Выделение Лейкоциты проникают из кожи мыши, используя ферментативные дайджест и Gradient Разделение

Кожные начиная от контактного дерматита, экземы, псориаз, целлюлит, грибковых инфекций и абсцессов к раку кожи немеланомных оказались среди 50 самых распространенных заболеваний во всем мире, и четвертый ведущий мировой причиной несмертельных болезней в 2010 году ^1. Соответственно, исследование молекулярных и клеточных механизмов, лежащих в основе различных патологий кожи является необходимым и активной областью исследований. Моделях грызунов были чрезвычайно полезны в понимании воспалительных заболеваний кожи, таких как атопический дерматит, псориаз ^{2 3, или} золотистого стафилококка инфекции ^4. Недорогие и эффективные, простые и протоколы для ферментативного переваривания ткани кожи мыши может предоставить препараты клеток, которые могут быть использованы для различных последующих применений, чтобы лучше понять патофизиологию заболеваний кожи. Здесь, простым и экономичным описан способ ферментативного гидролизата кожу мышиткани и выделение кожи лейкоцитов, что проникающих могут быть использованы для культивирования клеток, в естественных приемных передачи, анализа проточной цитометрии и сортировки или исследования экспрессии генов. Общая цель этой процедуры заключается в подготовке единой клеточной суспензии кожи инфильтрирующие лейкоцитов с высокой жизнеспособностью клеток при минимальных затратах, как правило, связанные с наборами реагентов на заказ и механических dissociators.

Существующие методы кожной ткани диссоциации ^5-7 может привести к низкой жизнеспособности клеток и поверхностных маркеров целостности, или требовать пользовательские наборы ферментов и дорогие ткани диссоциации машины ^8-11. В то время как переваривание мыши уха ткани кожи является достаточно распространенным ^12-13, переваривая очень ороговевшей ткани кожи (например, с фланга) может привести к подготовке клеток зараженных с большим количеством неклеточным мусора. В недавнем исследовании, Заид и его коллеги усваивается мыши фланговый кожу в течение 90 мин в 2,5 мг / мл диспаза, Folloво главе с 45 мин в 3 мг / мл коллагеназы ^7. В другом исследовании, эти исследователи использовали несколько инкубации с комбинированным переваривания 2,5 ч, в том числе использование трипсина / EDTA, коллагеназы III и диспаза ^5. Применение трипсина не рекомендуется для ферментативного расщепления кожи, а лечение с помощью трипсина от разных производителей, как было показано заметно влияет на целостность белков клеточной поверхности на клетках млекопитающих ^14-15. Кроме того, диспаза может иметь значительное влияние на пролиферативные способностей CD4 и CD8α Т-клеток и влияет на поверхности изобилие, по крайней мере 20 молекул, в том числе маркеров общего Т активации клеток, таких как CD62L ^16. Другие протоколы используют RPMI 1640 в среде пищеварения ^6. Тем не менее, наличие ^Mg 2+ и ^Ca 2+ в среде RPMI может вызвать агрегацию клеток обширные ^17.

Идеальный протокол для ткани диссоциации должны стремиться к высокой жизнеспособности клеток, низкаяУровни агрегации клеток и минимальным повреждением клеточной поверхности белки. Высокое качество подготовки лимфатических узлов стромальных клеток были выполнены с протоколами, которые используют короткие инкубации фермента, Ca ^{2+ и} Mg ²⁺ свободные средства массовой информации, и избежать трипсина и диспазу ^18. Тем не менее, протоколы этого типа не были созданы для диссоциации всей кожи мыши.

Вот протокол описан отделить, изолировать и обогатить кожу проникают лейкоциты-от аллергена оспаривается мыши фланга кожи. Вкратце, вырезали кожу предварительно инкубировали в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS) с 10% фетальной бычьей сыворотки в течение 1 часа, чтобы смягчить ткань для пищеварения и удаления избытка кожи или мертвую жировую ткань. Это сопровождается 30 мин ферментативного расщепления шага с 0,7 мг / мл коллагеназы Д. коллагеназы D имеет минимальное воздействие на плотность маркеров клеточной поверхности и не оказывает влияния на пролиферацию Т-клеток в пробирке ^16,18, что делает егохорошо подходит для применений, связанных с характеристику поверхностных белков. После ферментативного расщепления, разрывная центрифугирования в градиенте плотности используют для удаления эпителиальных клеток и мусора от одного суспензии клеток и обогащения кроветворных клеток. Важно отметить, что эта процедура позволяет избежать дорогих колонок на основе реагентов разделения магнитного клеток и тканей диссоциации машины ^8-11, и может быть выполнена с оборудованием и материалов, находящихся в основной биомедицинской исследовательской лаборатории. Вот этот протокол был использован для выделения лейкоцитов с фланга кожи оспариваемые три раза гаптена оксазолона (Ox) в ранее сенсибилизированных ND4 швейцарских мышей (взято из 19). Клетки анализировали с помощью многопараметрического проточной цитометрии. Эта методика дала клеточной суспензии с минимальной мусора и> 95% жизнеспособности изолированных лимфоцитов, которые были проанализированы с помощью многопараметрического проточной цитометрии для измерения инфильтрацию Т-лимфоцитов и нейтрофилов в пострадавших SKв.