Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em> Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em> Pathosystem

Door hun sessile aard zijn installaties voortdurend bedreigd door een overvloed aan ziekteverwekkers vertonen verschillende leefstijlen en voedingswaarde strategieën ^1. Om een eerste benadering, biotrofe ziekteverwekkers behouden hun gastheer in leven om voedingsstoffen te halen, terwijl necrotrofe ziekteverwekkers actief geheim toxines en enzymen aan gastheerweefsel doden en voeden zich met de dode cellen ^1. Een andere groep van ziekteverwekkers, genaamd hemibiotrophs begint hun infectie uiteraard met biotrofe podium en verschuift naar de necrotrofe podium op een bepaalde drempel van pathogeen accumulatie ² bereiken. Om zich te verdedigen tegen deze micro-organismen, planten hebben een ingewikkelde aangeboren immuunsysteem uitgerust met meerdere toezichtmechanismen het pathogeen aanval detecteren en trigger ontwikkeld gelokaliseerde geprogrammeerde celdood ³ en systemische verworven resistentie (SAR) ^4. Lopend onderzoek is gericht op het karakteriseren van de essentiële signaling componenten en cross-gesprekken binnen de plant immuunsysteem ^5.

Zoals in de "Zig-Zag" model ⁵ voorgesteld, de eerste laag van de plant aangeboren immuunrespons vereist de aanwezigheid van plasma-gelokaliseerde receptoren Pattern Recognition (PRRS) om de invasie van microben te detecteren. PRRS kunnen Microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMPs) erkennen en vast MAMP-Triggered Immunity (MTI) ^6. Naast het induceren van een transcriptionele opregulatie van genen die coderen voor antimicrobiële PR proteïnen ^7, MTI leidt tot een verscheidenheid van gebeurtenissen die de groei van pathogenen, waaronder de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en Reactive stikstofspecies (RNS), afzetting van callose aan de celwand arrestatie alsook de activering van meerdere kinase signaalwegen ^8.

Tot nu toe zijn verscheidene MAMPs geïdentificeerd aan MTI veroorzaken bij Arabidopsis, waaronder bacteriële flg22 ⁹ </sup> (Een 22 aminozuur fragment afgeleid van flagelline), elf18 ¹⁰ (18 aminozuren van de bacteriële vertaling elongatiefactor Tu) en een structureel celwandcomponent Peptidoglycanen ^11. Om een succesvolle infectie vast te stellen, hebben een aantal gespecialiseerde pathogenen de mogelijkheid om geheime virulentie effector eiwitten geëvolueerd in de intracellulaire en intercellulaire ruimten, en dus MTI onderdrukken en trigger Effector-Triggered Susceptibility (ETS) ^12,13. Zo kan virulentie effectoren mitogeen-geactiveerde proteïne kinase (MAPK) fosforylatie cascades van MTI inactiveren om de ziekteontwikkeling bij het ​​geïnfecteerd weefsel ^14-16 induceren. Tijdens de dynamische co-evolutie tussen gastheren en pathogenen, planten ontwikkelde ook de tegenaanval strategie om de effector-eiwitten herkennen en verzwakken de ziekteverwekker virulentie moleculen ^17. Deze directe of indirecte effector erkenning wordt gemedieerd door ziekteresistentie (R) ¹⁸ eiwitten. De meeste tboord zijn lid van de NB-LRR (Nucleotide Binding en leucine-rijke herhalingen) gezin ^19. De perceptie van een avirulent effector door een R-eiwit lokt een sterkere en bredere immuunrespons gekenmerkt als Effector-Triggered Immunity (ETI) ^20. Naast het induceren van de expressie van verdedigingsgenen ²¹ en de productie van metabolieten verdediging ^22, ETI leidt vaak tot een snelle gelokaliseerde geprogrammeerde celdood genoemd overgevoeligheidsreactie (HR) het pathogeen mag niet in het aangrenzende weefsel ³ te beperken.

Naast de gelokaliseerde geprogrammeerde celdood ²³ planten zijn in staat tot het initiëren van een langdurige en systeembrede immuunreactie genoemd Systemic Acquired Resistance (SAR) ^4. Bij provocatie met biotrofe pathogeen, plantencellen leiden tot de biosynthese en de accumulatie van een endogeen plantenhormoon salicylzuur (SA) en PR proteïnen in zowel lokale en systemische weefsels ^24. DezZijn werkwijze wordt een verhoogde staat van paraatheid bereikt de geïnfecteerde bladeren die het mogelijk maakt de montage sneller verdedigingsresponsen bij een volgende infectie door een breed spectrum van pathogenen ^24. SA en zijn synthetische analogen zoals benzo- (1,2,3) -thiadiazol-7-carbothiozuur S methyl ester (BTH) en 2,6-dichloroisonicotinic acid (INA) kunnen chemisch induceren salicylzuur (SA) -Triggered Immunity (STI) op externe applicatie ^24. Nonexpressor van pathogenese verwante genen 1 (NPR1) wordt voorgesteld als een van de SA receptoren en werkt als een belangrijke transcriptionele regulator during SA-gemedieerde verdediging respons in zowel lokale als systemische weefsels ^21,25,26 zijn. Er is overtuigend aangetoond dat NPR1 nodig voor SAR inrichting en het verlies van NPR1 leidt tot dramatische gevoeligheid richting Pseudomonas syringae ^25.

Om op grote schaal te karakteriseren van de moleculaire bijdrage van plantaardigecomponenten in de plant-pathogeen interacties, zijn meerdere bioassays ontwikkeld om specifieke afweer gebeurtenissen te meten, met inbegrip van ROS barsten ^27, callose afzetting ^28, defensie genen expressie en accumulatie van hun eiwitproducten ^21. Hoewel deze individuele testen inzicht kunnen geven in een specifieke vorm van de plant immuunrespons, geen ervan zijn echter in staat de volledige afweerreactie op het hele plant niveau te vertegenwoordigen. Omgekeerd kwantificering van pathogene groei na infectie geeft een algemene inschatting van de immuunrespons op het organismale niveau. Daarom is de ontwikkeling en optimalisatie van een nauwkeurige en zeer gestandaardiseerde pathogeen inoculatie test is kritisch voor tanken onderzoek en ontdekkingen op het Arabidopsis immuunreacties.

Pseudomonas syringae, een Gram-negatieve bacterie, werd geïdentificeerd als fytopathogenen kunnen veroorzaken ziekte bij een reeks van plantaardige gastheren Arabidops²⁹ is. Als modelplant-pathogeen-systeem, de Arabidopsis – P. syringae interactie is op grote schaal toegepast om de moleculaire mechanismen te begrijpen onderliggende verdediging van planten reacties ^29. Tot nu toe meer dan 50 P. syringae pathovars zijn geïdentificeerd op basis van hun vermogen om verschillende plantensoorten ³⁰ infecteren . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst ^DC3000) 31 en P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) ³² zijn de twee meest gebruikte en uitgebreid gekarakteriseerd virulente stammen. Afgezien van wordt erkend door de plant en triggeren de MTI reactie, Pst DC3000 en Psm ES4326 kunnen uitscheiden virulente effector eiwitten aan MTI onderdrukken en leiden ETS aan de pathogeen groei ^31,33 bevorderen.

Functioneel ontleden de interactie tussen Arabidopsis en P. syringae, multiple0; pathogeeninfectie werkwijzen zijn ontwikkeld op basis van het pathogeen levering aanpak. Voor-grond geteelde planten, kan pathogeen worden geleverd met een spuit infiltratie, vacuüm infiltratie, dip inenting en spuit inenting ^29,34. Onlangs werd seedling vloed inoculatie assay ontwikkeld voor grootschalige schermen voeren op weefselkweekplaten volwassen jonge Arabidopsis planten ^35. Spuit infiltratie, als een van de meest gebruikte aanpak levert handmatig organisme in de apoplast via natuurlijke openingen blad genoemd huidmondjes ^29. Door deze benadering gelijke hoeveelheden P. syringae kunnen worden geïnfiltreerd in de geïnfecteerde blad en de kracht van planten immuunrespons is omgekeerd gecorreleerd met de pathogeen groei levels. Daarom kwantificering van pathogeen groei dient als een optimale aanpak van het immuunsysteem te evalueren op het hele plant niveau. Bovendien kunnen spuit infiltratie lokale en systemische weefsels te onderscheiden, die be in het karakteriseren van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen SAR ³⁶ van toepassing.

In de volgende protocol beschrijven we een geoptimaliseerde spuit infiltratie test met Psm ES4326 tot Arabidopsis mutanten voor verbeterde ziektegevoeligheid (EDS) te screenen. Dit protocol zal twee Arabidopsis genotypen in dienst: een wild-type ecotype Columbia-0 (Col-0) planten (controle) en npr1-1 verlies-van-functie mutanten (hypersusceptible) dat zal worden geïnfecteerd met virulente bacteriële stam Psm ES4326 ^37. De npr1-1 mutant draagt ​​een puntmutatie in de ankyrine-repeat consensussequentie van NPR1 molecuul, dat de sterk geconserveerde histidine tot tyrosine verandert en maakt het eiwit niet-functioneel ^25. Daarnaast is een aantal modificaties van de injectiespuit infiltratie assay beschreven die kwantificering van defecten in specifieke lagen van de immuunrespons, zoals MTI en STI toestaan.