Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der<em> Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em> Pathosystem

Aufgrund ihrer sessilen Natur werden Pflanzen ständig von einer Vielzahl von Krankheitserregern, die verschiedene Lebensweisen und Ernährungsstrategien ¹ bedroht. In erster Näherung, biotrophen Erreger behalten ihre Gastgeber, am Leben zu Nährstoffen abzurufen, während nekrotrophe Krankheitserreger aktiv geheime Giftstoffe und Enzyme, um Wirtsgewebe töten und ernähren sich von den toten Zellen ^1. Eine weitere Gruppe von Krankheitserregern, bezeichnet hemibiotrophs beginnt ihre Infektion natürlich mit der biotrophen Bühne und verschiebt sich nach nekrotrophe Stufe bei Erreichen einer bestimmten Schwelle von pathogenen Ansammlung ^2. Um sich gegen diese Mikroorganismen wirksam zu verteidigen, haben Pflanzen einen komplizierten angeborenen Immunsystems mit mehreren Überwachungsmechanismen ausgestattet, um den Erreger Angriff zu erkennen und auslösen entwickelt lokalisiert programmierten Zelltod ^{3 sowie} Systemische Akquirierte Resistenz (SAR) ^4. Die aktuelle Forschung auf die Charakterisierung der wesentlichen sig konzentriertnaling Komponenten und Quer Gespräche innerhalb der Anlage Immunsystem ^5.

Wie in der "Zig-Zag" Modell ⁵ vorgeschlagen, die erste Schicht der Anlage angeborenen Immunantwort erfordert die Anwesenheit von Plasmamembran lokalisierte pattern recognition receptors (PRR), um die Invasion einer Mikrobe zu erkennen. PRRs können Microbe-associated molecular patterns (mAmps) zu erkennen und zu etablieren MAMP-Triggered Immunity ^(MTI) 6. Neben Induktion eines Transkriptions-Hochregulierung von Genen antimikrobielle PR-Proteinen ⁷ kodiert, führt MTI auf eine Vielzahl von Ereignissen, die das Wachstum des Pathogens, einschließlich der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktive Stickstoffspezies (RNS), Abscheiden Callose an die Zellwand zu verhaften sowie die Aktivierung von mehreren Kinase Signalwege ^8.

Bis jetzt wurden mehrere MAMPS identifiziert MTI in Arabidopsis auslösen, einschließlich bakterieller flg22 ⁹ </sup> (Ein 22 Aminosäurefragment von Flagellin abgeleitet) elf18 ¹⁰ (18 Aminosäuren aus dem bakteriellen Elongationsfaktor Tu Übersetzung) und einem strukturellen Zellwandkomponente Peptidoglykane ^11. Um eine erfolgreiche Infektion zu etablieren, haben einige spezielle Krankheitserreger die Möglichkeit, geheime Virulenz Effektor-Proteine ​​in die intrazelluläre oder interzellulären Räumen entwickelt und damit zu unter MTI und lösen Effektor-Triggered Anfälligkeit (ETS) ^12,13. Zum Beispiel können die Virulenz Effektoren Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) Phosphorylierungskaskaden MTI zu inaktivieren, um die Entwicklung der Erkrankung in dem infizierten Gewebe ^14-16 induzieren. Während der dynamischen Koevolution zwischen Hosts und Krankheitserreger, Pflanzen entwickelte auch die Gegenstrategie, die Effektor-Proteine ​​erkennen und dämpfen das Pathogen Virulenz Moleküle ^17. Diese direkte oder indirekte Effektor Erkennung durch Krankheitsresistenz (R) ^18-Proteine ​​vermittelt wird. Meiste tSaum sind Mitglieder der NB-LRR (Nukleotid-Bindungs ​​und Leucin-reichen Wiederholungen) Familie ^19. Die Wahrnehmung eines avirulenten Effektorzellen durch ein R-Protein löst eine stärkere und breitere Immunantwort charakterisiert als Effektor-Triggered Immunity (ETI) ^20. Neben der Induktion der Expression von Abwehrgene ^{21 und} die Produktion von Verteidigungsmetaboliten ^22, ETI führt oft zu einer raschen lokalisierten programmierten Zelltod als hypersensible Reaktion (HR) bekannt, die Pathogen-Ausbreitung in das benachbarte Gewebe ³ zu beschränken.

Neben der lokalisierten programmierten Zelltods ^23, sind Pflanzen der Lage, eine langfristige und systemweiten Immunantwort bezeichnet Systemische Akquirierte Resistenz (SAR) ^4. Bei Provokation mit einem biotrophe Erreger, Pflanzenzellen auszulösen, die Biosynthese und Akkumulation eines endogenen Phytohormon Salicylsäure (SA) und PR-Proteinen sowohl in lokalen und systemischen Geweben ^24. Durch tsein Verfahren ein gesteigertes Zustand der Bereitschaft in den nicht-infizierten Blättern, die für die Montage schneller Abwehrreaktionen bei einer nachfolgenden Infektion durch ein breites Spektrum von Erregern ^{24 ermöglicht} erreicht. SA und ihre synthetischen Analoga, wie Benzo (1,2,3) thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methyl ester (BTH) und 2,6-Dichlorisonicotinsäure (INA) in der Lage sind, chemisch zu induzieren Salicylsäure (SA) -Triggered Immunity (STI) bei der externen Anwendung ^24. Nonexpressor der Pathogenese-Assoziierte Gene 1 (NPR1) wird vorgeschlagen, einer der SA-Rezeptoren und wirkt als Haupttranskriptionsregulator während SA-vermittelte Abwehrreaktion sowohl in lokalen und systemischen Geweben ^21,25,26 sein. Es hat sich eindeutig gezeigt, dass NPR1 für SAR Einrichtung erforderlich ist, und der Verlust von NPR1 führt zu dramatischen Anfälligkeit gegenüber Pseudomonas syringae ^25.

Um umfassend charakterisieren die molekularen Beitrag der PflanzenKomponenten in den Pflanzen-Pathogen-Interaktionen, mehrere Biotests wurden entwickelt, um spezifische Abwehr Veranstaltungen zu messen, einschließlich ROS Burst ^27, Kallose-Abscheidung ^28, Verteidigung Gene Expression und Anhäufung von ihrer Proteinprodukte ^21. Während diese Einzeltests können Einblicke in eine spezifische Form der Pflanze Immunantwort bereitzustellen, keiner von ihnen ist jedoch in der Lage sind, das komplette Abwehrreaktion an der gesamten Pflanze Ebene darstellen. Umgekehrt ist die Quantifizierung der Pathogen Wachstum nach der Infektion bietet eine Gesamtschätzung der Immunantwort auf der organismischen Ebene. Daher ist die Entwicklung und Optimierung von einem präzisen und hoch standardisierte Erreger Inokulation Assay kritischen Kraftstoff den Forschungen und Entdeckungen auf den Arabidopsis Immunantworten.

Pseudomonas syringae, ein Gram-negatives Bakterium, wurde als Phytopathogen Lage verursacht Krankheit in einem Bereich von Wirten, einschließlich Pflanzen Arabidops identifiziertenist ^29. Als Modellpflanze-Pathogen-System, das Arabidopsis – P. syringae Interaktion wurde in großem Umfang angewendet, um die molekularen Mechanismen zugrunde liegenden Pflanzenabwehrreaktionen ²⁹ zu verstehen. Bisher über 50 P. syringae Pathovare wurden basierend auf ihrer Fähigkeit, verschiedene Pflanzenarten infizieren ³⁰ identifizierten . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) ^{31 und} P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) ³² sind die beiden am weitesten verbreitete und umfassend charakterisiert virulenten Stämmen. Abgesehen davon, dass durch die Pflanze erkannt und Auslösen des MTI Reaktion Pst DC3000 und PSM ES4326 sind zur Sekretion virulenten Effektorproteine ​​MTI drücken und lösen ETS, das Wachstum des Pathogens ^31,33 begünstigen.

Funktionell sezieren die Interaktion zwischen Arabidopsis und P. syringae, multiple0; Pathogeninfektion Methoden wurden auf der Grundlage des Erregers Liefer Ansatz entwickelt. Für Bodenkultur Pflanzen, können Krankheitserreger mit einer Spritze Infiltration, Vakuuminfiltration, Tauch Inokulation und Sprühinokulation ^29,34 geliefert werden. Vor kurzem wurde Sämling Flut Inokulation Assay entwickelt, um große Bildschirme auf Gewebekulturplatten durchführen wachsenen jungen Arabidopsis-Pflanzen ^35. Syringe Infiltration, als einer der am häufigsten verwendeten Ansatz, manuell liefert die Erreger in den Apoplasten durch die natürlichen Blattöffnungen bezeichnet Spaltöffnungen ^29. Durch diesen Ansatz, gleiche Mengen von P. syringae in die befallenen Blatt infiltriert werden und die Stärke der pflanzlichen Immunantwort ist umgekehrt an die das Wachstum des Pathogens Niveaus korreliert. Daher dient die Quantifizierung der Pathogen Wachstum als eine optimale Vorgehensweise, um die Immunfunktion im gesamten Werksebene zu bewerten. Darüber hinaus können Spritzen Infiltration der lokalen und systemischen Gewebe zu unterscheiden, worin B kanne in der Charakterisierung der molekularen Mechanismen SAR ³⁶ erhoben.

In dem folgenden Protokoll beschreiben wir eine optimierte Spritze Infiltration Assay mit Psm ES4326 um Arabidopsis-Mutanten für erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS) zu screenen. Dieses Protokoll wird zwei Arabidopsis-Genotypen zu beschäftigen: ein Wildtyp-Ökotyp Columbia-0 (Col-0), Pflanzen (Kontrolle) und npr1-1 loss-of-function-Mutanten (hypersusceptible) das wird mit virulenten Bakterienstamm Psm ES4326 ³⁷ infiziert werden. Die npr1-1 Mutante trägt eine Punktmutation in der Ankyrin-Repeat-Consensussequenz des NPR1 Molekül, das die hoch konservierten Histidin zu Tyrosin verändert und macht das Protein nicht-funktionellen ^25. Darüber hinaus ist eine Anzahl von Modifikationen der Spritze Infiltration Assay beschrieben, die die Quantifizierung von Fehlern in den spezifischen Schichten aus Immunantwort, einschließlich MTI und STI ermöglichen.