Бактериальный лист инфильтрация Анализ на тонкой Характеристика защитных реакций растений с помощью<em> Резуховидка Таля-Pseudomonas syringae</em> Pathosystem

Из-за их природы сидячие, растения постоянно угрожает множество возбудителей, обладающих различные образ жизни и пищевые стратегии ^1. В первом приближении биотрофных патогены поддерживать своего хозяина живым, чтобы получить питательные вещества, в то время как некротрофным патогенов активно тайные токсины и ферменты, чтобы убить ткани хозяина и питаются мертвыми клетками ^1. Другая группа возбудителей, называемых hemibiotrophs, начинается их заражения курс с биотрофных этапе и сдвигов в некротрофным этапе при достижении определенного порога накоплению возбудителя ^2. Для того чтобы эффективно защитить себя от этих микроорганизмов, растений развились сложный врожденной иммунной системы оснащена несколькими механизмами наблюдения для обнаружения атаки патогена и вызвать локализованного запрограммирован гибель клеток ^{3, а также} системной приобретенной устойчивости (SAR) ^4. Текущее исследование сосредоточено на характеризующий существенную сиговыхnaling компоненты и кросс-переговоры в растительной иммунной системы. ⁵

Как предлагается в "зигзагообразный" ^модели 5, первый слой растительного врожденного иммунного ответа требуется наличие плазматической мембраны локализованные распознавание образов рецепторы (РРСС) для обнаружения вторжения микроба. PRRs способны распознавать Микроб-Ассошиэйтед молекулярные модели (MAMPs) и установить MAMP запускаемые иммунитет (MTI) ^6. Кроме того, вызывая транскрипции активацию генов, кодирующих антимикробные PR белки ^7, MTI приводит к различным событиям, что арест рост патогенных микроорганизмов, в том числе производства реактивных форм кислорода (ROS), и химически активного азота видам (RNS), осаждения каллозы к клеточной стенке а также активацию киназы множественных сигналов дорожками ^8.

До сих пор, несколько MAMPs не были определены для запуска MTI в Arabidopsis, в том числе бактериальной flg22 ⁹ </sup> (Фрагмент 22 аминокислоты получены из флагеллином), elf18 ¹⁰ (18 аминокислот из бактериального фактора элонгации трансляции ТУ) и структурного компонента клеточной стенки Пептидогликаны ^11. Для создать успешный инфекции, некоторые специализированные патогены развили способность к секретным белков вирулентности эффекторных в внутриклеточные или межклеточных пространствах, и, следовательно, подавлять MTI и вызвать Эффектор запускаемые восприимчивости (ETS) ^12,13. Например, вирулентности эффекторы могут инактивировать митогеном активируемой протеинкиназы (МАРК) фосфорилирования каскады MTI, чтобы вызвать развитие заболевания в инфицированной ткани ^14-16. Во время динамического коэволюции между хостами и патогенов, растения также разработали стратегию ответных признать эффекторные белки и ослабления вирулентности патогена молекул ^17. Это прямое или косвенное признание эффектор опосредуется болезнеустойчивости (R) белков ^18. Большинство тподол являются членами NB-LRR (нуклеотидов Переплет и лейцин-богатый повторов) семьи ^19. Восприятие авирулентный эффектора с помощью R белка вызывает более сильное и широкое иммунный ответ характеризуется как эффектор-Срабатывает иммунитет (ETI) ^20. Кроме индукции экспрессии генов ²¹ оборонных и производство оборонной метаболитов ^22, ВЦ часто приводит к быстрому локализованной запрограммированной гибели клеток, известной как реакции гиперчувствительности (HR), чтобы ограничить распространение возбудителя из в соседнюю ткань ^3.

В дополнение к локализованным запрограммированной клеточной смерти ²³ заводов способны инициировать долгосрочные и общесистемного иммунный ответ называют системной приобретенной устойчивости (SAR) ^4. При стимуляции с биотрофных патогена, клетки растений вызвать биосинтез и накопление эндогенного фитогормонов салициловой кислоты (SA) и PR белков в обеих местных и системных тканях ^24. Через тего процесс, состояние повышенной готовности достигается в неинфицированных листьях, что позволяет для монтажа быстрее ответов обороны во время последующей инфекции широкого спектра возбудителей ^24. С. и его синтетические аналоги, такие как бензо- (1,2,3) тиадиазол-7-тиокарбоновой кислоты метиловый эфир уксусной кислоты S (BTH) и 2,6-дихлоризоникотиновая кислоты (INA) способны индуцировать химически салициловой кислоты (СК) -Triggered Иммунитет (ИППП) по внешним приложением ^24. Nonexpressor патогенеза-родственные гены (1) NPR1 предлагается один из рецепторов SA и функций в качестве основного регулятора транскрипции во SA-опосредованной реакции обороны в местных и системных тканях ^21,25,26. Было убедительно показано, что NPR1 требуется для создания SAR и потеря NPR1 приводит к драматическим восприимчивости по отношению к Pseudomonas syringae ^25.

Для широко характеризуют молекулярный вклад заводакомпоненты растительных патогенов взаимодействий, несколько биопробы были разработаны для измерения конкретных оборонных мероприятий, в том числе АФК взрыв ²⁷ каллозы осаждения ^28, выражение генов обороны и накопление их белковых продуктов ^21. В то время как эти отдельные тесты могут дать представление конкретной форме растительной иммунного ответа, ни один из них, однако, не в состоянии представлять полный ответ обороны на уровне всего предприятия. Наоборот, количественная оценка роста патогенных микроорганизмов после заражения дает общую оценку иммунного ответа на организменном уровне. Таким образом, разработка и оптимизация точной и высоко стандартизированной возбудитель прививки анализе важно, чтобы питать до исследования и открытия на иммунных ответов Arabidopsis.

Pseudomonas syringae, грамотрицательная бактерия, был идентифицирован как фитопатогенов, способных вызвать заболевание в диапазоне растений-хозяев, включая Arabidops^{составляет} 29. В качестве модели растений патогена системы, Arabidopsis – P. syringae взаимодействие широко применяется, чтобы понять молекулярные механизмы лежащие в основе растительных обороны ответов ^29. До сих пор, более 50 П. syringae pathovars были определены на основе их способности инфицировать различные виды растений ³⁰ . П. syringae ру. помидор DC3000 (PST DC3000) ^{31 и} П. syringae ру. maculicola ES4326 (PSM ES4326) ³² являются двумя наиболее широко используемых и широко отличающиеся вирулентные штаммы. Помимо того, что признается завода и запуск ответ MTI, Pst DC3000 и Psm ES4326 способны секретировать вирулентных эффекторных белков, чтобы подавить MTI и вызвать ETS в пользу роста ^31,33 патоген.

Функционально анализировать взаимодействие между Arabidopsis и P. syringae, несколько0; патогенных методы инфекции были разработаны на основании подхода доставки патоген. Для почвенных выращенных растений, возбудитель может быть доставлен с помощью шприца инфильтрации, вакуумной инфильтрацией, погруженной прививки и прививки распыления ^29,34. Недавно рассады наводнения прививка был разработан анализ для выполнения крупномасштабных экраны на планшеты для тканевых культур, выращенных молодых растений Arabidopsis ^35. Шприц инфильтрация, в качестве одного из наиболее часто используемых подходом, вручную подает возбудителя в апопласт через естественный листьев отверстий, называемых устьиц ^29. Благодаря такому подходу, равные количества P. syringae может быть проникли зараженного листа и сила растений иммунного ответа обратно пропорциональна уровней роста патогена. Таким образом, количественная оценка роста патогенных микроорганизмов служит в качестве оптимального подхода для оценки иммунной функции у уровне целого растени. Кроме того, шприц инфильтрации можно выделить местных и системных ткани, которые могут бе применяется для характеристики молекулярных механизмов, лежащих в основе ³⁶ SAR.

В следующем протоколе мы опишем оптимизированный шприц инфильтрации анализа с PSM ES4326 на экран Arabidopsis мутантов для повышения восприимчивости болезни (EDS). Этот протокол будет использовать два Arabidopsis генотипов: дикого типа экотип Колумбия-0 (Col-0) растения (контроль) и npr1-1 потери из-мутанты функции (hypersusceptible) что будет заражен вирулентных бактериального штамма PSM ES4326 ^37. Npr1-1 мутант несет точечную мутацию в пределах анкириновых повтора консенсусной последовательности молекулы NPR1, который изменяет высоко законсервированный гистидин в тирозин и оказывает белок нефункциональные ^25. Кроме того, ряд модификаций шприц инфильтрации анализа описаны, что позволяет количественно определить дефекты в конкретных слоев иммунного ответа, в том числе MTI и ИППП.