Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Patossistema

Devido à sua natureza sessile, as plantas são constantemente ameaçados por uma infinidade de agentes patogénicos que apresentam vários estilos de vida e estratégias nutricionais ^1. Para uma primeira aproximação, patógenos biotróficos manter seu hospedeiro vivo para recuperar nutrientes, enquanto patógenos necrotróficos toxinas e enzimas ativamente secretas para matar o tecido hospedeiro e se alimentam de células mortas ^1. Outro grupo de patógenos, denominados hemibiotrophs, começa seu curso de infecção com o estágio biotrófica e mudanças para o palco necrotrophic ao atingir um determinado limiar de acumulação patógeno ^2. A fim de defender-se eficazmente contra esses microorganismos, plantas desenvolveram um sistema imunológico inato complicado equipado com múltiplos mecanismos de vigilância para detectar o ataque de patógenos e desencadear localizada a morte celular programada ^{3, bem como} a resistência adquirida sistémica (SAR) ^4. A pesquisa atual está focada em caracterizando o sig essencialnaling componentes e transversais conversações dentro do sistema imunológico da planta ^5.

Tal como proposto no modelo de "ziguezague" ^5, a primeira camada da resposta imune inata planta requer a presença de plasma-membrana localizada Reconhecimento de Padrões Receptores (SRRS) para detectar a invasão de um micróbio. PRRs são capazes de reconhecer padrões Microbe-Associated Molecular (mAmps) e estabelecer Imunidade MAMP-Provocado (MTI) ^6. Além de induzir uma regulação positiva da transcrição de genes que codificam proteínas PR antimicrobianos ^7, MTI leva a uma variedade de eventos que parar o crescimento de agentes patogénicos, incluindo a produção de espécies de oxigénio reactivos (ROS) e reactiva de azoto Espécie (RNS), deposição de calose à parede celular , bem como a activação de múltiplas vias de sinalização da cinase ^8.

Até agora, vários mAmps foram identificados para desencadear MTI em Arabidopsis, incluindo flg22 bacteriana ⁹ </sup> (Um fragmento de 22 aminoácidos derivado de flagelina), ^{10 (18} elf18 aminoácidos do factor de tradução bacteriana alongamento Tu) e um componente da parede celular estrutural ¹¹ peptidoglicanos. Para estabelecer uma infecção bem sucedida, alguns patógenos especializados têm evoluído a capacidade de proteínas efetoras secretos virulência para os espaços intracelulares ou intercelulares e, consequentemente, reprimir MTI e desencadear Suscetibilidade Effector-Provocado (ETS) ^12,13. Por exemplo, efectores de virulência pode inactivar Mitogen-Activated Protein Kinase cascatas (MAPK) de fosforilação de MTI para induzir o desenvolvimento da doença no tecido infectado ^14-16. Durante a co-evolução dinâmica entre hospedeiros e patógenos, as plantas também desenvolveu a estratégia de contra-ataque para reconhecer as proteínas efetoras e atenuar a virulência de patógenos moléculas ^17. Este reconhecimento direto ou indireto efetora é mediada por proteínas de resistência a doenças (R) ^18. Mais de them são membros do NB-LRR (Nucleotide Binding e leucina-ricos repetições) da família ^19. A percepção de um efetor avirulent por uma proteína R provoca uma resposta imune mais forte e mais amplo caracterizada como Imunidade Effector-Provocado (ETI) ^20. Além de induzir a expressão de genes de defesa ²¹ e a produção de metabolitos de defesa ^22, ETI muitas vezes leva a uma rápida morte celular programada localizada conhecida como resposta hipersensível (HR) para restringir o agente patogénico a partir de espalhamento para o tecido adjacente ^3.

Além da morte celular programada localizada ^23, as plantas são capazes de iniciar um a longo prazo e a resposta imunitária global do sistema denominado a resistência adquirida sistémica (SAR) ^4. Após o desafio com um agente patogénico biotrofica, células vegetais desencadear a biossíntese e acumulação de um ácido salicílico fitohormônio endógena (SA) e proteínas PR em ambos os tecidos locais e sistémicos ^24. Através de tseu processo, um elevado estado de prontidão é alcançado nas folhas não infectados que permite a montagem respostas de defesa mais rápidos durante uma infecção subsequente por um amplo espectro de agentes patogénicos ^24. SA e os seus análogos sintéticos, tais como o benzo (1,2,3) -tiadiazol-7-carbotióico éster do ácido S-metil (BTH) e ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA) são capazes de induzir quimicamente ácido salicílico (AS) Imunidade Triggered (STI) mediante aplicação externa ^24. Nonexpressor de genes relacionados-Patogênese 1 (NPR1) se propõe a ser um dos receptores e funções SA como principal regulador da transcrição durante a resposta de defesa SA-mediada em ambos os tecidos locais e sistêmicos ^21,25,26. Tem sido demonstrado de forma conclusiva que NPR1 é necessária para a criação de SAR e a perda de NPR1 conduz a susceptibilidade dramática no sentido ^{25 de} Pseudomonas syringae.

Para caracterizar a contribuição extensivamente molecular de plantacomponentes nas interacções planta-patógeno, vários bioensaios foram desenvolvidos para medir a eventos específicos de defesa, incluindo a explosão de ROS ^{27, 28} deposição de calose, expressão dos genes de defesa e acumulação de produtos de proteína de ²¹ suas. Embora estes ensaios individuais pode fornecer informações para uma forma específica da resposta imune da planta, nenhum deles, no entanto, são capazes de representar a resposta de defesa completa em toda a nível da planta. Por outro lado, a quantificação do crescimento do patógeno após a infecção fornece uma estimativa global da resposta imunitária ao nível do organismo. Portanto, o desenvolvimento e otimização de um ensaio de inoculação do patógeno preciso e altamente padronizada é fundamental para abastecer-se a pesquisa e descobertas sobre as respostas imunes de Arabidopsis.

Pseudomonas syringae, uma bactéria Gram-negativa, foi identificado como um fitopatógeno capaz de causar doença em uma gama de espécies de plantas, incluindo Arabidops^é 29. Como o modelo do sistema planta-patógeno, a Arabidopsis – P. interação syringae tem sido amplamente aplicada para compreender os mecanismos moleculares subjacentes respostas de defesa da planta ^29. Até agora, mais de 50 P. patovares syringae foram identificadas com base em sua capacidade de infectar diferentes espécies de plantas ³⁰ . P. syringae pv. DC3000 tomate (Pst DC3000) ^{31 e} P. syringae pv. maculicola ES4326 (ES4326 Psm) ³² são as duas estirpes virulentas mais utilizados e extensivamente caracterizados. Além de ser reconhecido pela planta e desencadeamento da resposta MTI, Pst DC3000 e Psm ES4326 são capazes de segregar proteínas efetoras virulentos para suprimir MTI e desencadear ETS para favorecer o crescimento de patógenos ^31,33.

Para dissecar funcionalmente a interação entre Arabidopsis e P. syringae, múltiplos0; infecção patogénica métodos foram desenvolvidos com base na abordagem de entrega de agente patogénico. Para as plantas cultivadas no solo, patógeno pode ser entregue por infiltração seringa, infiltração de vácuo, a inoculação mergulho e inoculação de pulverização ^29,34. Recentemente, ensaio inundação-inoculação de mudas foi desenvolvido para executar telas em grande escala em placas de cultura de tecidos cultivados jovens plantas de Arabidopsis ^35. Seringa de infiltração, como um dos abordagem mais utilizada, proporciona manualmente o agente patogénico para o apoplasto através das aberturas de folhas naturais chamados estomas ^29. Através desta abordagem, quantidades iguais de P. syringae pode ser infiltrada na folha infectada e a força da resposta imune da planta está inversamente correlacionada com os níveis de crescimento do patógeno. Portanto, a quantificação do crescimento do patógeno serve como uma melhor abordagem para avaliar a função imune a todo o nível da planta. Além disso, a seringa pode distinguir a infiltração do tecido local e sistémica, a qual pode be aplicável em caracterizar os mecanismos moleculares subjacentes SAR ^36.

No seguinte protocolo, descrevemos um ensaio infiltração seringa otimizado com Psm ES4326 para rastrear mutantes de Arabidopsis para maior susceptibilidade à doença (EDS). Este protocolo irá empregar dois genótipos de Arabidopsis: a de tipo selvagem ecótipo Columbia-0 (Col-0) plantas (controle) e npr1-1 mutantes de perda de função (hypersusceptible) que será infectada com a cepa bacteriana virulenta Psm ES4326 ^37. O mutante npr1-1 transporta uma mutação pontual no interior da sequência de consenso de anquirina-repetição da molécula NPR1, o que altera a histidina altamente conservado e a tirosina torna a proteína não funcional ^25. Além disso, um certo número de modificações do ensaio de seringa infiltração estão descritos que permitem a quantificação de defeitos nas camadas específicas da resposta imunitária, incluindo MTI e STI.