Isolation der infiltrierenden Leukozyten aus Mäusehaut unter Verwendung enzymatischer Digest und Gradiententrennung

Hauterkrankungen, die von Kontaktdermatitis, Ekzem, Schuppenflechte, Zellulitis, Pilzinfektionen und Abszesse, um Nicht-Melanom-Hautkrebs wurden gefunden, um unter den 50 häufigsten Krankheiten weltweit zu sein, und die vierte weltweit führende Ursache für nicht-tödlichen Krankheiten im Jahr 2010 ^1. Dementsprechend ist die Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen vielfältige Hautpathologien ist ein notwendiger und aktives Forschungsgebiet. Nagetiermodellen haben im Verständnis von entzündlichen Hautzuständen bemerkenswert nützlich gewesen wie atopische Dermatitis ^2, Psoriasis ^{3 oder} Staphylococcus aureus Infektion ^4. Kostengünstige, effiziente und einfache Protokolle für die enzymatische Verdauung von Maushautgewebe kann Zubereitungen von Zellen, die für eine Vielzahl von Downstream-Anwendungen verwendet werden kann, um die Pathophysiologie von Haut Krankheiten besser zu verstehen. Hier ist ein einfaches und wirtschaftliches Verfahren zur enzymatischen Spaltung von Mäusehaut beschriebenGewebe und die Isolierung von Haut infiltrierenden Leukozyten, die für die Zellkultur, in vivo adoptiven Transfer genutzt werden können, durchflusszytometrische Analyse und Sortierung oder Genexpressionsstudien. Das übergeordnete Ziel dieser Vorgehensweise ist, um eine Einzelzellsuspension aus haut infiltrieren Leukozyten mit hoher Zelllebensfähigkeit vorzubereiten, während die Kosten in der Regel mit eigenen Reagenzien-Kits und mechanische dissociators assoziiert zu minimieren.

Bestehende Hautgewebe Dissoziation Verfahren ^5-7 können in geringen Zelllebensfähigkeit und Oberflächenmarker Integrität führen oder erfordern kundenspezifische Enzym-Kits und teuer Gewebedissoziation Maschinen ^8-11. Während der Verdauung der Mausohr Hautgewebe ist recht verbreitet ^12-13, Verdauen stark verhornte Hautgewebe (zB von der Flanke) in Zellpräparaten mit großen Mengen an nicht-Zelltrümmer kontaminiert führen. In einer aktuellen Studie, Zaid und Kollegen verdaut Maus Flankenhaut für 90 Minuten in 2,5 mg / ml Dispase, Follovon 45 min in 3 mg / ml Kollagenase ⁷ vermählen. In einer anderen Studie verwendet diese Forscher mehreren Inkubationen mit einem kombinierten Aufschluss von 2,5 Stunden, einschließlich der Verwendung von Trypsin / EDTA, Collagenase III und Dispase ^5. Die Verwendung von Trypsin ist nicht für die enzymatische Verdauung Haut empfohlen, da die Behandlung mit Trypsin von verschiedenen Herstellern wurde gezeigt, meßbar beeinflussen die Integrität von Zelloberflächenproteinen auf Säugetierzellen ^14-15. Zusätzlich kann Dispase signifikante Wirkungen auf proliferative Fähigkeit der CD4 T-Zellen und CD8a auswirken und Oberflächenfluss von wenigstens 20 Molekülen, einschließlich der gemeinsamen T-Zellaktivierung Marker wie CD62L ^16. Andere Protokolle verwenden RPMI 1640 bei der Verdauung ^Medium 6. Jedoch kann die Anwesenheit von Mg ^{2+ und} Ca ^{2+ in} RPMI verursachen umfangreiche Zellaggregation ^17.

Ein ideales Protokoll für Gewebedissoziation sollte für Hochzelllebensfähigkeit, geringe zielenEbenen der Zellaggregation und minimale Beschädigung Oberflächenproteine ​​zu Zelle. Hochwertige Lymphknoten Stromazellen Vorbereitungen mit Protokollen, die kürzer Enzyminkubationen, Ca ^{2+ und Mg 2+} freien Medien zu verwenden erreicht worden, und Trypsin zu vermeiden und Dispase ^18. Jedoch haben Protokolle dieser Art nicht für die Dissoziation von ganzen Mäusehaut nachgewiesen.

Hier wird ein Protokoll beschrieben zu distanzieren, zu isolieren und zu bereichern haut infiltrieren Leukozyten aus allergenfochten Maus Flanke Haut. Kurz gesagt, herausgeschnitten Haut in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit 10% fötalem Rinderserum für 1 Stunde vorinkubiert, um das Gewebe für die Verdauung zu erweichen und zu entfernen überschüssiges tote Haut oder Fettgewebe. Dies wird durch eine 30 min enzymatischen Aufschlußschritt mit 0,7 mg gefolgt / ml Kollagenase D. Kollagenase D hat minimale Auswirkungen auf Dichte der Zelloberflächenmarker und keine Wirkung auf die T-Zellproliferation in vitro ^16,18, so dass essehr gut geeignet für Anwendungen, die die Charakterisierung von Oberflächenproteinen. Folgende enzymatische Verdauung wurde diskontinuierlichen Dichtegradientenzentrifugation zum Epithelzellen und Schmutz von der Einzelzellsuspension zu entfernen und anzureichern hämatopoetischen Zellen. Wichtiger ist, vermeidet dieses Verfahren teuer spaltenbasierten Magnetzellseparation Reagenzien und Gewebedissoziation Maschinen ^8-11 und können mit Geräten und Materialien in einem basischen biomedizinischen Forschungslabors gefunden geführt werden. Hier wurde dieses Protokoll verwendet, um Leukozyten aus Flankenhaut dreimal herausgefordert mit dem Hapten Oxazolon (Ox) bei bereits sensibilisierten ND4 Swiss Mäuse (ab 19 angepasst) zu isolieren. Zellen wurden unter Verwendung von Mehrparameter Durchflusszytometrie analysiert. Diese Technik ergab eine Zellsuspension mit minimalem Rückstand und> 95% Lebensfähigkeit der isolierten Lymphozyten, die von Mehrparameter Flow-Zytometrie analysiert wurden, um die Infiltration von T-Lymphozyten und Neutrophilen in die betroffene sk messenim.