Batterica Leaf Infiltrazione Assay per Fine Caratterizzazione di risposte di difesa delle piante che utilizzano il<em> Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em> Patosistema

A causa della loro natura, sessili, piante sono costantemente minacciati da una pletora di agenti patogeni che espongono diversi stili di vita e le strategie nutrizionali ^1. In prima approssimazione, gli agenti patogeni biotrofici mantengono il loro ospite vivo per recuperare le sostanze nutritive, mentre agenti patogeni necrotrophic tossine attivamente segreti ed enzimi per uccidere tessuto ospite e nutrono le cellule morte ^1. Un altro gruppo di agenti patogeni, hemibiotrophs chiamati, inizia il loro corso l'infezione con il palco biotrofico e si sposta alla fase necrotrophic al raggiungimento di una certa soglia di accumulo patogeno ^2. Al fine di difendersi efficacemente contro questi microrganismi, piante hanno sviluppato un complesso sistema immunitario innato dotato di molteplici meccanismi di sorveglianza per rilevare l'attacco patogeno e innescare localizzato morte cellulare programmata ^{3 e} sistemica la resistenza acquisita (SAR) ^4. La ricerca attuale è focalizzata sulla caratterizzazione del sig essenzialenaling componenti e incrociati colloqui all'interno del sistema immunitario pianta ^5.

Come proposto nel modello "zigzag" ^5, il primo strato della risposta immunitaria innata pianta richiede la presenza di plasma-membrana localizzata Motivo recettori di riconoscimento (PRR) per rilevare l'invasione di un microbo. PRR sono in grado di riconoscere i modelli Microbe-Associated Molecular (mAmps) e stabilire Immunità MAMP-Triggered (MTI) ^6. Oltre ad indurre una upregulation trascrizionale di geni che codificano le proteine ​​PR antimicrobici ^7, MTI porta ad una serie di eventi che arrestare la crescita dei patogeni, inclusa la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e reattive di azoto specie (RNS), deposizione di callosio a parete cellulare nonché l'attivazione della chinasi di segnalazione molteplici vie ^8.

Fino ad oggi, diversi piani di gestione pluriennali sono stati identificati per innescare MTI in Arabidopsis, compresi flg22 batterica ⁹ </sup> (Un frammento di acido 22 aminoacidi derivato da flagellina), elf18 ¹⁰ (18 aminoacidi dalla batterica fattore di allungamento Tu) e un componente strutturale della parete cellulare peptidoglicani ^11. Per stabilire una infezione di successo, alcuni patogeni specializzate hanno sviluppato la capacità di proteine ​​effettrici virulenza segrete negli spazi intracellulari o intercellulari, e quindi reprimere MTI e innescare suscettibilità Effector-Triggered (ETS) ^12,13. Ad esempio, effettori di virulenza possono inattivare proteine ​​Mitogen-chinasi attivata (MAPK) fosforilazione cascate di MTI per indurre lo sviluppo della malattia entro il tessuto infetto ^14-16. Durante la co-evoluzione dinamica tra host e patogeni, piante anche sviluppato la strategia di contrattacco di riconoscere le proteine ​​effettrici e attenuare la virulenza patogeno molecole ^17. Questo riconoscimento diretto o indiretto effettrici è mediata dalla resistenza alle malattie (R) ¹⁸ proteine. La maggior parte di torlo sono membri di NB-LRR (Nucleotide Binding e leucina-ricchi ripetizioni) della famiglia ^19. La percezione di un effettore avirulent da una proteina R provoca una risposta più forte e più ampia immunitario caratterizzato come Immunità Effector-Triggered (ETI) ^20. Oltre inducendo l'espressione di geni di difesa ²¹ e la produzione di metaboliti difesa ^22, ETI spesso porta ad una rapida morte cellulare programmata localizzata noto come Hypersensitive Response (HR) per limitare il patogeno di diffondersi nel tessuto adiacente ^3.

Oltre alla morte cellulare programmata localizzato ^23, le piante sono in grado di avviare un lungo periodo e risposta immunitaria a livello di sistema denominato Systemic Acquired Resistance (SAR) ^4. Su sfida con un agente patogeno biotrofico, cellule vegetali innescano la biosintesi e l'accumulo di un phytohormone endogena acido salicilico (SA) e delle proteine ​​PR in entrambi i tessuti locali e sistemiche ^24. Attraverso til suo processo, un elevato stato di preparazione si ottiene nelle foglie non infetti che consente il montaggio risposte di difesa veloce durante una successiva infezione da un ampio spettro di agenti patogeni ^24. SA ed i suoi analoghi sintetici come benzo (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioic estere dell'acido S-metil (BTH) e acido 2,6-dichloroisonicotinic (INA) sono in grado di indurre chimicamente acido salicilico (SA) Immunità -Triggered (STI), su richiesta esterna ^24. Nonexpressor di-Patogenesi correlati geni 1 (NPR1) si propone di essere uno dei recettori SA e funziona come un regolatore trascrizionale importante durante risposta di difesa SA-mediata sia nei tessuti locali e sistemiche ^21,25,26. E 'stato definitivamente dimostrato che NPR1 è necessario per istituzione SAR e la perdita di NPR1 conduce alla drammatica suscettibilità verso Pseudomonas syringae ^25.

Per caratterizzare ampiamente il contributo molecolare della piantacomponenti nelle interazioni pianta-patogeno, molteplici test biologici sono stati sviluppati per misurare gli eventi di difesa specifici, tra cui i ROS scoppio ^27, callosio ^di deposizione 28, espressione geni di difesa e l'accumulo dei loro prodotti proteici ^21. Mentre questi dosaggi individuali possono fornire intuizioni in una forma specifica della risposta immunitaria pianta, nessuno di essi, tuttavia, sono in grado di rappresentare la risposta di difesa completa sull'intera livello di impianto. Al contrario, la quantificazione della crescita dei patogeni dopo l'infezione fornisce una stima complessiva della risposta immunitaria a livello di organismi. Pertanto, lo sviluppo e l'ottimizzazione di un preciso e altamente standardizzata saggio patogeno inoculazione è fondamentale per alimentare la ricerca e le scoperte sulle risposte immunitarie Arabidopsis.

Pseudomonas syringae, un batterio Gram-negativi, è stato identificato come un phytopathogen in grado di causare la malattia in una vasta gamma di piante ospiti tra cui Arabidopsè ^29. Poiché il sistema pianta-patogeno modello Arabidopsis – P. interazione syringae è stato ampiamente applicato per comprendere i meccanismi molecolari alla base della pianta risposte di difesa ^29. Finora, oltre 50 P. patovar syringae sono stati identificati in base alla loro capacità di infettare diverse specie vegetali ³⁰ . P. syringae pv. DC3000 pomodoro (Pst DC3000) ³¹ e P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) ³² sono i due ceppi virulenti più utilizzati e ampiamente caratterizzate. Oltre ad essere riconosciuto dalla pianta e innescando la risposta MTI, Pst DC3000 e Psm ES4326 sono in grado di secernere proteine ​​effettrici virulenti per sopprimere MTI e attivare ETS per favorire la crescita del ^31,33 patogeno.

Per sezionare funzionalmente l'interazione tra Arabidopsis e P. syringae, multiplo0; metodi di infezione patogeni sono stati sviluppati sulla base del metodo di consegna patogeno. Per gli impianti di terreno coltivati, agente patogeno può essere trasportata da siringa infiltrazione, infiltrazione di vuoto, tuffo inoculazione e spruzzo inoculazione ^29,34. Recentemente, piantina saggio alluvione-inoculazione è stato sviluppato per eseguire grandi schermi su colture di tessuti piastre-grown giovani piante di Arabidopsis ^35. Siringa infiltrazione, come una delle soluzione più utilizzata, garantisce manualmente patogeno nel nell'apoplasto attraverso le aperture dell'anta naturale chiamati stomi ^29. Attraverso questo approccio, gli importi uguali di P. syringae può essere infiltrato nella foglia infetta e la forza della risposta immunitaria pianta è inversamente correlato ai livelli di crescita dei patogeni. Pertanto, la quantificazione della crescita dei patogeni serve come un approccio ottimale per valutare la funzione immunitaria a livello di tutta la pianta. Inoltre, siringa infiltrazione può distinguere il tessuto locale e sistemica, che può be applicabile nel caratterizzare i meccanismi molecolari alla base SAR ^36.

Nel seguente protocollo, si descrive una siringa infiltrazione dosaggio ottimizzato con PSM ES4326 per lo screening mutanti di Arabidopsis per una maggiore suscettibilità alle malattie (EDS). Questo protocollo si avvarrà di due genotipi di Arabidopsis: una wild-type ecotipo Columbia-0 (Col-0) piante (controllo) e mutanti npr1-1 perdita di funzione (ipersensibili) che sarà infettato con ceppo batterico virulento Psm ES4326 ^37. Il mutante npr1-1 porta una mutazione puntiforme all'interno della sequenza consenso ankyrin-repeat della molecola NPR1, che altera la istidina altamente conservata in tirosina e rende la proteina non funzionale ^25. Inoltre, una serie di modifiche del dosaggio siringa infiltrazione sono descritte che consentono la quantificazione dei difetti negli strati specifici della risposta immunitaria, compresi MTI e STI.