Bactérienne Feuille Infiltration Essai de caractérisation fine des réponses de défense des plantes à l'aide du<em> Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em> Pathosystème

En raison de leur nature sessiles, les plantes sont constamment menacés par une pléthore d'agents pathogènes présentant différents modes de vie et des stratégies nutritionnelles ^1. En première approximation, les agents pathogènes biotrophes maintiennent leur hôte vivante pour récupérer les nutriments, tandis que les agents pathogènes et les toxines nécrotrophes enzymes activement secrets pour tuer le tissu hôte et se nourrissent sur ​​les cellules mortes ^1. Un autre groupe d'agents pathogènes, hemibiotrophs appelés, commence leur cours de l'infection par le stade biotrophe et les changements à l'étape nécrotrophe après avoir atteint un certain seuil de pathogène accumulation ^2. Afin de se défendre efficacement contre ces micro-organismes, les plantes ont développé un système immunitaire inné compliquée équipé de mécanismes de surveillance multiples pour détecter l'attaque d'agents pathogènes et de déclencher localisée mort cellulaire programmée ³ ainsi que la résistance systémique acquise (SAR) ^4. La recherche actuelle est axée sur la caractérisation de la sig essentielcomposants naling et croisées pourparlers dans le système immunitaire de la plante ^5.

Comme proposé dans le modèle "Zig-Zag" ^5, la première couche de l'usine de la réponse immunitaire innée nécessite la présence de plasma membrane localisée Motif Recognition Receptors (PRR) pour détecter l'invasion d'un microbe. PRR sont capables de reconnaître des modèles Microbe-Associated Molecular (MAMPS) et d'établir l'immunité MAMP-Triggered (MTI) ^6. Outre induire une régulation positive de la transcription des gènes codant pour des protéines PR antimicrobiens ^7, MTI conduit à une variété d'événements qui arrête la croissance des pathogènes, y compris la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et de l'azote réactif espèces (RNS), le dépôt de callose à la paroi cellulaire ainsi que l'activation de la signalisation de la kinase de multiples voies ^8.

Jusqu'à présent, plusieurs MAMPS ont été identifiés pour déclencher MTI chez Arabidopsis, y compris Flg22 bactérienne ⁹ </sup> (Un fragment d'acide 22 aminés dérivée de la flagelline), ^{10 (18} elf18 acides aminés de la traduction bactérienne facteur d'élongation Tu) et une pièce de structure de la paroi cellulaire ¹¹ peptidoglycanes. Pour établir une infection réussie, certains agents pathogènes spécialisés ont évolué la capacité de protéines secrets virulence effectrices dans les espaces intracellulaires ou intercellulaires, et par conséquent réprimer MTI et de déclencher sensibilité effecteur-Triggered (ETS) ^12,13. Par exemple, les effecteurs de virulence peuvent inactiver mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphorylation cascades de MTI pour induire le développement de la maladie dans le tissu infecté ^14-16. Lors de la co-évolution dynamique entre hôtes et pathogènes, les plantes ont également développé la stratégie de contre-attaque de reconnaître les protéines effectrices et atténuer la virulence des agents pathogènes ¹⁷ molécules. Cette reconnaissance directe ou indirecte effecteur est médiée par la résistance aux maladies (R) ¹⁸ protéines. La plupart des tourlet sont membres de NB-LRR (Nucleotide Binding et riche en leucine répétitions) famille ^19. La perception d'un effecteur avirulent par une protéine R provoque une réponse immunitaire plus forte et plus large que l'immunité caractérisé effecteur-Triggered (ETI) ^20. Outre induire l'expression de gènes de défense ^{21 et} la production de métabolites de la défense ^22, ETI conduit souvent à une mort rapide localisée cellulaire programmée connu comme réponse hypersensible (HR) pour restreindre l'agent pathogène de se propager dans le tissu adjacent ^3.

En plus de l'localisé mort cellulaire programmée ^23, les plantes sont capables d'initier une longue durée et la réponse immunitaire systémique appelée résistance systémique acquise (SAR) ^4. Lors de l'épreuve avec un agent pathogène biotrophe, les cellules végétales déclenchent la biosynthèse et l'accumulation d'un acide salicylique de phytohormone endogène (SA) et des protéines PR dans les deux tissus locaux et systémiques ^24. Grâce à tsa démarche, un état ​​de préparation est réalisée dans les feuilles non infectées qui permet de monter des réponses plus rapides de la défense au cours d'une infection ultérieure par un large spectre d'agents pathogènes ^24. SA et ses analogues synthétiques tels que le benzo (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioïque ester de l'acide S-méthyl (BTH) et l'acide 2,6-dichloro-isonicotinique (INA) sont capables d'induire chimiquement l'acide salicylique (SA) Immunité -Triggered (IST) à la demande ^externe 24. Nonexpressor de la pathogenèse-Les gènes associés (1 NPR1) est proposé pour être l'un des récepteurs et des fonctions SA en tant que régulateur transcriptionnel majeur au cours de la réaction de défense SA-médiation dans les deux tissus locaux et systémiques ^21,25,26. Il a été démontré de façon concluante que NPR1 est nécessaire à l'établissement SAR et la perte de NPR1 mène à susceptibilité dramatique vers Pseudomonas syringae ^25.

Pour caractériser largement la contribution moléculaire de l'usinecomposants dans les interactions plante-pathogène, de multiples essais biologiques ont été développés pour mesurer des événements spécifiques de la défense, y compris ROS éclatement ^27, dépôt de callose ^28, l'expression des gènes de défense et l'accumulation de leurs produits protéiques ^21. Bien que ces dosages individuels peuvent fournir des indications sur une forme spécifique de la réponse immunitaire de la plante, aucun d'entre eux, cependant, sont en mesure de représenter la réponse complète de la défense au niveau de la plante entière. A l'inverse, la quantification de l'évolution de l'infection par l'agent pathogène après fournit une estimation globale de la réponse immunitaire au niveau des organismal. Par conséquent, le développement et l'optimisation d'un test pathogène inoculation précis et hautement normalisé est essentiel pour alimenter la recherche et les découvertes sur les réponses immunitaires Arabidopsis.

Pseudomonas syringae, une bactérie à Gram-négatif, a été identifié comme un phytopathogène capable de provoquer une maladie chez une gamme de plantes hôtes y compris Arabidopsest ^29. Comme le système plante-pathogène modèle, Arabidopsis – P. interaction syringae a été largement appliqué à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents réponses végétales défense ^29. Jusqu'à maintenant, plus de 50 P. pathovars syringae ont été identifiés sur la base de leur capacité à infecter ^{les 30} espèces végétales différentes . P. syringae pv. DC3000 de tomate (Pst DC3000) ³¹ et P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) ³² sont les deux souches virulentes plus largement utilisés et largement caractérisés. En plus d'être reconnu par la plante et le déclenchement de la réponse MTI, Pst DC3000 et PSM ES4326 sont capables de sécréter des protéines effectrices virulentes de supprimer MTI et de déclencher ETS de favoriser la croissance de ^31,33 pathogène.

Pour disséquer fonctionnellement l'interaction entre Arabidopsis et P. syringae, multiple0; méthodes d'infection des agents pathogènes ont été développés sur la base de l'approche de prestation des agents pathogènes. Pour les plantes des sols cultivés, agent pathogène peut être délivré par la seringue infiltration, infiltration sous vide, dip inoculation et inoculation par pulvérisation ^29,34. Récemment, des semis dosage inondations inoculation a été développé pour effectuer des écrans de grande envergure sur la culture de tissus plaques cultivés jeunes plants d'Arabidopsis ^35. Seringue infiltration, comme l'un de l'approche la plus couramment utilisée, délivre manuellement l'agent pathogène dans le apoplaste à travers les ouvertures de la feuille naturelle appelés stomates ^29. Grâce à cette approche, des quantités égales de P. syringae peut être infiltré dans la feuille infectée et la force de la réponse immunitaire de la plante est inversement corrélée aux niveaux de croissance des agents pathogènes. Par conséquent, la quantification de la croissance de l'agent pathogène sert une approche optimale pour évaluer la fonction immunitaire au niveau de la plante entière. En outre, une seringue infiltration peut distinguer le tissu local et systémique, qui peut be applicable à caractériser les mécanismes moléculaires sous-jacents SAR ^36.

Dans le protocole suivant, nous décrivons une seringue infiltration dosage optimisé avec Psm ES4326 pour cribler des mutants d'Arabidopsis pour une meilleure sensibilité à la maladie (EDS). Ce protocole consiste à employer deux génotypes d'Arabidopsis: une de type sauvage écotype Columbia-0 (Col-0) plantes (contrôle) et des mutants npr1-1 perte de fonction (hypersensible) qui seront infectés avec la souche bactérienne virulente Psm ES4326 ^37. Le mutant npr1-1 porte une mutation ponctuelle dans la séquence consensus de répétition ankyrine-NPR1 de la molécule, ce qui modifie l'histidine hautement conservé de tyrosine et rend la protéine non fonctionnelle ^25. En outre, un certain nombre de modifications de la seringue de dosage infiltration sont décrits qui permettent la quantification des défauts dans les couches spécifiques de la réponse immunitaire, y compris MTI et IST.