritic cells are unrelated and exhibit distinct functions. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 3312-3317 (2009).
- Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267 (2009).
- Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).
- Hershko, A. Y., et al. Mast Cell Interleukin-2 Production Contributes to Suppression of Chronic Allergic Dermatitis. Immunity. 35 (4), 562-571 (2011).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17 (36), (2010).
- Tabatabaei, M., et al. Isolation and partial characterization of human amniotic epithelial cells: The effect of trypsin. Avicenna J Med. Biotechnol. 6 (1), 10-20 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Gu, D., Fan, Q., Xie, J. Cell population analyses during skin carcinogenesis. J. Vis. Exp. (78), e50311 (2013).
- Broggi, M. A. S., Schmaler, M., Lagarde, N., Rossi, S. W. Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells. J. Vis. Exp. (90), e51803 (2014).
- Martinov, T., et al. Contact hypersensitivity to oxazolone provokes vulvar mechanical hyperalgesia in mice. PloS one. 8 (10), e78673 (2013).
- Katsares, V., et al. A Rapid and Accurate Method for the Stem Cell Viability Evaluation: The Case of the Thawed Umbilical Cord Blood. Lab. Med. 40 (9), 557-560 (2009).
- Thomas, M. L., Lefrançois, L. Differential expression of the leucocyte-common antigen family. Immunol. Today. 9 (10), 320-326 (1988).
- Daley, J. M., Thomay, A. A., Connolly, M. D., Reichner, J. S., Albina, J. E. Use of Ly6G-specific monoclonal antibody to deplete neutrophils in mice. J. Leukoc. Biol. 83 (1), 64-70 (2008).
