Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el<em> Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis</em> Patosistema

Debido a su naturaleza sésiles, las plantas están constantemente amenazados por una gran cantidad de patógenos que presentan diferentes estilos de vida y estrategias nutricionales ^1. En una primera aproximación, los patógenos biotróficos mantienen su huésped vivo para recuperar los nutrientes, mientras que los agentes patógenos necrotróficos toxinas activamente secretas y enzimas para matar tejido del huésped y se alimentan de las células muertas de la ^1. Otro grupo de agentes patógenos, hemibiotrophs denominados, comienza su curso con la etapa de la infección biotrófico y los cambios a la etapa necrotrófico al alcanzar un cierto umbral de acumulación patógeno ^2. Con el fin de defender eficazmente contra estos microorganismos, las plantas han desarrollado un sistema inmune innato complicada equipado con múltiples mecanismos de vigilancia para detectar el ataque de patógenos y desencadenar la muerte celular localizada ^{3, así como} resistencia sistémica adquirida (SAR) ⁴ programado. La investigación actual se centra en la caracterización de la sig esencialcomponentes naling y cruzadas conversaciones dentro del sistema inmunológico planta ^5.

Tal como se propone en el modelo de "Zig-Zag" ^5, la primera capa de la respuesta inmune innata planta requiere la presencia de la membrana plasmática-localizada Patrón receptores de reconocimiento (PRRS) para detectar la invasión de un microbio. Derechos y responsabilidades parentales son capaces de reconocer patrones Microbio asociada Moleculares (mAmps) y establecer Inmunidad-Triggered MAMP (MTI) ^6. Además de inducir una regulación positiva de la transcripción de genes que codifican proteínas PR antimicrobianos ^7, MTI conduce a una variedad de eventos que la detención del crecimiento de patógenos, incluyendo la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y reactivas de nitrógeno Especies (RNS), deposición de callose a la pared celular así como la activación de la señalización de vías múltiples quinasa ^8.

Hasta ahora, varios MAMPs se han identificado para desencadenar MTI en Arabidopsis, incluyendo flg22 bacteriana ⁹ </sup> (Un fragmento de ácido 22 amino derivado de flagelina), elf18 ¹⁰ (18 aminoácidos del factor de elongación de la traducción bacteriana Tu) y un componente estructural de la pared celular peptidoglicanos ^11. Para establecer una infección exitosa, algunos patógenos especializados han desarrollado la capacidad de las proteínas efectoras secretas virulencia en los espacios intercelulares o intracelulares, y en consecuencia reprimir MTI y desencadenar Susceptibilidad-Triggered efectoras (ETS) ^12,13. Por ejemplo, efectores de virulencia pueden inactivar proteína activada por mitógeno cascadas de quinasas (MAPK) fosforilación de MTI para inducir el desarrollo de la enfermedad dentro del tejido infectado ^{14-16 de.} Durante la co-evolución dinámica entre los ejércitos y agentes patógenos, las plantas también desarrollaron la estrategia de contraataque para reconocer las proteínas efectoras y atenuar la virulencia de patógenos moléculas ^17. Este reconocimiento directo o indirecto efector está mediada por resistencia a enfermedades (R) ¹⁸ proteínas. La mayoría de tdobladillo son miembros de NB-LRR (nucleótidos vinculante y ricos en leucina repite) la familia ^19. La percepción de un efector no virulenta por una proteína R provoca una respuesta más fuerte y más amplia inmunológico caracterizado como Inmunidad Accionado efector (ETI) ^20. Además de inducir la expresión de genes de defensa ²¹ y la producción de metabolitos de defensa ^22, ETI menudo conduce a una localizada muerte celular programada conocida como hipersensible rápida respuesta (HR) para restringir el patógeno se propague en el tejido adyacente ^3.

Además de la muerte celular programada localizada ^23, las plantas son capaces de iniciar un largo plazo y la respuesta inmune en todo el sistema denominado Systemic Acquired Resistencia (SAR) ^4. Tras la estimulación con un patógeno biotrófico, las células vegetales desencadenan la biosíntesis y acumulación de un ácido fitohormona endógena salicílico (SA) y proteínas PR en ambos tejidos locales y sistémicos ^24. A través de tsu proceso, se logra un mayor estado de preparación en las hojas infectadas que permite para el montaje de las respuestas de defensa más rápidos durante una infección posterior por un amplio espectro de patógenos ^24. SA y sus análogos sintéticos como el benzo (1,2,3), 7-carbotioico tiadiazol éster del ácido S metil (BTH) y ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA) son capaces de inducir químicamente ácido salicílico (SA) Inmunidad -Accionados (ITS) tras la aplicación ^externa de 24. Nonexpressor de los genes relacionados con la patogénesis (1 NPR1) se propone para ser uno de los receptores SA y funciona como un importante regulador transcripcional durante la respuesta de defensa mediada por SA en ambos tejidos locales y sistémicos ^21,25,26. Se ha demostrado de manera concluyente que NPR1 se requiere para el establecimiento SAR y la pérdida de NPR1 conduce a la susceptibilidad dramática hacia Pseudomonas syringae ^25.

Para caracterizar ampliamente la contribución molecular de plantascomponentes en las interacciones planta-patógeno, múltiples bioensayos se han desarrollado para medir acontecimientos de defensa específicos, incluyendo ROS estalló ^27, deposición callose ^28, genes de defensa expresión y acumulación de sus productos proteicos ^21. Si bien estos ensayos individuales pueden proporcionar información en una forma específica de la respuesta inmune de la planta, ninguno de ellos, sin embargo, son capaces de representar la respuesta de defensa completa sobre todo el nivel de la planta. Por el contrario, la cuantificación del crecimiento de patógenos después de la infección proporciona una estimación global de la respuesta inmune a nivel del organismo. Por lo tanto, el desarrollo y optimización de un ensayo de inoculación de patógenos preciso y altamente estandarizado es crítico para alimentar la investigación y descubrimientos en las respuestas inmunes de Arabidopsis.

Pseudomonas syringae, una bacteria Gram-negativa, se identificó como un fitopatógeno capaz de causar enfermedad en una gama de huéspedes vegetales incluyendo Arabidopses ^29. A medida que el sistema de la planta de patógenos modelo, la Arabidopsis – P. interacción syringae se ha aplicado ampliamente para comprender los mecanismos moleculares respuestas de defensa de las plantas subyacentes ^29. Hasta ahora, más de 50 P. patovares syringae se han identificado basándose en su capacidad para infectar diferentes especies de plantas ³⁰ . P. syringae pv. DC3000 tomate (Pst DC3000) ³¹ y P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) ³² son las dos cepas virulentas más usados ​​y ampliamente caracterizados. Aparte de ser reconocido por la planta y la activación de la respuesta de MTI, Pst DC3000 y PSM ES4326 son capaces de secretar proteínas efectoras virulentas para suprimir MTI y desencadenar ETS para favorecer el ^31,33 crecimiento de patógenos.

Para diseccionar funcionalmente la interacción entre Arabidopsis y P. syringae, múltiple0; métodos de infección de patógenos se han desarrollado sobre la base del enfoque de prestación de patógenos. Para las plantas de suelos cultivados, patógeno puede ser entregado por la infiltración de la jeringa, la infiltración de vacío, la inoculación por inmersión y la inoculación aerosol ^29,34. Recientemente, ensayo de inundación de la inoculación de las plántulas fue desarrollado para realizar pantallas de gran escala en el cultivo de tejidos placas cultivadas plantas de Arabidopsis jóvenes ^35. Infiltración Jeringa, como uno de los método más comúnmente utilizado, entrega manualmente el patógeno en el apoplasto través de las aberturas de las hojas naturales estomas ²⁹ llamados. A través de este enfoque, la misma cantidad de P. syringae se puede infiltrar en la hoja infectada y la fuerza de la respuesta inmune planta está inversamente correlacionada con los niveles de crecimiento de patógenos. Por lo tanto, la cuantificación del crecimiento de patógenos sirve como un enfoque óptimo para evaluar la función inmune a nivel de planta entera. Además, la infiltración de la jeringa puede distinguir el tejido local y sistémica, que puede be aplicable en la caracterización de los mecanismos moleculares que subyacen a SAR ^36.

En el siguiente protocolo, se describe un ensayo de infiltración jeringa optimizado con PSM ES4326 para detectar mutantes de Arabidopsis para una mayor susceptibilidad a la enfermedad (EDS). Este protocolo empleará dos genotipos de Arabidopsis: una de tipo salvaje ecotipo Columbia-0 (Col-0) plantas (de control) y npr1-1 mutantes de pérdida de función (hipersusceptibles) que se infectaron con la cepa bacteriana virulenta PSM ES4326 ^37. El mutante npr1-1 lleva una mutación puntual dentro de la secuencia de consenso-ankyrin repetida de la molécula NPR1, que altera la histidina altamente conservada en tirosina y hace que la proteína no funcional ^25. Además, una serie de modificaciones del ensayo de infiltración de la jeringa se describen que permiten la cuantificación de defectos en las capas específicas de la respuesta inmune, incluyendo MTI y STI.